Name: homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

1. INS-1E cellules : entretien et placage
<ol><li>Maintenir les INS-1E cellules dans un incubateur à2 ˚C/5% CO 37 humidifié et cultivées avec milieu RPMI 1640 additionnée de 5 % (v/v) inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 10 mM HEPES, pyruvate de sodium 1 mM, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine solution, 50 µM β-mercaptoéthanol. Culture de cellules en milieu RPMI 1640 complet de 10 mL (par assiette), jusqu'à ce qu’ils atteignent la confluence de 80 à 90 %, quan...

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. 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S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

Le dosage de l’insuline HTRF décrit ici vous propose un système rapid et efficace permettant de mesurer la sécrétion d’insuline d’un système de base de cellules cultivée. Parmi ses avantages les plus importants, ce test offre un signal faible bruit de fond en raison du rapport signal-bruit élevé. En outre, nous avons confirmé que le signal HTRF est stable pendant de longues périodes (> 24h)7. Néanmoins, comme les anticorps monoclonaux de liaison de l’insuline d’atteindre rapid...

La régulation du métabolisme énergétique est affinée par une hormone anabolisante majeure, l’insuline. L’insuline est synthétisée et libérée par les cellules bêta du pancréas en réponse à des niveaux accrus de glucose extracellulaire. L’insuline libérée déclenche l’absorption du glucose par les tissus sensibles à l’insuline1,2. Physiologiquement, cela est lié à l’élévation de la concentration de glucose après un repas, suivi par la sécrétion de l’insuline pour réguler l’absorption du glucose. Troubles de l’homéostasie du glucose conduisent à des déficiences métaboliques qui a abouti à la résistance à l’insuline et, finalement, dans la survenue du diabète de type 2 pour2,3,4.
Bien que la sécrétion d’insuline a été particulièrement étudiée, ses mécanismes réglementaires restent mal compris. Un secteur critique de l’enquête a été l’identification de nouveaux modulateurs de la sécrétion d’insuline par les cellules bêta5,6,7,8. Ces études nécessitent une meilleure compréhension de la relation de couplage entre la stimulation de glucose et de la sécrétion d’insuline. Par conséquent, la capacité de surveiller avec précision et de quantifier les niveaux de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) a été déterminante. A ce jour, cependant, seulement un nombre limité de méthodes était disponible pour permettre la quantification du GSIS utilisant des lignées de cellules sécrétrices d’insuline et/ou d’îlots pancréatiques. L’un est dosage radio-immunologique (RIA), qui utilise des anticorps et l’insuline radio-isotope-tag. Les principales limites de cette approche incluent des questions de sécurité en raison de la manipulation et l’élimination des matières radioactives. En outre, cette méthode est beaucoup de travail, impliquant plusieurs lavage long et les étapes d’incubation. Immuno enzymatique (ELISA) est une autre approche de coûteuse et fastidieuse qui utilise des anticorps pour la détection de l’insuline. Variation dans l’affinité de l’anticorps et l’efficacité de la reconnaissance de l’insuline sont des facteurs de cette méthode limitant et peuvent influer sur la reproductibilité des résultats. ELISA ni RIA a été conçu pour des expériences de haut débit. AlphaScreen est un dosage homogène utilisé pour détecter et mesurer les taux de sécrétion d’insuline. AlphaScreen technologie est basée sur la transformation de l’oxygène ambiant en un état singulet excité d’oxygène qui peut réagir avec des espèces de chimiluminescence, ayant pour résultat la génération de chimiluminescence. Parce que le dosage est homogène, d'entre les étapes de lavage associées à la RIA et ELISA sont éliminés. Cependant, l’instabilité du signal dû à la nature de la réaction est un facteur limitant qui peut-être affecter la lecture du test. () TR-pince, mis au point par9Heyduk et ses collègues, est une autre approche homogène à la mesure de l’insuline basée sur la liaison des deux anticorps distincts aux épitopes différents sur la molécule d’insuline. Les anticorps sont chaque ADN bicaténaire chimiquement lié à double avec court porte-à-faux complémentaires de l’ADN échoués unique. Liaison des anticorps à l’insuline les réunit et conduit à un double brin DNA bicaténaire. Chaque anticorps est également associé à un fluorophore donneur ou accepteur respectif, et l’association de la DNA bicaténaire regroupe ces fluorophores pour générer le transfert d’énergie de résonance Förster (FRET). Une des limites possibles de TR-TENAILLE, cependant, repose avec la frette lui-même. L’incapacité à dissiper rapidement la fluorescence de fond au cours de la réaction de la frette peut conduire à des niveaux relativement élevés de fluorescence de fond et un faible rapport signal sur bruit dans le dosage. Par conséquent, un besoin existe toujours pour un dosage fiable, robuste et rentable pour quantifier le GSIS d’une manière de haut débit.
