Name: homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

המחברים אין לחשוף.

1. INS-1E תאים: תחזוקה, ציפוי
<ol><li>לשמור על תוספות-1E תאים של humidified 37 ˚C/5% CO2 מגשים, בתרבית בינונית RPMI 1640 בתוספת 5% (v/v) לא פעיל חום העובר שור סרום, 2 מ מגלוטמין, 10 מ מ HEPES, 1 מ מ נתרן פירובט, פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין... פתרון, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. התרבות התאים במדיום RPMI 1640 להשלים 10 מ"ל (לכל צלחת), עד ?...

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

וזמינותו אינסולין HTRF המתוארים כאן מציע מערכת מהירה, יעילה כדי למדוד את הפרשת האינסולין ממערכת מבוססי תאים בתרבית. בין היתרונות החשובים ביותר שלה, זו assay מציע אות רקע נמוך בשל יחס אות לרעש גבוה. בנוסף, יש לנו אישר כי האות HTRF הוא יציב במשך פרקי זמן ארוכים (> 24 שעות ביממה)7. עם זאת, מא?...

ויסות חילוף החומרים האנרגיה יסודי על ידי הורמון אנאבולי הגדולות, אינסולין. אינסולין מסונתז והוא שוחרר על ידי בתאי בטא בלבלב כתגובה רמות גלוקוז מוגברת חוץ-תאית. האינסולין שפורסמו מפעיל את קליטת הגלוקוז על ידי רקמות הרגישים אינסולין1,2. מבחינה פיזיולוגית, זה מקושר את העלאת ריכוז הגלוקוז לאחר ארוחה, ואחריו הפרשת אינסולין כדי לווסת את ספיגת הגלוקוז. הפרעות גלוקוז הומאוסטזיס להוביל ליקויי מטבולית לשיאה תנגודת לאינסולין, ובסופו של דבר בתחילתה של סוג 2 סוכרת2,3,4.
למרות הפרשת האינסולין נחקרה בהרחבה, את מנגנוני הרגולציה נותרים ממעטים להבין. אזור קריטי של החקירה היה זיהוי של הרומן מאפננים הפרשת האינסולין על ידי בתאי בטא5,6,7,8. מחקרים אלו דורשות הבנה טובה יותר של הקשר צימוד בין גלוקוז גירוי הפרשת האינסולין. לכן, היכולת לפקח במדויק ולכמת את רמות הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז (GSIS) היה חיוני. עם זאת, עד כה, רק מספר מצומצם של שיטות היו זמינות לאפשר כימות של GSIS באמצעות הורמון האינסולין שורות תאים ו/או לנגרהנס. אחד הוא רדיו אימונולוגי (RIA), אשר מנצל אינסולין מתויג radioisotope, נוגדנים. המגבלות העיקריות של גישה זו כוללות בעיות בטיחות עקב טיפול לסילוק חומרים רדיואקטיביים. בנוסף, שיטה זו היא מהגידולים, מעורבים מרובים כביסה ארוך והשלבים הדגירה. מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) הוא גישה יקר, עתירי עבודה אחרת אשר מנצל נוגדנים לגילוי אינסולין. וריאציה נוגדן הזיקות, היעילות של זיהוי אינסולין המגבילים את הגורמים של שיטה זו, והוא יכול להשפיע על הפארמצבטית את התוצאות. אליסה וגם ריאה תוכנן עבור ניסויים תפוקה גבוהה. AlphaScreen הוא assay הומוגנית המשמש עבור איתור של מדידת רמות של הפרשת האינסולין. AlphaScreen הטכנולוגיה מבוססת על ההמרה של תאורת הסביבה חמצן לתוך מצב גופיה חמצן נרגש זה יכול להגיב עם מינים chemiluminescent, וכתוצאה מכך הדור של chemiluminescence. מכיוון וזמינותו היא הומוגנית, רבים מן השלבים כביסה המשויך ריאה ואליסה נמחקות. אולם, חוסר היציבות של האות בשל אופיו של התגובה היא גורם מגביל שעשויים להשפיע על המדידה של וזמינותו. (TR-מלקחיים, שפותחה על ידי Heyduk ועמיתיו9, היא גישה הומוגנית נוספת למדידה אינסולין בהתבסס על הכריכה של שני נוגדנים נפרד epitopes שונים על מולקולת האינסולין. הנוגדנים הם כל הדנ א תקועים מבחינה כימית מקושר כפול עם קצר משלימים יחיד נטושים DNA המסוכך. איגוד של הנוגדנים לאינסולין מפגיש ביניהם ומוביל דופלקס DNA כפול נטושים. כל נוגדן קשורה גם fluorophore בהתאמה תורם או מקבל, איגוד דופלקס ה-DNA מפגיש את אלה fluorophores כדי ליצור העברת האנרגיה של תהודה פורסטר (סריג). מגבלה אפשרית אחת של TR-מלקחיים, עם זאת, מוטלת סריג עצמה. חוסר היכולת להפיג במהירות רקע זריחה במהלך התגובה סריג עשוי להוביל רמות גבוהות יחסית של קרינה פלואורסצנטית רקע אות חלש ליחס רעש בתוך וזמינותו. לכן, צריך עדיין קיימת עבור וזמינותו אמין, חזקה וחסכונית לכימות תנועת GSIS באופן תפוקה גבוהה.
