Name: homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Forfatterne ikke avsløre.

1. INS-1E celler: vedlikehold og Plating
<ol><li>Opprettholde INS-1E celler i en fuktet 37 ˚C/5% CO2 inkubator og kultivert med RPMI 1640 medium supplert med 5% (v/v) inaktivert fosterets bovin serum, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvate, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin løsning, 50 µM β-mercaptoethanol. Kultur celler i 10 mL komplett RPMI 1640 medium (per plate), før de når 80-90% samløpet, når de kan trypsinized og passaged eller brukes for insulin sekresjon analysen.</li>
	<li>
<str...

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

HTRF insulin analysen beskrevet her tilbyr en rask, effektiv system for å måle insulinsekresjon fra en kultivert cellen-basert system. Blant sine viktigste fordeler tilbyr denne analysen en lav bakgrunn tapsfrie høy signal-til-støy-forhold. I tillegg har vi bekreftet at HTRF signalet er stabil over lengre tid (> 24 h)7. Siden insulin-bindende monoklonale antistoffer nå bindende metning etter tillegg til analysen, kan likevel kinetics antistoff bindingen påvirkes ved romtemperatur eller varia...

Regulering av energi metabolism er finjustert med en større anabole hormon, insulin. Insulin syntetiseres og utgitt av bukspyttkjertelen beta-cellene som svar på økt ekstracellulære blodsukkeret. Utgitt insulin utløser opptaket av glukose av insulin-sensitive vev1,2. Fysiologisk, er dette knyttet til høyden av glukose konsentrasjon etter et måltid, etterfulgt av utskillelsen av insulin til å regulere glukose opptak. Forstyrrelser i glukose homeostase føre til metabolsk impairments i insulinresistens og til slutt i utbruddet av type 2 diabetes2,3,4.
Selv om insulinsekresjon har blitt grundig undersøkt, fortsatt dens forskrifter mekanismer dårlig forstått. Et kritisk område etterforskning har vært identifikasjon av romanen modulatorer på insulinsekresjon av beta-cellene5,6,7,8. Disse studiene krever en bedre forståelse av kopling forholdet mellom glukose stimulering og insulinsekresjon. Derfor er nøyaktig overvåke og kvantifisere nivåene av glukose-stimulert insulinsekresjon (GSIS) viktig. Hittil har imidlertid ble bare et begrenset antall metoder tillates kvantifisering av GSIS bruker insulin sekresjon linjer og/eller bukspyttkjertelen holmer. En er radioimmunoassay (RIA), som benytter radioisotop-merket insulin og antistoffer. De viktigste begrensningene av denne tilnærmingen inkluderer sikkerhetsforholdene håndtering og deponering av radioaktivt materiale. I tillegg er denne metoden arbeidskrevende, med flere lange vask og inkubasjon skritt. Enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) er en annen dyrt og arbeidskrevende tilnærming som benytter antistoffer for insulin gjenkjenning. Variasjon i antistoff slektskap og effektiviteten av gjenkjenne insulin er begrensende faktorer av denne metoden og kan påvirke reproduserbarhet resultatene. ELISA verken RIA ble utformet for høy gjennomstrømming eksperimenter. AlphaScreen er en homogen analysen brukes til å oppdage og måle nivåer på insulinsekresjon. AlphaScreen teknologi er basert på konvertering av ambient oksygen i en spent oksygen singlet tilstand som kan reagere med chemiluminescent arter, som resulterer i generering av chemiluminescence. Analysen er homogen, elimineres mange av punktene vask forbundet med RIA og ELISA. Ustabilitet i signalet på grunn av reaksjonen er imidlertid en begrensende faktor som påvirker presentasjon av analysen. (TR-KNIPETANGSMANØVER, utviklet av Heyduk og kolleger9, er en annen homogen tilnærming til insulin mål basert på binding av to separate antistoffer mot ulike epitopes på insulin molekylet. Antistoffer er hver kjemisk knyttet til dobbel strandet DNA med kort komplementære enkelt strandet DNA overheng. Binding av antistoffer for insulin samler dem og fører til en double-strandet DNA tosidig. Hver antistoff er også forbundet med en respektive donor eller acceptor fluorophore og foreningen av DNA duplex samler disse fluorophores til å generere han selvmord resonans energioverføring (bånd). Én potensielle begrensning av TR-KNIPETANGSMANØVER, men hviler med båndet selv. Manglende evne til å raskt forsvinne bakgrunn fluorescens under bånd reaksjonen fører til relativt høye nivåer av bakgrunnen fluorescens og et svakt signal til støyforhold i analysen. Derfor eksisterer behov fortsatt for en pålitelig, solid og kostnadseffektiv analysen for kvantifisering GSIS på en høy gjennomstrømming måte.
Nylige fremskritt innen biofysikk har kulminerte i utviklingen av en homogen tid-løst fluorescens energi resonans overføring (HTRF) basert analysen. Spesielt mens energi overføring i kan analysen beskrives som bånd-basert, mer presist, HTRF er avhengig av luminescence energi resonans overføring (LRET)10 som er ikke-strålingen overføring av energi mellom giver og acceptor arter11,12,13. Denne forskjellen er viktig siden tidspunktet for en fluorescens eller slukke basert bånd samhandling er mye annerledes enn det er for LRET, selv om de samme typene gating kan brukes for bånd og LRET. Videre bruk av sjeldne jord transisjonsmetall cryptate forbindelser som bilderørskjermer eller terbium cryptate i HTRF produserer lange fluorescens halveringstid12,14. Dette tilbyr unike fordelen av innføringen av en tidsforsinkelse (µsec) mellom donor eksitasjon og måling av utslipp fra acceptor (dvs. tid-løst analysen). Denne forsinkelsen gir tilstrekkelig tid til bakgrunnen fluorescens å spre før måling av acceptor utslipp fluorescens. Følgelig, readout er gratis ikke-spesifikk fluorescens og dermed høy signal-til-støy forholdet er oppnådd (figur 1). Videre eliminerer homogen natur HTRF behovet for vask skritt å vaskes ubundet arter, gjøre analysen mye raskere enn ELISA eller RIA-baserte metoder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk av mekanismen for HTRF insulin gjenkjenning. To selvstendig generert monoklonale antistoffer spesielt gjenkjenner og binder til insulin på forskjellige områder. Disse antistoffene er konjugert bilderørskjermer cryptate donor eller XL665 acceptor. Magnetisering av donor på 337 nm resultater på utslipp på 620 nm. Resulterende energi overføringen fører XL665 til å slippe ut på en lengre bølgelengde, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Her gir vi en detaljert protokoll for å bruke et HTRF tilnærming til å bestemme nivåer av GSIS fra INS-1E celler, en veletablert insulin-sekresjon beta-celle-avledet rotte insulinoma celle linje15. Denne analysen kan i tillegg brukes til å identifisere farmakologiske profilen av molekylære regulatorer på insulinsekresjon. Vi bruker denne HTRF-baserte insulin analysen for å undersøke dopamin D2-like reseptor regulering av GSIS. Økende studier har vist at de nevrotransmitter dopamin er en viktig regulator av GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamin påvirker GSIS i en negativ autocrine/paracrine måte via handlinger på dopamin D2-like reseptorer (D2, D3, D4 reseptorer) uttrykt på overflaten av beta bukspyttkjertelen celler8 , 16 , 19. bruker denne analysen, vi bekrefte dopamins rolle som en negativ regulator av GSIS og vise at dopamin D2-like reseptor agonister bromocriptine og quinpirole også redusere GSIS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well white half area plate</td>
			<td style="width:104px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:139px;">82050-042</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-well white low-volume, round-bottom plate</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td>15100157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin High Range Kit</td>
			<td style="width:104px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:139px;">62IN1PEH&#160;</td>
			<td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PHERAstar FSX plate reader</td>
			<td style="width:104px;">BMG Labtech</td>
			<td>FSX</td>
			<td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plate sealers</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">DY992</td>
			<td>To seal plate while antibodies incubate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:104px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:139px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11875-093</td>
			<td>[+] L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 0.05%&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">25-052-CI</td>
			<td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">21-031-CV</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">156-30-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin solution 100x</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">30-002 CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">M1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dopamine hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">8502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromocriptine mesylate</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(-)-Quinpirole hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:139px;">12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