Les progrès récents en biophysique ont abouti à l’élaboration d’un test de transfert (HTRF) fondé homogène de fluorescence résolue en temps énergie résonance. Plus précisément, alors que le transfert de l’énergie dans le dosage pourrait qualifier axée sur la frette, avec plus de précision, que HTRF s’appuie sur la luminescence énergétique résonance transfert (vu)10 qui est le transfert d’énergie non radiatif entre le donneur et l’accepteur espèces de12,11,13. Cette distinction est importante, depuis le moment où une fluorescence ou trempe la base frette interaction est très différent qu’il est pour vu, bien que les mêmes types de déclenchement peuvent être utilisés pour le FRET et vu. En outre, l’utilisation des terres rares lanthanide cryptate composés comme l’europium ou cryptate de terbium à HTRF produit fluorescence longue demi-vie12,14. Cela offre l’avantage unique de l’introduction d’un temps de retard (µsec) entre l’excitation du donneur et la mesure de l’émission de l’accepteur (c.-à-d., résolution temporelle assay). Ce délai permet de suffisamment de temps pour la fluorescence de fond se dissipe avant la mesure de la fluorescence d’émission accepteur. Par conséquent, l’affichage est exempt de fluorescence non spécifiques et ainsi, un rapport signal sur bruit élevé est atteint (Figure 1). En outre, le caractère homogène de HTRF élimine la nécessité d’étapes de lavage pour laver les espèces non liés, rendant le dosage bien plus rapide que ELISA ou méthodes axées sur la RIA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Figure 1 : schéma du mécanisme de détection de l’insuline HTRF. Deux anticorps monoclonaux indépendamment générés spécifiquement reconnaître et lier à l’insuline à des sites distincts. Ces anticorps sont conjugués à l’accepteur XL665 ou le donneur de cryptate d’europium. Excitation du donneur à 337 résultats nm dans l’émission à 620 nm. Le transfert d’énergie qui en résulte provoque la XL665 émettre une longueur d’onde plus longues, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’utiliser une approche axée sur les HTRF pour déterminer les niveaux de GSIS de cellules INS-1E, un bien établie insulino-sécrétrices cellules bêta dérivé rat insulinome cellule ligne15. En outre, ce test peut servir pour identifier le profil pharmacologique de régulateurs moléculaires de la sécrétion d’insuline. Nous appliquons ce dosage insuline basée sur HTRF afin d’examiner la dopamine D2-comme la régulation des récepteurs de GSI. Croissant d’études ont révélé que la dopamine, un neurotransmetteur est un régulateur important du GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. la dopamine affecte GSIS autocrine/paracrine négativement par des actions sur la dopamine D2-comme des récepteurs (D2, D3, récepteurs de4 D) exprimée à la surface de cellules pancréatiques bêta8 , 16 , 19. à l’aide de ce test, nous confirmer le rôle de la dopamine comme un régulateur négatif du GSIS et démontrer que la dopamine D2-bromocriptine agonistes du récepteur et quinpirole également réduire GSIS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well white half area plate</td>
			<td style="width:104px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:139px;">82050-042</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-well white low-volume, round-bottom plate</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td>15100157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin High Range Kit</td>
			<td style="width:104px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:139px;">62IN1PEH&#160;</td>
			<td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PHERAstar FSX plate reader</td>
			<td style="width:104px;">BMG Labtech</td>
			<td>FSX</td>
			<td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plate sealers</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">DY992</td>
			<td>To seal plate while antibodies incubate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:104px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:139px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11875-093</td>
			<td>[+] L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 0.05%&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">25-052-CI</td>
			<td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">21-031-CV</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">156-30-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin solution 100x</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">30-002 CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">M1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dopamine hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">8502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromocriptine mesylate</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(-)-Quinpirole hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:139px;">12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

