Name: homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Yazarlar ifşa gerek yok.

1. INS-1E hücreleri: bakım ve kaplama
<ol><li>INS-1E hücreleri oksijen 37 ˚C/5% CO2 kuluçka ve kültürlü RPMI 1640 orta ile %5 (v/v) ısı inaktive fetal sığır serum ile 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin/streptomisin takıma korumak çözüm, 50 µM β-mercaptoethanol. 10 mL tam RPMI 1640 orta (plaka), başına hücrelerde kültür % 80-90 izdiham ulaşana kadar ne zaman onlar trypsinized ve pasajlı veya insülin salgısı tahlil için kullanılan.</li>
	<li>
<...

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

Burada açıklanan HTRF insülin tahlil insülin salgılanması kültürlü hücre tabanlı sistemden ölçmek için hızlı, verimli bir sistem sunmaktadır. En önemli avantajları arasında bu tahlil yüksek sinyal gürültü oranı nedeniyle düşük arka plan sinyal sunmaktadır. Buna ek olarak, biz HTRF sinyal uzun bir süre için kararlı olduğunu doğruladı (> 24 h)7. Yine de, insülin bağlama monoklonal antikorlar, hızlı bir şekilde tahlil için ek sonra bağlama doygunluk ulaşmak ...

Enerji metabolizmasının büyük bir anabolik hormon tarafından insülin ince ayar. İnsülin sentezlenmiş ve yanıt olarak artan hücre dışı şekeri pankreas beta hücreleri tarafından yayımlanan. Yayımlanan insülin glukoz alımını insülin duyarlı dokular1,2tarafından tetikler. Fizyolojik açıdan, bu glikoz konsantrasyonu glukoz alımını düzenleyen insülin salgılanmasını tarafından takip bir yemekten sonra yükselmesine bağlı olduğu. İnsülin direnci ile sonuçlanan metabolik bozukluklar glikoz homeostazı bozuklukları neden olabiliyor ve sonuçta, tip 2 diyabet2,3,4başlangıcı.
Her ne kadar insülin salgılanması kapsamlı eğitimi aldı, onun düzenleyici mekanizmaları kötü anlaşılır kalır. Soruşturmanın kritik bir alan kimliği roman modülatörler insülin salgılanması beta hücreleri5,6,7,8tarafından olmuştur. Bu çalışmalar glikoz stimülasyon ve insülin salgılanması kaplin ilişkisi daha iyi anlaşılmasını gerektirir. Bu nedenle, doğru bir şekilde izlemek ve glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) düzeylerini ölçmek için yetenek gerekli olmuştur. Bugüne kadar ancak, sınırlı sayıda yöntemleri GSIS insülin salgılayan hücre satırları ve/veya pankreas adacıkları kullanarak miktar izin vermek mevcut idi. Radioimmunoassay (RIA), hangi Radyoizotop öğesini insülin ve antikorlar biridir. Bu yaklaşımın ana sınırlamaları nedeniyle işleme ve bertaraf radyoaktif malzemelerin güvenlik sorunları içerir. Ayrıca, bu emek yoğun, birden çok uzun çamaşır ve kuluçka adımları içeren bir yöntemdir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) insülin algılama için antikorlar kullanan başka bir pahalı ve emek yoğun bir yaklaşımdır. Varyasyon antikor benzeşim ve insülin tanıma verimliliğini faktörler bu yöntemin sınırlama var ve tekrarlanabilirlik sonuçları etkileyebilir. Ne ELISA ne de RIA yüksek üretilen iş deneyler için tasarlanmıştır. AlphaScreen algılama ve insülin salgılanması düzeylerini ölçmek için kullanılan homojen bir tahlil olduğunu. AlphaScreen teknoloji ortam oksijen dönüşüm Kemiluminesan üretimi kaynaklanan chemiluminescent türleri ile tepki verebilir bir heyecanlı oksijen singlet durumuna dayanır. Tahlil homojen olduğundan, RIA ve ELISA ile ilgili çamaşır adımlardan ortadan kalkar. Ancak, sinyal tepki doğası gereği istikrarsızlık tahlil okuma etkileyebilecek bir sınırlayıcı faktördür. (TR-KISKAÇ, Heyduk ve meslektaşları9tarafından geliştirilen başka bir homojen insülin molekül üzerinde farklı epitopları için iki ayrı antikorların bağlama göre insülin ölçüm yaklaşımdır. Antikorlar her kimyasal olarak bağlantılı çift telli DNA'sı ile kısa tamamlayıcı tek iplikçikli DNA çıkıntılar vardır. İnsülin antikorları bağlama onları bir araya getirir ve bir çift telli DNA dubleks için yol açar. Her antikor da ilgili bir donör veya alıcısı fluorophore ile ilişkilidir ve DNA çift yönlü Derneği Förster rezonans enerji transferi (FRET) oluşturmak için bu fluorophores buluşturuyor. TR-KISKAÇ, bir potansiyel sınırlama ancak, perde ile aittir. Arka plan Floresans FRET reaksiyon sırasında hızla dağılmaya yetersizlik arka plan Floresans nispeten yüksek düzeyde ve düşük sinyal gürültü oranı tahlil içinde neden olabilir. Bu nedenle, bir ihtiyaç GSIS bir yüksek-den geçerek şekilde miktarının için güvenilir, sağlam ve uygun maliyetli bir tahlil için devam eder.
