Name: homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Författarna har något att avslöja.

1. INS-1E celler: underhåll och plätering
<ol><li>Upprätthålla INS-1E celler i en fuktad 37 ˚C/5% CO2 inkubator och odlade med RPMI 1640 medium kompletteras med 5% (v/v) Värmeinaktiverade fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin lösning, 50 µM β-merkaptoetanol. Kultur celler i 10 mL komplett RPMI 1640 medium (per platta), tills de når 80-90% sammanflödet, när de kan trypsinized och anpassade eller användas för insulin sekretionen ...

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

HTRF insulin analysen beskrivs här erbjuder en snabb, effektivt system för att mäta insulinutsöndringen från odlade cell-baserat system. Bland dess viktigaste fördelar erbjuder denna analys en låg bakgrund signal på grund av det höga signal-brus-förhållandet. Dessutom har vi bekräftat att HTRF signalen är stabil under en längre tid (> 24 h)7. Ändå, eftersom insulin bindande monoklonala antikropparna snabbt nå bindande mättnad efter tillägg till analysen, kineticsen av antikropp ...

Regleringen av energimetabolism är finjusteras av en större anabola hormon, insulin. Insulin är syntetiserade och släpptes av betaceller som svar på ökad extracellulär glukosnivåer. Frisläppta insulinet utlöser upptaget av glukos med insulin-känsliga vävnader1,2. Fysiologiskt, detta är höjden av glukos koncentration efter en måltid, följt av utsöndringen av insulin för att reglera glukosupptag. Störningar i glukoshomeostasen leda till metabola försämringar kulminerade i insulinresistens och slutligen i uppkomsten av typ 2 diabetes2,3,4.
Även om insulinutsöndringen har studerats, fortfarande dess reglerande mekanismer dåligt förstådd. En kritisk undersökning varit identifiering av romanen modulatorer av insulinutsöndringen av beta-cellerna5,6,7,8. Dessa studier kräver en bättre förståelse för kopplingen förhållandet mellan glukos stimulering och insulinutsöndringen. Förmågan att noggrant övervaka och kvantifiera nivåerna av glukos-stimulerad insulinsekretion (GSIS) har därför varit avgörande. Hittills har dock var endast ett begränsat antal metoder tillgänglig för att möjliggöra kvantifiering av GSIS använder insulin-utsöndrar cellinjer eller Langerhanska. En är radioimmunoassay (RIA), som använder radioisotop-taggade insulin och antikroppar. De viktigaste begränsningarna med denna metod inkluderar säkerhetsfrågor på grund av hantering och bortskaffande av radioaktivt material. Dessutom, är denna metod arbetsintensiva, som involverar flera långa tvätt och inkubationsstegen. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) är en annan kostsamma och arbetsintensiva metod som använder antikroppar för insulin upptäckt. Variation i antikropp tillhörighet och effektivitet erkänner insulin är begränsande faktorer av denna metod och kan påverka reproducerbarheten för resultaten. Varken ELISA eller RIA har utformats för hög genomströmning experiment. AlphaScreen är en homogen analys används för att upptäcka och mäta nivåer av insulinsekretionen. AlphaScreen teknik är baserad på omvandling av omgivningens syre till en upphetsad syre singlet stat som kan reagera med Kemiluminiscens arter, vilket resulterar i generationen av chemiluminescence. Eftersom analysen är homogen, elimineras många av de tvätt stegen i samband med RIA och ELISA. Instabiliteten i signalen pågrund av reaktionen är dock en begränsande faktor som kan påverka avläsningen av analysen. ()TR-pincett, utvecklat av Heyduk och kollegor9, är en annan homogen syn på insulin mätning baserat på bindningen av två separata antikroppar mot olika epitoper på insulin-molekylen. Antikropparna är varje kemiskt kopplade till dubbel stranded DNA med korta kompletterande enda stranded DNA överhäng. Bindande antikroppar till insulin för dem samman och leder till en dubbel stranded DNA duplex. Varje antikropp är också förknippat med en respektive givare eller acceptor fluorophore och sammanslutningen av DNA duplex sammanför dessa fluorophores att generera Förster resonans energiöverföringen (bandet). En potentiell begränsning av TR-pincett, vilar dock bandet själv. Oförmåga att snabbt försvinna bakgrund fluorescens under bandet reaktionen kan leda till relativt höga nivåer av bakgrunden fluorescens och en låg signal-brus-förhållande inom analysen. Det finns därför fortfarande ett behov för en tillförlitlig, robust och kostnadseffektiv analys för att kvantifiera GSIS på ett sätt som hög genomströmning.
Senaste framstegen inom biofysik har utmynnat i utvecklingen av en homogen tid-löst fluorescens energi resonance överföring (HTRF) baserat analys. Specifikt, medan energin överföra inom kan analysen beskrivas som bandet-baserade, rättare HTRF bygger på luminiscens energi resonance överföring (LRET)10 som är icke-strålnings överföring av energi mellan givare och acceptor arter11,12,13. Denna distinktion är viktigt, eftersom tidpunkten för en fluorescens eller släcka baserade bandet interaktion är mycket annorlunda än det är för LRET, men samma typer av gating kan användas för bandet och LRET. Dessutom, användning av sällsynta jordartsmetaller lanthanide cryptate föreningar såsom europium eller terbium cryptate i HTRF producerar långa fluorescens halveringstider12,14. Detta ger den unika fördelen att införa en tidsfördröjning (µsec) mellan givare excitation och mätning av utsläpp från acceptorn (dvs tid-löst assay). Denna tidsfördröjning tillåter tillräckligt med tid för bakgrunden fluorescensen att skingra före mätning av acceptor utsläpp fluorescens. Utslaget är följaktligen gratis av icke-specifika fluorescens och således en hög signal-brus-förhållande uppnås (figur 1). Dessutom eliminerar homogena beskaffenhet HTRF behovet av tvätt steg att tvätta bort den obundna arter, vilket gör analysen mycket snabbare än ELISA eller RIA-baserade metoder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk av mekanismen för HTRF insulin upptäckt. Två självständigt genererade monoklonala antikroppar specifikt känner igen och binder till insulin på separata platser. Dessa antikroppar är konjugerat med antingen europium cryptate givaren eller den XL665 acceptorn. Excitation av givaren på 337 nm resulterar i utsläpp på 620 nm. Den resulterande energiöverföringen orsakar XL665 att släppa ut en längre våglängd, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Här, vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll för att använda en strategi baserad på HTRF för att bestämma nivåerna av GSIS från INS-1E celler, en väletablerad insulin utsöndrar beta cell-derived råtta insulinom cell linje15. Denna analys kan dessutom användas för att identifiera molekylära regulatorer av insulinsekretionen farmakologiska profil. Vi tillämpar denna HTRF-baserade insulin analys för att undersöka dopamin D2-gillar receptor reglering av GSIS. Ökande studier har visat att signalsubstansen dopamin är en viktig regulator GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamin påverkar GSIS negativt autokrin/parakrin via åtgärder på dopamin D2-liknande receptorer (D2, D3, D4 receptorer) uttrycks på ytan av beta bukspottkörtelns celler8 , 16 , 19. använda denna analys, vi bekräfta dopamins roll som en negativ regulator av GSIS och visa att den dopamin D2-som receptor agonister bromokriptin och quinpirole också minska GSIS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well white half area plate</td>
			<td style="width:104px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:139px;">82050-042</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-well white low-volume, round-bottom plate</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td>15100157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin High Range Kit</td>
			<td style="width:104px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:139px;">62IN1PEH&#160;</td>
			<td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PHERAstar FSX plate reader</td>
			<td style="width:104px;">BMG Labtech</td>
			<td>FSX</td>
			<td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plate sealers</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">DY992</td>
			<td>To seal plate while antibodies incubate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:104px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:139px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11875-093</td>
			<td>[+] L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 0.05%&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">25-052-CI</td>
			<td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">21-031-CV</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">156-30-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin solution 100x</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">30-002 CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">M1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dopamine hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">8502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromocriptine mesylate</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(-)-Quinpirole hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:139px;">12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

