Name: visualization of motor axon navigation and quantification of axon arborization in mouse embryos using light sheet fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy at JoVE.com

LSFM экспериментов и анализ данных проводились в части с помощью передовых оптических микроскопов службу отдела инструмент в Синика и при содействии г-жи Шу-Чэнь Шэн. Мы благодарим г-жа Сью-пинг ли от Imaging основного объекта IMB для значительной технической помощи с анализа изображений Imaris. IMB научных Английский редактирования основных рассмотрел рукопись. Эта работа финансируется Academia хвощевой карьеры развитию премии (CDA-107-L05), наиболее (104-2311-B-001-030-MY3) и национальных правозащитных учреждений (НПУ-EX106-10315NC).

Все живые животные хранились в конкретного возбудителя бесплатно (SPF) животных фонда, утвержденных и контролируется IACUC Синика.
1. Фиксация
<ol><li>Собирать эмбрионов эмбриональных день 12,5 (E12.5) затем обезглавить и потрошение их.</li>
	<li>Исправьте эмбрионы индивидуально в 24-ну ?...

<ol>
	<li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+spinal+motor+neurons.">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li><li>Stifani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+the+generation+of+spinal+motor+neuron+diversity.">Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity.</a> Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).</li><li>Kania, A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+motor+projections+in+the+limb+imposed+by+LIM+homeodomain+protein+regulation+of+ephrin-A:EphA+interactions.">Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions.</a> Neuron. 38, 581-596 (2003).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+gene+Pea3+controls+the+central+position+and+terminal+arborization+of+specific+motor+neuron+pools.">ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35, 877-892 (2002).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).</li><li>Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Nerve+Arborization+Requires+Proteolytic+Domain+of+Damage-Induced+Neuronal+Endopeptidase+(DINE)+during+Development.">Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development.</a> J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).</li><li>Nagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECEL1+mutation+implicates+impaired+axonal+arborization+of+motor+nerves+in+the+pathogenesis+of+distal+arthrogryposis.">ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis.</a> Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).</li><li>Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Proteins+Coordinate+Motor+Neuron+Differentiation+and+Connectivity+Programs+through+Ret/Gfralpha+Genes.">Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes.</a> Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).</li><li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ret+is+a+multifunctional+coreceptor+that+integrates+diffusible-+and+contact-axon+guidance+signals.">Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals.</a> Cell. 148, 568-582 (2012).</li><li>Tung, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir-17+approximately+92+Governs+Motor+Neuron+Subtype+Survival+by+Mediating+Nuclear+PTEN.">Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.</a> Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>Hanley, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+Pbx-Dependent+Pathways+Govern+the+Coalescence+and+Fate+of+Motor+Columns.">Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns.</a> Neuron. 91, 1005-1020 (2016).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity.">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li><li>Li, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+filters+Hox+temporal+transcription+noise+to+confer+boundary+formation+in+the+spinal+cord.">MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14685 (2017).</li><li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples.">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li><li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+whole-embryo+imaging:+a+quantitative+transition+is+underway.">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li><li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop.">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li></ol>

Несколько шагов в протоколе могут подвергаться изменениям при определенных обстоятельствах. Например длительность фиксации зависит от возраста эмбрионов, колеблется от 2 h 1 или более дней, используя свежеприготовленные параформальдегида. Так как фиксация осуществляется до вся гора и...

