Name: homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Авторы не имеют ничего сообщать.

1. INS-1E клетки: техническое обслуживание и покрытие
<ol><li>Сохранять INS-1E клетки в увлажненные 37 ˚C/5% CO2 инкубатора и культивировали среду RPMI 1640 дополнена 5% (v/v) тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, 2 мм L-глютамином, 10 HEPES, пируват натрия 1 мм, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицин...

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

Пробирного инсулин HTRF, описанные здесь предлагает быстрые, эффективные системы для измерения секреции инсулина от культурной системы, основанной на ячейку. Среди его наиболее важных преимуществ этот assay предлагает низкий фонового сигнала из-за высокое соотношение сигнал шум. Кроме то?...

Регулирование энергии метаболизма скорректировать основных анаболический гормон инсулин. Инсулин синтезируется и выпущенное бета клеток поджелудочной железы в ответ на увеличение внеклеточного глюкозы. Выпустила инсулин вызывает усвоение глюкозы, инсулина чувствительных тканей1,2. Физиологически это связано с повышение концентрации глюкозы после еды, следуют секрецию инсулина, чтобы регулировать глюкозы. Нарушения гомеостаза глюкозы приводят к метаболические расстройства, кульминацией которых сопротивление инсулина и в конечном итоге в начале типа 2 диабет2,3,4.
Хотя широко изучены секреции инсулина, ее механизмы регулирования по-прежнему осознаются. Критической областью исследования было выявление романа Модуляторы секрецию инсулина бета-клеток5,6,,78. Эти исследования требуют лучшего понимания муфта отношения между глюкозы стимуляции и секреции инсулина. Таким образом способность точно контролировать и количественную оценку уровней инсулина глюкоза стимулирует секрецию (ССГС) весьма важное значение. На сегодняшний день, однако, лишь ограниченное количество методов были доступны дать количественную оценку данной ССГС с помощью секреции инсулина клеточных линий и/или панкреатических островков. Один является радиоиммуноанализ (RIA), которая использует радиоизотопные тегами инсулина и антител. Основные ограничения такого подхода включают вопросы безопасности за счет обработки и утилизации радиоактивных материалов. Кроме того этот метод является трудоемким, с участием нескольких долго стирки и инкубации шаги. Энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) является другой дорогостоящие и трудоемкие подход, который использует антитела для обнаружения инсулина. Вариации в антитела сродства и эффективности признания инсулина сдерживающими факторами этого метода и может повлиять на воспроизводимость результатов. ELISA ни РИА был разработан для высокой пропускной способности экспериментов. AlphaScreen является однородной пробирного используется для обнаружения и измерения уровня секреции инсулина. Технология AlphaScreen основана на преобразование атмосферного кислорода в состояние синглетно возбужденных кислорода, которые могут реагировать с хемилюминесцентный видов, что приводит к генерации хемилюминесценции. Потому что assay однородной, многие из стиральной шаги, связанные с РИА и ELISA устраняются. Однако нестабильность сигнала благодаря характер реакции является ограничивающим фактором, который может повлиять на значение индикации assay. (TR-клещи, разработанный Heyduk и коллеги9, является другой однородной подход к инсулина измерения, основанные на связывание двух отдельных антител к различным эпитопам на молекуле инсулина. Антитела являются каждого химически связаны с двойной мель ДНК с короткие дополнительные одного мель ДНК свесы. Связывание антител к инсулину объединяет их и приводит к двойной дуплекс мель ДНК. Каждое антитело также связан с соответствующими донорами или акцепторной Флюорофор, и Ассоциация ДНК дуплекс объединяет эти флуорофоров для создания передачи энергии резонанса Фёрстер (лад). Одним из потенциальных ограничений TR-клещи, однако, лежит на ладу, сам. Невозможность быстро рассеивать флуоресценции фон во время реакции лад может привести к относительно высоким уровнем фона флуоресценции и низкое соотношение сигнал-шум в assay. Таким образом по-прежнему существует необходимость для надежные, надежной и рентабельной assay для количественной оценки ССГС в духе высокой пропускной способности.
Последние достижения в биофизике привели к разработке однородной флуоресценции время решена энергии резонанса передачи (HTRF) на основе анализа. В частности в то время как энергия передачи в пределах assay можно охарактеризовать как основанные на ладу, более точно, HTRF опирается на люминесценции энергии резонанса передачи (среде)10 , который является не радиационное передачи энергии между доноров и акцепторов видов11,12,13. Это различие имеет важное значение, поскольку сроки флуоресценции или тушения на основе взаимодействия ладу сильно отличается, чем для его, хотя для ладу и его могут использоваться те же типы стробирования. Кроме того использование редкоземельных лантаноиды cryptate соединений например европий или Тербий cryptate в HTRF производит длинные флуоресценции полураспада12,14. Это дает уникальные преимущества введения задержки (µsec) между донорами возбуждения и измерения выбросов от акцептор (то есть, время решена проба). Эта задержка позволяет достаточно времени для флуоресценции фон для рассеивания до измерения флуоресценции акцептора выбросов. Следовательно, индикация является бесплатным неспецифичные флуоресценции и таким образом, достигается высокое соотношение сигнал шум (рис. 1). Кроме того однородный характер HTRF устраняет необходимость для мытья шаги смыть несвязанных видов, что делает assay намного более быстрым чем ELISA или методы, основанные на РИА.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Рисунок 1: схема механизма обнаружения инсулин HTRF. Два самостоятельно сгенерированный моноклональные антитела конкретно признать и привязку к инсулина на отдельных участках. Эти антитела конъюгированных европий cryptate доноров или акцепторной XL665. Возбуждения донора в 337 нм приводит к эмиссии на 620 Нм. Результате переноса энергии вызывает XL665 выпустить на больше длины волны, 665 нм. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Здесь, мы предоставляем подробный протокол для использования подхода на основе HTRF для определения уровней ССГС от клеток INS-1E, устоявшихся инсулин секреции бета клеток крыса инсулинома клеток линии15. Кроме того этот assay может использоваться для идентификации фармакологических профиль молекулярных регуляторов секреции инсулина. Мы применяем этот assay на основе HTRF инсулина для изучения допамина D2-как рецептор регулирование ССГС. Все исследования показали, что нейротрансмиттеров допамина является важным регулятором ССГС8,16,,1718,19,20, 21 , 22. допамина влияет ССГС отрицательным образом Аутокринный/паракринными через действия на допамин D2-как рецепторы (Д-2, D3, D4 рецепторов) выразил на поверхности бета-клеток поджелудочной железы8 , 16 , 19. используя этот assay, мы подтверждаем допамина в роли как негативный регулятор ССГС и продемонстрировать, что допамина D2-как Бромокриптин агонистами рецепторов и quinpirole также уменьшить ССГС.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well white half area plate</td>
			<td style="width:104px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:139px;">82050-042</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-well white low-volume, round-bottom plate</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td>15100157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin High Range Kit</td>
			<td style="width:104px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:139px;">62IN1PEH&#160;</td>
			<td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PHERAstar FSX plate reader</td>
			<td style="width:104px;">BMG Labtech</td>
			<td>FSX</td>
			<td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plate sealers</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">DY992</td>
			<td>To seal plate while antibodies incubate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:104px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:139px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11875-093</td>
			<td>[+] L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 0.05%&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">25-052-CI</td>
			<td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">21-031-CV</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">156-30-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin solution 100x</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">30-002 CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">M1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dopamine hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">8502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromocriptine mesylate</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(-)-Quinpirole hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:139px;">12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