התפתחויות אחרונות ביופיזיקה יש לשיאה התפתחות assay העברה (HTRF) המבוסס על תהודה זריחה זמן לפתור הומוגנית אנרגיה. באופן ספציפי, בזמן העברת האנרגיה בתוך וזמינותו ייתכן שתואר מבוסס סריג, ליתר דיוק, ש-HTRF מסתמך על הפריה חוץ גופית אנרגיה תהודה העברה (LRET)10 אשר ההעברה הלא-קרינה של אנרגיה בין התורם מקבל מינים11,12,13. ההבחנה זו חשובה, מאז העיתוי של פלורסצנטיות או להרוות מבוסס סריג אינטראקציה היא שונה בהרבה מאשר LRET, למרות אותם סוגים של gating יכול לשמש עבור סריג ו- LRET. יתר על כן, השימוש נדיר earth לנתניד cryptate תרכובות כגון אירופיום או טרביום cryptate ב HTRF מייצר קרינה פלואורסצנטית זמן מחצית החיים12,14. זה מציע את היתרון הייחודי של המבוא של השהיית זמן (µsec) בין התורם עירור מדידת פליטת מ מקבל (קרי, זמן לפתור assay). השהיית הזמן מאפשר זמן מספיק רקע זריחה להתפוגג לפני המדידה של מקבל פליטת קרינה פלואורסצנטית. כתוצאה מכך, המדידה היא ללא קרינה פלואורסצנטית שאינם ספציפיים, לפיכך, יחס אות לרעש גבוה מושגת (איור 1). יתר על כן, הטבע הומוגנית של HTRF מבטל את הצורך לכביסת צעדים לשטוף את המין לא מאוגד, ביצוע וזמינותו הרבה מהירה יותר מאשר אליסה או שיטות מבוססות-ריאה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> איור 1: סכימטי של המנגנון לגילוי אינסולין HTRF. שני נוגדנים חד-שבטיים באופן עצמאי שנוצר במיוחד מזהה, לאגד אינסולין באתרים נפרדים. נוגדנים אלה הם מצומדת התורם cryptate אירופיום או מקבל את XL665. עירור של התורם 337 תוצאות nm בפליטה-620 ננומטר. העברת אנרגיה וכתוצאה מכך גורמת XL665 לפלוט על אורך גל ארוך יותר, 665 ננומטר. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור משתמש בגישה מבוססת-HTRF כדי לקבוע את הרמות של GSIS מתאי הארצי-1E, ומבוססת הורמון האינסולין תאי בטא-derived עכברוש אינסולינומה תא קו15. בנוסף, וזמינותו הזה עשוי לשמש לזיהוי לפרופיל תרופתי של ווסתי מולקולרית של הפרשת האינסולין. אנו מיישמים את זה אינסולין מבוססי HTRF assay לבחון דופמין D2-כמו ויסות הקולטן GSIS. הגדלת מחקרים גילו כי הנוירוטרנסמיטר דופמין היא הרגולטור חשוב של GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. דופמין משפיע על GSIS בצורה autocrine/paracrine נגטיבית באמצעות פעולות על דופמין D2-כמו רצפטורים (D2, D3, קולטנים4 D) בא לידי ביטוי על פני השטח של תאי הלבלב בטא8 , 16 , 19. אנו שימוש assay זו, לאשר את תפקידו של הדופמין כרגולטור שלילי של GSIS, ידגים את השיטה דופמין D2-כמו ברומוקריפטין אגוניסטים לקולטן, quinpirole גם להפחית GSIS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well white half area plate</td>
			<td style="width:104px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:139px;">82050-042</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-well white low-volume, round-bottom plate</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td>15100157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin High Range Kit</td>
			<td style="width:104px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:139px;">62IN1PEH&#160;</td>
			<td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PHERAstar FSX plate reader</td>
			<td style="width:104px;">BMG Labtech</td>
			<td>FSX</td>
			<td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plate sealers</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">DY992</td>
			<td>To seal plate while antibodies incubate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:104px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:139px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11875-093</td>
			<td>[+] L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 0.05%&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">25-052-CI</td>
			<td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">21-031-CV</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">156-30-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin solution 100x</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">30-002 CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">M1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dopamine hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">8502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromocriptine mesylate</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(-)-Quinpirole hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:139px;">12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