MNs позвоночника являются частью центральной нервной системы, но иннервируют периферийных мышцы для контроля движения. В развивающихся спинного мозга MN прародителями (ПНЛ) устанавливаются согласно сигналы, исходящие от хорда и смежные сегменты. Все продифференцировано пост митотическая MNs затем создаются из ПНЛ, в конечном счете порождает ряд подтипов MN вдоль оси rostrocaudal спинного1,2. Позвоночника MNs топографически и анатомически хорошо организованы. Расположение их морфологические коррелирует с позиции их соответствующих целевых в периферии3. По достижении их целей мышц, аксоны получать сотовой и экзогенных нейротрофических факторов, которые побудить их расширения и филиал в мышцы. Иннервация и ветвления дефекты могут способствовать несоздания нервно развязок (NMJ). Например, глиальные нейротрофического факторы (GDNF)-индуцированной Pea3 является необходимым условием для арборизация аксона в кожный maximus (см) и мышцы, широчайшая мышца спины (LD)4,5. Кроме того рестораны нокаут мыши эмбрионов показывают дефектных арборизация диафрагмального нервов в диафрагмы, вызывая дыхательной недостаточности и смертности сразу же после рождения6,7. Таким образом этот последний шаг MN созревания (то есть, аксональное проекции и ветвление) имеет решающее значение для обеспечения связи между нейронами и клеток-мишеней.
Чтобы просмотреть шаблоны арборизация, исследователи обычно проводят конфокальная томография или легкие микроскопии флуоресцирования двух Фотон секционного или целое гора образцов8,9,10. Оба эти методы микроскопии генерировать приемлемое разрешение и глубину проникновения. Световой микроскопии флуоресцирования двух Фотон предполагает возбуждения флуорофоров одновременное поглощение двух нижнего энергии фотонов11. Поскольку два Фотон возбуждения использует ближнего инфракрасного излучения, снижение возбуждения частоты способствует уменьшение рассеяния и лучшего проникновения ткани до 1 мм в ткани, таким образом позволяя изображений с большей глубиной. Конфокальная микроскопия удаляет фильтры из фокус сигналов и только собирает свет в пределах фокальной плоскости12. С этим подходом изображения образцов из разных фокальной плоскости могут быть объединены для получения трехмерных (3D) изображения через функцию Z-стека. Тем не менее интенсивность сигнала снижается, как большинство свет блокируется и высокой численного отверстия закрывают глубина резкости. Что еще более важно обе методики способствуют тяжелые фотоповреждения и Фототоксичность поскольку весь образец получает свечение, даже тогда, когда только один самолет отображаемого в данный момент.
Чтобы обойти эти недостатки, LSFM стал благоприятствования альтернативы, с преимуществами, быстро, эффективно свет и меньше фототоксических13,14. Кроме того LSFM позволяет нескольких изображений. Этот подход особенно подходит для визуализации мотор аксонов и их диспергирования терминалы, как они распространились в трехмерном пространстве. LSFM превосходит другие два варианта, поскольку образцы устанавливаются на сцене, которая позволяет вращение вокруг вертикальной оси и движения вдоль x, y и z оси. Эта установка позволяет не только минимально заблокированных вид образца, но и выбор желательной освещение пути, недостаток двух фотонов и конфокальная микроскопия, оба из которых требуют монтажа образцов на слайде плоских. Таким образом LSFM является наиболее подходящим инструментом для 3D визуализации арборизация аксона и количественного определения двигательного нерва терминалов в эмбрионов мыши.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hb9::GFP</td>
			<td>The Jackson labortory</td>
			<td>005029</td>
			<td>Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-GFP</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>4745-1051</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11015</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.47 clearing reagent</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>RC147001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml micro tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 wells plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 SA Tweezer</td>
			<td>ideal-tek</td>
			<td>3480641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors striaght sharp/sharp</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BC110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery Scalpels, single use</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BA365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TKS</td>
			<td>RS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightsheet Z.1 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.0 image analysis software</td>
			<td>Bitplane, Zurich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of motor axon navigation and quantification of axon arborization in mouse embryos using light sheet fluorescence microscopy

Мотонейронов спинного мозга (MNs) расширить их аксоны общаться с их innervating цели, тем самым контроль движения и сложные задачи в позвоночных. Таким образом важно выявить молекулярные механизмы как Мотор аксоны перейдите к arborize и иннервируют их периферические миорелаксанты цели во время разработки и дегенерации. Хотя трансгенных линий мыши Hb9::GFP долго служил для визуализации траекторий двигателя аксона во время эмбрионального развития, подробные описания полного спектра терминала арборизация аксона остаются неполными ввиду сложности шаблон и ограничения текущей оптической микроскопии. Здесь мы описываем улучшение протокол, который сочетает в себе свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) и анализ надежной изображений и количественно и качественно визуализировать развивающихся мотор аксоны. Эта система может быть легко принял пересечь генетических мутантов или MN болезни модели с Hb9::GFP линиями, раскрывая новые молекулярные механизмы, которые приводят к дефектам в мотор аксона навигации и арборизация.

LSFM предоставляет подробные 3D визуализация MN траектории и аксон арборизация в мыши эмбрионов. Под ярким полем тканей появляются полностью прозрачным после погружения в коммерческой очистки реагента. Нет усадки или припухлость образца было замечено после хранения в о?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Здесь мы описываем протокол для визуализации мотонейрона проекции и аксон арборизация в трансгенной эмбриона мыши Hb9::GFP . После иммуноокрашивания для двигательных нейронов мы использовали свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения эмбрионов для дальнейшего количественного анализа. Этот протокол применяется к другим процессам навигации нейрон в центральной нервной системе.

Визуализация мотор Axon навигации и количественной оценки Axon арборизация эмбрионов мыши, с помощью микроскопии флуоресцирования света лист

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

Исследование глиальных Влияние неоднородности сотовый на рост Axon Использование нового метода Coculture

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Микронного масштаба Разрешение оптической томографии целых мозг мышей с конфокальной Light Sheet микроскопии

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Всего монтажа Визуализация эмбриона мыши Сенсорная Axon прогнозам

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Нервно-мышечном соединении: Synapse размер измерение, фрагментации и изменения в синаптической белка плотности с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Са изображений<sup&gt; 2+</sup&gt; Динамика колбочек аксонов мыши Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Использование Комбинированные методики для определения роли плазмалеммы доставкой в ​​Axon ветвление и морфогенеза нейронов

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Четырёхкратное иммуноокрашивание обонятельной луковицы для визуализации обонятельных сенсорных аксонов Молекулярные коды идентичности

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Визуализация Thalamocortical аксона ветвления и синапса формирования в Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Следственный млекопитающих Axon регенерации: В Vivo электропорации взрослых мыши Спинной корень ганглия

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

На месте Визуализация роста аксонов и динамики конуса роста в культурах эмбриональных срезов мозга Ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...