Name: antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids at JoVE.com

J.H.N.، يد وم الاعتراف بالتمويل عن طريق برنامج FW7 الاتحاد الأوروبي (سينبيبتيدي). واو-ج. س. وأمورنا نعترف بالتمويل من جانب الوزارة الاتحادية للتعليم والعلوم (برنامج الفدرالية "HSP 2020"، والمشروع ويميبلوس تو سينتوبيو) ومؤسسة البحوث الألمانية (الكتلة للتميز "مفاهيم أونيفيينج في الحفز").

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

باستخدام SPI لإدراج النظير برولين، هياكل نيسين المستهدفة يمكن إلى حد كبير تعديل، إنشاء متغيرات الببتيد الرواية مع تركيبات تسلسل فريدة وخصائص المواد الكيميائية. وبهذه الطريقة، الحد الأساسي لتكنولوجيا الجينات الكلاسيكية يمكن التحايل عليها، التي هي مقيدة لكيمياء سلسلة جانبية من الهيئة 20. في فيفو الكيميائية تنويع نيسين كما يتضح أعلاه يدل على نهج عام لتكمل بتمس الطبيعية وتعزيز هائلة المساحة الكيميائية من ريبس. ونحن نعتقد أن توسيع مرجع الأحماض الأمينية الطبيعية يحمل وعدا كبيرا خاصة بالنسبة للمكاتب الإقليمية للمرأة. في البروتينات، يمكن تحقيق مجموعة هائلة من الوظائف من خلال ترتيب محدد للهيئة 20 في هياكل ثلاثية الأبعاد. مع فقط 7-100 ألف بطول3، سيكون السبل الكفيلة بتحقيق هذه السمات الهيكلية إلا من خلال الهيئة محدودة بالنسبة للمكاتب الإقليمية للمرأة. وبالتالي فإنه ليس من المستغرب أن الامبير الطبيعية في شكل ريبس يشيع على نطاق واسع بوستترانسلاتيونالي معدلة4. وبنفس الطريقة، ncAAs كلبنات البناء البديلة تبشر كبيرة لتحسين المعلمات ميكروبيولوجية والحرائك الدوائية الخاصة بهم (انظر باومان et al. عام 201735 والمراجع فيها).
SPI المنهجية المستخدمة في هذا فوائد العمل من الإعداد التجريبية سهلة نسبيا، والتنفيذ مباشرة وإمكانية تكرار نتائج عالية. سبب استبدال العالمية، من الممكن أيضا إدماج نكا المواقع المتعددة في الببتيدات المستهدفة. من ناحية أخرى، قد لا تكون الطريقة كافية لاستبدال الأحماض الأمينية التي كثيرا ما تحدث في منتج الجين المستهدف. من حيث المبدأ، يمكن تغيير مواقف غير مرغوب فيها بواسطة الطفرات الموجهة من الموقع، ولكن هذه التغييرات إضافية قد تؤثر أيضا على العديد من خصائص أمبير، بما في ذلك هيكل وبيواكتيفيتي. حالما يتوفر سلالة أوكسوتروفيك للإنتاج، يمكن أن يكون اختبار ncAAs عدة دون الحاجة إلى تغييرات واسعة النطاق على الصعيد الوراثي. وعلاوة على ذلك، الطريقة لا تقتصر على أوكسوتروفيك كولاي سلالات، ولكن يمكن أيضا إجراء باستخدام المضيف الإنتاج الطبيعي. على سبيل المثال، أظهرت تشو وآخرون أن SPI لإنتاج رواية ريبس يعمل أيضا بطبيعة الحال الحزب أوكسوتروف L. lactis: استخدام تعريف وسائط الإعلام، وأدرجت ثلاثة التربتوفان النظير في أربعة مواقع في نيسين50.
نظراً للأسلوب SPI ويؤدي إلى استبدال العالمي المختار الجهاز المركزي للمحاسبات نكا، وعموما ينطبق على طائفة واسعة من الببتيدات المستهدفة والبروتينات. مجموعة من أوكسوتروفيك كولاي سلالات يتوفر (راجع الخطوة 1)، السماح للهيئة عدة كل اختبار للاستبدال بواسطة ncAAs. اجتمع النظير إدراج استخدام metA-قصور سلالات (مثلاً، B834(DE3)) هي الأكثر استخداماً. أمثلة من نظائرها Met إيسوستروكتورال أزيدوهوموالانيني (اها) وهوموبروبارجيلجليسيني (Hpg)، ncAAs المتاحة تجارياً التي يمكن أن تدمج كفاءة. كل عرض مقابض بيورثوجونال التي تسمح للحجز على جزيئات تحمل على ألكاين متوافقة أو أزيد وظيفة، على التوالي. على سبيل المثال، يمكن إرفاق الأصباغ الفلورية أو مويتيس البولي إثيلين غليكول (شماعة) من النحاس (I)-حفز أزيد ألكاين سيكلواديشن (كواك)51.