La détection de la sécrétion d’insuline est cruciale pour élucider des mécanismes de sécrétion régulée ainsi comme dans les études de métabolisme. Bien que nombreux dosages d’insuline ont existé pendant des décennies, l’avènement récent de la technologie de Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) résolue en temps homogène a considérablement simplifié de ces mesures. Il s’agit d’un dosage rapid, rentable, reproductible et robuste optique dépendant des anticorps conjugués à des fluorophores lumineux dont les émissions de longue durée qui facilite la résolution temporelle Förster Resonance Energy Transfer. En outre, HTRF insuline détection est prête pour le développement des essais de criblage à haut débit. Ici, nous utilisons HTRF pour détecter la sécrétion d’insuline dans les cellules de l’INS-1E, une lignée de cellules dérivées d’insulinome de rat. Cela nous permet d’estimation du niveau basal de l’insuline et leurs modifications en réponse à la stimulation de la glycémie. En outre, nous utilisons ce système de détection de l’insuline pour confirmer le rôle de la dopamine comme un régulateur négatif de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). De manière similaire, les autres de la dopamine D2-agonistes des récepteurs et quinpirole bromocriptine, GSIS de réduire d’une manière dose-dépendante. Nos résultats mettent en évidence l’utilité du format de dosage d’insuline HTRF pour déterminer le rôle de nombreux médicaments GSIS et leurs profils pharmacologiques.

Nous avons validé notre essai HTRF de l’insuline en générant une courbe standard de l’insuline à l’aide de l’insuline humaine purifiée normes de concentrations prédéfinies (Figure 2). Génération de la courbe standard nous ont permis d’extrapoler les lectures de fluorescence ratiométrique et donc à déterminer les niveaux d’insuline sécrétée en réponse aux traitements médicamenteux (Figure 2). La variat...

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Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Homogène Time-resolved Förster Resonance Energy axée sur le transfert test pour la détection de l’insulinosécrétion

Nous présentons ici homogène temps résolu vous inquiétez (HTRF) comme une méthode efficace pour la détection rapide de l’insuline sécrétée par les cellules.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Production et détection d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) dans les cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Recherche

Médecine

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Amélioration de l&#39;administration d&#39;insuline IV dans un hôpital communautaire

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Luminescence Cerenkov Imaging (CLI) pour la surveillance de la thérapie du cancer

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Analyse Coculture des interactions protéiques extracellulaires affecter la sécrétion d&#39;insuline par les cellules bêta du pancréas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Combiné la microscopie intravitale et échographie de contraste accentué des membres postérieurs souris pour étudier la vasodilatation induite par l’insuline et la Perfusion du Muscle

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla

Imagerie par résonance magnétique cardiaque à 7 Tesla

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Étudier le Signal hypothalamique de l’insuline à l’intolérance au Glucose périphérique avec un système de perfusion continue de drogues dans le cerveau de souris

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Test d'activité d'endotoxine pour la détection de l'endotoxémie de sang entier dans les patients gravement malades

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mécanismes sous-jacents Gut sécrétion de l’Hormone à l’aide de l’isolé perfusé intestin grêle de Rat

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Résonance magnétique cardiaque pour l'évaluation du thrombus cardiaque présumé : techniques conventionnelles et émergentes

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...