Påvisande av insulinutsöndringen är kritisk för klarlägga mekanismer av reglerade sekretion samt som i studier av metabolism. Även om många insulin analyser har funnits i decennier, har nyligen tillkomsten av homogena tid-löst Förster resonans energi överföring (HTRF) teknik avsevärt förenklat dessa mätningar. Detta är en snabb, kostnadseffektiv, reproducerbar och robusta optiska analys beroende av antikroppar konjugerat med ljusa fluorophores med långvarig utsläpp som underlättar tid-löst Förster resonans energi överföring. HTRF insulin upptäckt är dessutom mottagliga för utveckling av high-throughput screening analyser. Här använder vi HTRF för att upptäcka insulinutsöndringen i INS-1E celler, en råtta insulinom-derived cellinje. Detta tillåter oss att uppskatta basala nivåer av insulin och deras förändringar som svar på glukos stimulering. Dessutom, använder vi detta system för upptäckt av insulin för att bekräfta rollen av dopamin som en negativ regulator av glukos-stimulerade insulinsekretionen (GSIS). På ett liknande sätt, andra dopamin D2-som-receptoragonister, quinpirole och bromokriptin, minska GSIS på ett koncentrationsberoende sätt. Våra resultat belysa nyttan av formatet HTRF insulin analys för att fastställa rollen av många läkemedel i GSIS och deras farmakologiska profiler.

Vi validerat våra insulin HTRF analys genom att generera en insulin standardkurvan med renat humaninsulin standarder av fördefinierade koncentrationer (figur 2). Generation av standardkurvan låtit oss att extrapolera proportionerlig fluorescens avläsningar och därmed avgöra utsöndrade insulinnivåerna i svar till läkemedelsbehandlingar (figur 2). Intraplate variation för kurva montering var minimal (R2</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Homogen tid-löst Förster resonans energi överföring-baserad analys för detektion av insulinsekretionen

Här presenterar vi homogen tid löst FRET (HTRF) som en effektiv metod för snabb upptäckt av insulin utsöndras från celler.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion och Detektering av reaktiva syreradikaler (ROS) i cancer

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Förbättra IV Insulin Administration i ett Community Hospital

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminiscens Imaging (CLI) för cancerbehandling övervakning

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Analys av extracellulärt protein interaktioner som kan påverka insulinutsöndringen från betacellerna i bukspottkörteln

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Kombinerade Intravital mikroskopi och kontrastförstärkt ultraljud av mus bakbenet för att studera Insulin-inducerad vasodilatation och muskel Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla

Hjärt magnetisk resonanstomografi på 7 Tesla

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Studera hypotalamus Insulin signalen till perifera glukosintolerans med en kontinuerlig drog infusionssystemet in i musen hjärnan

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Endotoxin aktivitet analys för detektion av helblod endotoxemia hos kritiskt sjuka patienter

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mekanismerna bakom Gut hormon sekretion använder den isolerade perfusion råtta tunntarmen

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Hjärtmagnetisk resonans för utvärdering av misstänkt Hjärttromb: konventionell och framväxande teknik

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...