Biyofizik son gelişmeler bir homojen zaman çözüldü floresan enerji rezonans transferi (HTRF) dayalı tahlil gelişiminde sonuçlandı. Enerji aktarım içinde özellikle, tahlil daha doğru bir şekilde donör ve alıcısı arasındaki enerji transferi ışınımsal olmayan ışıma enerji rezonans transferi (LRET)10 HTRF dayanan FRET dayalı olarak açıklanan olabilir tür11,12,13. Bu ayrım bir floresan zamanlama beri önemli, ya da perdeleme aynı türleri FRET ve LRET için kullanılan temel perde etkileşim Şoklama LRET için daha çok farklı olsa da. Ayrıca, nadir toprak lanthanide cryptate kullanımı Evropyum gibi maddeler ve birleşimler veya uzun floresan yarı-hayat12,14HTRF terbium cryptate üretir. Bu belirli bir gecikme süresiyle (µsn) donör uyarma ve alıcısı (Yani, zaman çözüldü tahlil) emisyon ölçümü arasında giriş benzersiz avantajı sunuyor. Bu gecikme süresini alıcısı emisyon Floresans ölçüm önce dağılımı arka plan floresan için yeterli zaman sağlar. Sonuç olarak, okuma non-spesifik Floresans ücretsiz ve böylece, bir yüksek sinyal gürültü oranı elde edilir mi (şekil 1). Ayrıca, HTRF homojen doğası çok tahlil yapmak ilişkisiz türler ELISA veya RIA tabanlı yöntemleri daha daha fazla hızlı yıkama adımları yıkamak için gereksinimini ortadan kaldırır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Şekil 1: HTRF insülin algılama için mekanizmasının şematik. İki bağımsız olarak oluşturulan monoklonal antikorlar özellikle tanımak ve insülin ayrı sitelerde bağlayın. Bu antikorlar Evropyum cryptate donör veya XL665 alıcısı için Birleşik. Uyarma 337 nm sonuçlara emisyon 620, içinde bağış nm. Elde edilen enerji transferi bir daha uzun dalga boyu, 665 yayılmasını sağlamak XL665 neden olan nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Burada, detaylı bir protokol sağlar GSIS INS-1E hücrelerden düzeylerini belirlemek için HTRF dayalı bir yaklaşım kullanmak için insülinoma hücre satır15sıçan bir iyi kurulmuş insülin salgılayan beta hücre kaynaklı. Buna ek olarak, bu tahlil insülin salgılanması moleküler düzenleyiciler farmakolojik profili tanımlamak için kullanılabilir. Dopamin D2incelemek için bu HTRF tabanlı insülin testin uyguladığımız-reseptör düzenleme GSIS, hangi tarihlerde. Artan çalışmalar nörotransmitter dopamin GSIS8,16,17,18,19,20, önemli bir düzenleyicisidir indirdik 21 , 22. dopamin bir negatif otokrin/parakrin şekilde dopamin D2eylemler yoluyla GSIS etkiler-tarihlerde beta pankreas hücreleri8 yüzeyde ifade reseptörleri (D2, D3, D4 reseptörleri) , 16 , 19. bu tahlil kullanarak, biz GSIS olumsuz bir düzenleyici olarak dopamin'ın rolü onaylamak ve gösteren dopamin D2-reseptör agonistleri bromokriptin ve quinpirole da GSIS azaltmak gibi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well white half area plate</td>
			<td style="width:104px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:139px;">82050-042</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-well white low-volume, round-bottom plate</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td>15100157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin High Range Kit</td>
			<td style="width:104px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:139px;">62IN1PEH&#160;</td>
			<td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PHERAstar FSX plate reader</td>
			<td style="width:104px;">BMG Labtech</td>
			<td>FSX</td>
			<td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plate sealers</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">DY992</td>
			<td>To seal plate while antibodies incubate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:104px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:139px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11875-093</td>
			<td>[+] L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 0.05%&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">25-052-CI</td>
			<td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">21-031-CV</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">156-30-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin solution 100x</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">30-002 CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">M1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dopamine hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">8502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromocriptine mesylate</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(-)-Quinpirole hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:139px;">12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