Обнаружение секреции инсулина имеет решающее значение для разъяснения механизмов регулируется секреции также как и исследования метаболизма. Хотя многочисленные анализы инсулина существовали на протяжении десятилетий, недавние появлением однородных время решена Фёрстер передачи энергии резонанса (HTRF) технологии значительно упростила эти измерения. Это быстрый, экономически эффективным, воспроизводимые и надежные оптических пробирного зависит от антител, конъюгированных яркие флуорофоров с длительной выбросов, которая облегчает время решена Фёрстер резонанс передачи энергии. Кроме того для разработки высокопроизводительного скрининга анализов поддается HTRF инсулина обнаружения. Здесь мы используем HTRF для обнаружения секреции инсулина в INS-1E клеток, крысы линии инсулинома производные ячейки. Это позволяет нам оценить базальный уровень инсулина и их изменения в ответ на стимуляцию глюкозы. Кроме того мы используем эту систему обнаружения инсулина для подтверждения роли допамина как негативный регулятор секреции инсулина глюкоза стимулирует (ССГС). Аналогичным образом, другие допамина D2-как агонистами рецепторов, quinpirole и Бромокриптин, уменьшить ССГС в зависимости от концентрации. Наши результаты подчеркивают полезность формата пробирного инсулин HTRF в определении роли многочисленных лекарств в ССГС и их фармакологические профили.

Мы проверяются нашего анализа HTRF инсулина путем создания инсулина калибровочной кривой с использованием очищенного инсулина человека стандартов предопределенных концентрации (рис. 2). Поколение стандартной кривой, позволил нам экстраполировать чтен...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Однородное время решены Фёрстер резонанс энергии на основе передачи Assay для обнаружения секреции инсулина

Здесь мы представляем однородной время решена ладу (HTRF) как эффективный метод для быстрого обнаружения инсулина выделяется из клеток.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Производство и обнаружения активных форм кислорода (АФК) в Раки

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Улучшение IV введения инсулина в Коммьюнити

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Черенковского свечения Imaging (CLI) для мониторинга терапии рака

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Анализ внеклеточных белковых взаимодействий влияющие секрецию инсулина клетками поджелудочной железы бета

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Комбинированный прижизненной микроскопии и повысить контрастность УЗИ задних конечностей мыши для изучения инсулин индуцированной вазодилатацию и мышечная перфузия

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla

Магнитно-резонансная томография сердца на 7 Тесла

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Изучая гипоталамуса инсулин сигнал периферийных глюкозе с системой непрерывной наркотиками вливания в мозг мыши

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Эндотоксин деятельности Анализ для обнаружения эндотоксемии всей крови у критически больных пациентов

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Лежащие в основе кишки гормона с помощью изолированных механизмов увлажненную крыса тонкой кишки

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Сердечный магнитный резонанс для оценки предполагаемого сердечного тромба: обычные и новые методы

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...