على الرغم من أن كلا أساليب إدماج نكا المؤتلف (SPI والطوائف المنبوذة) عادة تحقيق الهدف كميات كافية، وكثيراً ما تخفض الغلال بالنسبة إلى الإنتاج البرية من نوع المقابلة الببتيدات والبروتينات. كما بورتيس غالباً ما ترتبط بكفاءة الإنتاج، قد تكون خطوات تنقية إضافية المطلوبة، خاصة بالنسبة للأنواع منخفضة وفيرة. في هذه الحالة بالذات لإنتاج نيسين المؤتلف، يبسط التسلسل الزعيم صاحب معلم إلى حد كبير شأن تنقية بتخصيب انتقائية من ليساتيس الخلية. يحسن نقاء وتركيز نيسين تنقية المبينة في هذا البروتوكول، ولكن غالباً ما لا تسفر عن بورتيس أمبير كافية لتحديد العائد ونشاط معين. وإلى جانب ايماك، تشمل أساليب تنقية أمبير استخداماً [هبلك] والتبادل الأيوني اللوني (IEC) وهطول الأمطار (مثلاً. استخدام الأسيتون أو حمض التريكلوروسيتيك (TCA)) أو مزيج منها-أسفر عن نظام تنقية متعددة الخطوات52 . من الجدير أن بهم عادة طبيعة بوليكاتيونيك يمكن أن يسهل تنقية اللجنة الانتخابية المستقلة. التجميد وكثيراً ما يستخدم لتخزين الامبير المنقي.
من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون متاحة تجارياً وبأسعار معقولة ncAAs لإدماجها في المكاتب الإقليمية للمرأة أو التي تنتجها البروتوكولات التوليف الكيميائية البسيطة واستنساخه بسهولة. شرط نفس القدر من أهمية للأسلوب SPI هو أن ncAA المعترف بها، وتنشيط ويتقاضاها aaRS الذاتية أو أعربت عن المشاركة إلى الحمض الريبي النووي النقال المشابهة. وهذا يمكن اختبارها في المختبر بالأحماض الأمينية التنشيط أو الحمض الريبي النووي النقال أمينواسيليشن المقايسة53. كبديل سهل، أجريت على حد سواء في وجود SPI اختبار تعبيرات البروتينات النموذجية مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وفي غياب نكا مكملات يمكن أن يؤديها. وعلاوة على ذلك، تشكل القابلية للذوبان في نفاذية الخلية والمتوسطة النمو، فضلا عن الاستقرار الكيميائي عوامل هامة.
في هذا المثال، تم فحص نشاط مضادات الميكروبات باستخدام سلالة مؤشرات إيجابية. كما تعرب عن بيبتيداسي زعيم نسب، هو حفز الخطوة النهائية لنضوج نيسين. إزالة تسلسل الزعيم (صاحب الموسومة لأغراض تنقية) يمكن أيضا أن يؤديها في المختبر بالمعاملة مع تنقية50 أو التربسين نسب54. خارج نطاق هذا العمل، يمكن بعد ذلك اختبار الكائنات المسببة للأمراض والسلالات المقاومة للأدوية المتعددة لتثبيط والاريثروسين أو جراثيم بالأمبير باستخدام منهجية مماثلة. وتشمل الأنواع المستهدفة ذات الصلة سريرياً هذه الجرثومة والمقاوم بكتريا السل، فري، Acinetobacter baumannii، العقدية الرئوية، و الزائفة الزّنجاريّة و الكلبسيله الرئوية. وإلى جانب نشر لوحة أجار المقايسة المقدمة هنا، النمو تثبيط يمكن إجراء باستخدام الوسائط المناسبة السائل تلقيح مع الأنواع البكتيرية وتستكمل مع أمبير أيضا. استخدام أساليب تمييع مرق، يمكن تحديد تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) استخدام الببتيدات نقية55. يمكن أيضا استخدام مقايسة النشاط المعروضة هنا لتقدير بيواكتيفيتي وفاعلية الحلول التي تحتوي على أمبير بالنسبة للمركبات الإشارة، نيسين المتاحة تجارياً على سبيل المثال.