İnsülin salgılanması tespiti düzenlenmiş salgılanmasını de çalışmalar olduğu gibi metabolizma elucidating mekanizmaları için önemlidir. Çok sayıda insülin deneyleri yıllardır varmışsın, homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi (HTRF) teknolojisi son gelişiyle önemli ölçüde bu ölçümler basitleştirdi. Bu hızlı, uygun maliyetli, tekrarlanabilir ve güçlü optik tahlil zaman çözüldü Förster enerji rezonans Transfer kolaylaştırır uzun süreli emisyon ile parlak fluorophores için Birleşik antikorları üzerine bağımlı olduğunu. Ayrıca, HTRF insülin algılama yüksek üretilen iş tarama testleri geliştirme için mükellef olduğunu. Burada HTRF insülin salgılanması INS-1E hücrelerde, bir sıçan insülinoma türetilmiş hücre kültürünü algılamak için kullanır. Bu bize Bazal düzeyde insülin ve glikoz stimülasyon cevaben yaptıkları değişiklikleri tahmin etmek izin verir. Buna ek olarak, bu insülin algılama sistemi dopamin rol glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) negatif bir düzenleyici olarak onaylamak için kullanın. Benzer bir şekilde, diğer dopamin D2-reseptör agonistleri, quinpirole ve bromokriptin, GSIS bir konsantrasyon bağımlı şekilde azaltmak gibi. Sonuçlarımız HTRF insülin tahlil biçiminin GSIS ve farmakolojik kendi profilleri çok sayıda uyuşturucu rolünü belirlemede yardımcı programı vurgulayın.

Biz bizim insülin HTRF tahlil önceden tanımlanmış konsantrasyonları (Şekil 2) saf insan insülin Standartlar kullanılarak bir insülin standart eğri üreterek geçerliliği. Üretimi ratiometric floresan okuma ulaşmak için bize izin verilen standart eğri ve bu nedenle ilaç tedavileri (Şekil 2) yanıt olarak salgılanan insülin düzeylerini belirlemek. Intraplate değişim eğrisi montaj için en az (R...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

Burada, homojen mevcut zaman hücrelerden salgılanan insülin hızlı algılama için etkili bir yöntem olarak FRET (HTRF) çözüldü.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Kanserler Üretim ve reaktif oksijen türlerinin (ROS Algılama)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Bir Topluluk Hastanesi IV insülin uygulaması Geliştirilmesi

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Kanser Tedavisi İzleme Cerenkov Lüminesans Görüntüleme (CLI)

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Intravital mikroskobu ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi fare Hindlimb, insülin kaynaklı vazodilatasyon ve kas perfüzyon çalışmaya kombine

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla

7 Tesla, kardiyak manyetik rezonans görüntüleme

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Hipotalamik insülin sinyal fare beyin içine sürekli uyuşturucu infüzyon sistemi ile periferik glikoz intoleransı için eğitim

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Eleştirel hasta hastalarda tam kan endotoksemi tespiti için endotoksin aktivite assay

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Gut hormonu salgılanması izole kullanarak temel mekanizmaları fare bağırsağı periosteum

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Şüpheli kardiyak Trombülerin değerlendirilmesi için kardiyak manyetik rezonans: konvansiyonel ve gelişmekte olan teknikler

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...