Name: visualization of motor axon navigation and quantification of axon arborization in mouse embryos using light sheet fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00
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LSFM experimentos e análise de dados foram realizadas em parte usando os avançados microscópios óticos do divisão de instrumento serviço na Academia Sinica e com o auxílio do MS. Shu-Chen Shen. Agradecemos a Sra. Sue-Ping Lee do Imaging Core Facility do IMB considerável assistência técnica com análise de imagem hottie. Científico Inglês edição núcleo do IMB reviu o manuscrito. Este trabalho é financiado pela Academia Sinica prêmio de desenvolvimento de carreira (CDA-107-L05), mais (104-2311-B-001-030-MY3) e INDH (INDH-EX106-10315NC).

Todos os animais foram mantidos em uma patógeno específico livre (SPF) animal facilidade, aprovado e supervisionado por IACUC da Academia Sinica.
1. fixação
<ol><li>Coletar embriões de dia embrionário 12,5 (E12.5) em seguida, decapitar e acabo com eles.</li>
	<li>Fixar os embriões individualmente em placas de 24 poços com 1ml/bem de acabadas paraformaldeído 4% em 1x salino de tampão fosfato (PBS) durante a noite. Incube a 4 ° C, um agitador.</li>
	<li>Lave os embriões fixos pelo ...

<ol>
	<li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+spinal+motor+neurons.">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li><li>Stifani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+the+generation+of+spinal+motor+neuron+diversity.">Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity.</a> Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).</li><li>Kania, A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+motor+projections+in+the+limb+imposed+by+LIM+homeodomain+protein+regulation+of+ephrin-A:EphA+interactions.">Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions.</a> Neuron. 38, 581-596 (2003).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+gene+Pea3+controls+the+central+position+and+terminal+arborization+of+specific+motor+neuron+pools.">ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35, 877-892 (2002).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).</li><li>Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Nerve+Arborization+Requires+Proteolytic+Domain+of+Damage-Induced+Neuronal+Endopeptidase+(DINE)+during+Development.">Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development.</a> J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).</li><li>Nagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECEL1+mutation+implicates+impaired+axonal+arborization+of+motor+nerves+in+the+pathogenesis+of+distal+arthrogryposis.">ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis.</a> Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).</li><li>Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Proteins+Coordinate+Motor+Neuron+Differentiation+and+Connectivity+Programs+through+Ret/Gfralpha+Genes.">Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes.</a> Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).</li><li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ret+is+a+multifunctional+coreceptor+that+integrates+diffusible-+and+contact-axon+guidance+signals.">Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals.</a> Cell. 148, 568-582 (2012).</li><li>Tung, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir-17+approximately+92+Governs+Motor+Neuron+Subtype+Survival+by+Mediating+Nuclear+PTEN.">Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.</a> Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>Hanley, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+Pbx-Dependent+Pathways+Govern+the+Coalescence+and+Fate+of+Motor+Columns.">Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns.</a> Neuron. 91, 1005-1020 (2016).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity.">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li><li>Li, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+filters+Hox+temporal+transcription+noise+to+confer+boundary+formation+in+the+spinal+cord.">MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14685 (2017).</li><li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples.">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li><li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+whole-embryo+imaging:+a+quantitative+transition+is+underway.">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li><li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop.">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li></ol>

Diversas etapas no protocolo podem ser sujeitas a alterações em determinadas circunstâncias. Por exemplo, a duração da fixação depende da idade dos embriões, variando entre 2 h e 1 ou mais dias usando paraformaldeído acabadas. Desde que a fixação é feita antes de toda montagem imunocoloração, para anticorpos que são sensíveis à proteínas de reticulação, metanol pode ser usado como um agente fixador alternativo. Para uma relação sinal / ruído elevada após coloração, é necessário otimizar a conc...