Oppdagelsen av insulinsekresjon er viktig for Klargjørende mekanismer av regulert sekresjon så vel som i studier av stoffskiftet. Selv om mange insulin analyser har eksistert i flere tiår, har det nylige advent homogen tid-løst han selvmord resonans energi overføring (HTRF) teknologi betydelig forenklet disse målingene. Dette er en rask, kostnadseffektiv, reproduserbare og robust optisk analysen basert på antistoffer konjugert til lyse fluorophores med langvarig utslipp som muliggjør tid-løst han selvmord resonans energi overføring. Videre er HTRF insulin gjenkjenning mottakelig for utvikling av høy gjennomstrømming screening analyser. Her bruker vi HTRF for å oppdage insulinsekresjon i INS-1E celler, en rotte insulinoma-avledet cellen linje. Dette tillater oss å beregne basale nivåer av insulin og deres endringer i respons til glukose stimulering. Dessuten, bruker vi dette insulin oppdagelsen system for å bekrefte dopamin rolle som en negativ regulator på glukose-stimulert insulinsekresjon (GSIS). På en lignende måte, andre dopamin D2-like reseptor agonister, quinpirole og bromocriptine, redusere GSIS i en konsentrasjon-avhengige måte. Våre resultater markere nytten av HTRF insulin analysen formatet fastsette rollen til mange narkotika i GSIS og deres farmakologiske profiler.

Vi validert analysen vår insulin-HTRF ved å generere en insulin standardkurve benytter renset menneskelige insulin standarder for forhåndsdefinerte (figur 2). Generasjon av standardkurve tillatt oss å ekstrapolere ratiometric fluorescens målinger og dermed avgjøre utskilles insulin nivåer svar medikamentelle behandlinger (figur 2). Intraplate variasjoner for montering kurve var minimal (R2 = 0.99996 ± ...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Homogen tid-løst han selvmord resonans energi overføring-basert analysen for påvisning av Insulin Secretion

Her presenterer vi homogen tid løst bånd (HTRF) som en effektiv metode for rask påvisning av insulin skilles ut fra celler.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produksjon og Påvisning av reaktive oksygen arter (ROS) i Kreft

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Forbedre IV Insulin Administration i en Community Hospital

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Overvåking

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Analyse av Ekstracellulære protein interaksjoner som påvirker insulinsekresjon ved betaceller i bukspyttkjertelen

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Kombinert Intravital mikroskopi og kontrast forbedret Ultrasonography av mus-Hindlimb for å studere Insulin-indusert vasodilatasjon og muskel perfusjon

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla

CARDIAC magnetisk resonans Imaging på 7 Tesla

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Studere hypothalamus Insulin Signal perifere glukose intoleranse med kontinuerlig narkotika Infusjonssystem inn i musen hjernen

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Endotoksin aktivitet analysen for påvisning av hele blod endotoxemia i kritisk syke pasienter

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mekanismene bak Gut hormon sekresjonen bruker den isolerte Perfused rotte tynntarmen

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

CARDIAC magnetisk resonans for evaluering av mistenkte CARDIAC Trombe: konvensjonelle og Emerging teknikker

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...