הגילוי של הפרשת האינסולין הוא קריטי עבור שחקרתי מנגנוני הפרשת מוסדרים גם כמו מחקרים של חילוף החומרים. על פי מבחני אינסולין רבות קיימות כבר עשרות שנים, התפתחות הטכנולוגיה פורסטר תהודה אנרגיה העברה (HTRF) זמן לפתור הומוגנית האחרונות פישטה משמעותית מדידות אלה. זהו מהיר, חסכוני, הדירים חזקים אופטי assay על נוגדנים מצומדת כדי fluorophores בהיר עם פליטה לאורך זמן המאפשרת זמן לפתור פורסטר תהודה אנרגיה העברה. יתר על כן, גילוי האינסולין HTRF הוא לשכנוע הפיתוח של מבחני המיון תפוקה גבוהה. כאן אנו משתמשים HTRF כדי לזהות את הפרשת האינסולין בתאים הארצי-1E, קו תא אינסולינומה-derived חולדה. זה מאפשר לנו להעריך את רמות הבסיס של אינסולין בתגובה לגירוי הגלוקוז שלהם לשינויים. בנוסף, אנו משתמשים זו מערכת איתור של אינסולין כדי לאשר את התפקיד של דופמין כרגולטור שלילי של הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז (GSIS). באופן דומה, אחרים דופמין D2-כמו אגוניסטים לקולטן, quinpirole ו ברומוקריפטין, להפחית GSIS באופן תלוי-ריכוז. התוצאות שלנו להאיר את התועלת של התבנית HTRF assay אינסולין בקביעת את התפקיד של תרופות רבות GSIS ופרופילים תרופתי שלהם.

אנחנו לאמת שלנו assay HTRF האינסולין על ידי יצירת מעגל אינסולין רגיל באמצעות אינסולין אנושי מטוהרים סטנדרטים של ריכוזים מוגדרים מראש (איור 2). הדור של העקומה רגיל מותר לנו להסיק שהקריאות זריחה רציומטרי ובכך לקבוע את רמות האינסולין המופרש כתגובה הטיפולים סמים ...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

פורסטר זמן לפתור הומוגנית תהודה אנרגיה מבוססת על העברת Assay גילוי של הפרשת האינסולין

כאן, אנו מציגים הומוגנית זמן נפתרה תדאג (HTRF) בתור שיטה יעילה לגילוי מהיר של אינסולין מופרש מתאי.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

שיפור ניהול IV אינסולין בבית חולים קהילתי

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov הארת ההדמיה (CLI) לניטור ריפוי הסרטן

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

ניתוח Coculture של אינטראקציות חלבון תאיות המשפיעות על הפרשת אינסולין על ידי תאים בטא בלבלב

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

משולב מיקרוסקופ Intravital משופרת לעומת זאת בדיקת אולטרה סאונד של Hindlimb העכבר ללמוד Vasodilation הנוצרות על-ידי אינסולין זלוף שריר

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla

דימות תהודה מגנטית לב בטסלה 7

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

לומדים את האות ההיפותלמוס אינסולין סובלנות גלוקוז היקפי עם מערכת עירוי רציף סמים לתוך המוח העכבר

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

המנגנונים שבבסיס הפרשת הורמון תחושת הבטן באמצעות מבודד את Perfused המעי הדק עכברוש

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

תהודה מגנטית קרדיולוגית להערכת החשוד בתרובוס הלב: טכניקות קונבנציונליות והמתעוררים

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...