MNs da coluna vertebral são a parte do sistema nervoso central mas inervam músculos periféricos para controlar o movimento. Na medula espinhal em desenvolvimento, progenitores de MN (PMN) são estabelecidas de acordo com os sinais que emana a notocorda e somitas adjacentes. Todos diferenciados MNs pós mitóticas então gerados a partir de PMN, eventualmente, dando origem a uma série de subtipos de MN ao longo do eixo de rostrocaudal da medula espinhal,1,2. MNs espinhais são topograficamente e anatomicamente bem organizados. Seu arranjo morfológico correlaciona-se com a posição de seus respectivos na periferia3. Ao atingir suas metas de músculo, axônios recebem fatores celulares e exógena neurotrophic que induzem-los a estender e um ramo ainda mais em músculos. Inervação e ramificação defeitos podem contribuir para a falha para formar junções neuromusculares (JNM). Por exemplo, fatores de neurotrófico derivado de glia (GDNF)-Pea3 induzido é indispensável para a arborização de axônio em cutâneo maximus (CM) e latissimus dorsi (LD) músculos4,5. Além disso, embriões de rato de nocaute DINE mostram defeituosa arborização dos nervos frênico no diafragma, causando mortalidade e insuficiência respiratória, imediatamente após o nascimento,6,7. Portanto, esta última etapa de maturação MN (ou seja, projeção axonal e ramificação) é fundamental para garantir a comunicação entre os neurônios e células-alvo.
Para ver os padrões de arborização, pesquisadores normalmente conduzir imagem latente confocal ou microscopia de luz de dois fotões de fluorescência das amostras seccionado ou toda a montagem8,9,10. Ambas estas técnicas de microscopia geram aceitável resolução e profundidade de penetração. Microscopia de fluorescência de dois fotões de luz envolve excitação de fluorophores por absorção simultânea de dois fótons de baixa energia11. Desde que dois fotões excitação usa radiação infravermelha, a frequência de diminuição da excitação contribui para a dispersão reduzida e melhor penetração de tecido até 1 mm de tecido, permitindo imagens com maior profundidade. Microscopia confocal remove pelos filtros do fora-de-foco sinais e apenas recolhe a luz dentro do plano focal12. Com esta abordagem, imagens das amostras dos diferentes planos focais podem ser combinadas para produzir uma imagem de tridimensional (3D) através de uma função de Z-pilha. Não obstante, intensidade de sinal é reduzida como a maioria da luz é bloqueada e altas aberturas numéricas obscurecem o profundidade de campo. Mais importante, ambas as técnicas contribuem para a grave Fotodano e fototoxicidade desde o espécime recebe iluminação mesmo quando apenas um avião é fotografado em um determinado momento.
Para contornar essas deficiências, LSFM tornou-se uma alternativa favorecida, com as vantagens de ser rápido, luz eficiente e menos fototóxico13,14. Além disso, o LSFM permite múltipla visualização imagem. Esta abordagem é particularmente adequada para visualização motor axônios e seus terminais de dispersão como eles se espalharam através do espaço 3D. LSFM supera as outras duas opções, porque as amostras são montadas em um palco que permite a rotação em torno de um eixo vertical e movimentos ao longo o x, y e z eixos. Esta montagem não só permite uma visão minimamente bloqueada da amostra, mas também a escolha de um caminho de iluminação desejável, uma lacuna de microscopia confocal e de dois fotões, ambos dos quais requerem montagem de amostras em uma corrediça plana. Portanto, LSFM é a ferramenta mais adequada para imagens 3D de arborização de axônio e para a quantificação dos terminais do nervo motor em embriões do rato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hb9::GFP</td>
			<td>The Jackson labortory</td>
			<td>005029</td>
			<td>Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-GFP</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>4745-1051</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11015</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.47 clearing reagent</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>RC147001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml micro tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 wells plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 SA Tweezer</td>
			<td>ideal-tek</td>
			<td>3480641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors striaght sharp/sharp</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BC110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery Scalpels, single use</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BA365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TKS</td>
			<td>RS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightsheet Z.1 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.0 image analysis software</td>
			<td>Bitplane, Zurich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of motor axon navigation and quantification of axon arborization in mouse embryos using light sheet fluorescence microscopy

Os neurônios motores da coluna vertebral (MNs) estender seus axônios para se comunicar com seus alvos innervating, assim, controlar movimentos e tarefas complexas em vertebrados. Assim, é fundamental para descobrir os mecanismos moleculares de como motor axônios navegue até aterraplenar e inervam os seus músculos periféricos alvos durante o desenvolvimento e degeneração. Apesar de linhas de rato transgénicas Hb9::GFP tem servido por muito tempo a visualização trajectórias axônio motor durante o desenvolvimento embrionário, descrições detalhadas de todo o espectro de arborização terminal axônio permanecem incompletas devido à complexidade do teste padrão e limitações de microscopia óptica atual. Aqui, descrevemos um protocolo melhorado que combina microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) e análise de imagem robusta, qualitativa e quantitativamente Visualizar desenvolvimento motor axônios. Este sistema pode ser facilmente adotado para cruzar mutantes genéticos ou modelos de doença MN com linhas Hb9::GFP , revelando novos mecanismos moleculares que levam a defeitos de navegação axônio motor e arborização.

LSFM fornece visualização 3D detalhada de arborização de trajetória e axônio MN no mouse embriões. Sob campo claro, tecidos aparecem completamente transparentes após ter sido mergulhado no reagente de compensação comercial. Nenhum encolhimento ou inchaço da amostra foi notado após uma semana de armazenamento no reagente antes de imagem de compensação. Canal de fluorescência, neurônios motores são rotulados com GFP transgenicamente expressa (filme 1). Em a...

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Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

Estudo Influência Heterogeneidade células gliais no crescimento Axon Usando um método de co-cultura New

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Neurociência

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

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Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

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Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...