إنتاج ريبس المؤتلف في كثير من الأحيان ممكناً39، التي تشمل عادة المشارك التعبير عن الجينات PTM. حالما يتم نقل إنتاج سلالة إلى وسيط الحد أدنى كيميائيا محددة أو الاصطناعية التي تحتوي على نكا مناسبة، يجري استبدال الخاصة بالمخلفات من الجهاز المركزي للمحاسبات المقابلة. وهكذا، يمكن أن تنتج ريبس الأخرى بنفس المنهجية، شريطة أن الممكن إنتاجها المؤتلف والظروف ويمكن الاطلاع فيها إدراج نكا و PTM تسفر عن كميات كافية من المنتج المستهدف. علما أن إلى جانب البروتين الخلية المضيفة، الآلية PTM الببتيد التي يمكن أن تصبح أيضا تعديل نكا خلال SPI. ونتيجة لذلك، توقيت الهدف التعبير التعريفي، وطول فترة الحضانة التالية يمكن أن تتطلب التحسين. حيث يمكن أن تؤثر على إدماج نكا الإنزيمات PTM استقرارها والنشاط، إنتاج شأن معالجة يمكن من حيث المبدأ أن تتأثر. تتم الإشارة إلى فعالية إنزيم PTM كافية بتشكيل بريبيبتيدي المجهزة، كما الكشف عنها بواسطة فحوصات مرض التصلب العصبي المتعدد وبيواكتيفيتي. كما عرضت أعلاه، المروجين إيندوسيبلي مختلفة يمكن استخدامها من أجل إنتاج PTM الجينات أولاً (في غياب ncAA) متبوعة بتحريض الجينات الببتيد السلائف في وجود ncAA. بشكل عام، يجب قمعها إنتاج ببتيد المستهدفة التي تحتوي على الجهاز المركزي للمحاسبات قبل إضافة نكا، ولهذا السبب مطلوب القمع ضيق من الجينات السلائف. ضمن هذا البروتوكول، ويتحقق ذلك من خلال القمع تقويضي من خلال إضافة السكر إلى متوسط النمو. لا سيما وأن الإنزيمات PTM المطلوبة لتجهيز بريبيبتيدي تنشأ عادة من مضيف بعيد وراثيا، التعبير درجة الحرارة وكودون استخدام الجينات المقابلة يمكن أن تتطلب الأمثل إذا لم يتم إنتاج المؤتلف المنشأة. من حيث المبدأ، يمكن أن تتداخل وجود ncAAs في بريبيبتيدي مع الاعتراف وتجهيز الإنزيمات PTM، في حالة نيسين نيسبك ونسب. لدمج نكا في المكاتب الإقليمية للمرأة، وبالتالي يوصي بالقيام بتجارب صغيرة التعبير أولاً لتحديد شروط التعبير المناسب والموثوقية لتحليل النشاط أمبير.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">P029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guanidine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0035.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dipotassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P749.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3904.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P030.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-alanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-arginine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3144.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-asparagine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>HN23.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T202.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3467.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3772.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3774.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glycine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3187.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-histidine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3852.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-isoleucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3922.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-leucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-methionine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>9359.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-phenylalanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4491.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-proline</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-serine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4682.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-threonine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T206.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tryptophan</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4858.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tyrosine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-valine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4879.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3746.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">magnesium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">D-glucose</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>6780</td>
			<td style="width:167px;">prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>PN93.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iron(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>372870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">biotin</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3822.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>102792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manganese(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">zinc chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>108816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">immonium orthomolybdate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>7533.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K029.5</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 100 &#181;g/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T832.2</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 50 &#181;g/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3886.1</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 5 &#181;g/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4R)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">(4R)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">(4S)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">(4R)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P074.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ethanol</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>20825.324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;">M17-broth</td>
			<td style="width:123px;">Sigmal-Aldrich, Germany</td>
			<td>56156</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, see Terzaghi BE &#38; Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">agar-agar</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>5210.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nisin from Lactococcus lactis&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">N5764</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, can be used as reference for bioactivity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">imidazole</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3899.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL autosampler vial for LC-MS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formic acid</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">29-0486-31</td>
			<td style="width:167px;">different manufacturers and resins available for IMAC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">0.45 &#181;m bottle top filter unit</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>10040-470</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">0.45 &#181;m syringe filter PVDF membrane</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">CCY1.1</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">luer-lock syringe, PP, 50 ml</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T552.2</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">30120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">TA19</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Nile red</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">72485</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli &#916;proA strain</td>
			<td style="width:123px;">CGSC, Keio collection</td>
			<td style="width:344px;">JW0233-2</td>
			<td style="width:167px;">proline-auxotrophic E. coli K-12 strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli B834(DE3)</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td>69041</td>
			<td style="width:167px;">methionine-auxotrophic E. coli B strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#955;DE3 Lysogenization Kit</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td style="width:344px;">69734-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">bacterial indicator strain, see Khusainov R &#38; Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">5427 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peristaltic pump</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">P1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FPLC system</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">&#196;kta Purifier 10 or the like</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">inverted microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:344px;">TI Eclipse wide-field fluorescence microscope&#160; with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">electron multiplying CCD (EMCCD) camera</td>
			<td style="width:123px;">Andor Technologies, UK</td>
			<td style="width:344px;">Andor Luca&#160;</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fluorescence excitation filter</td>
			<td style="width:123px;">Thorlabs, USA</td>
			<td style="width:344px;">Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC)</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">fluorescence emission filter</td>
			<td style="width:123px;">AHF Analysentechnik, Germany</td>
			<td style="width:344px;">T 560 LPXR</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cover slip 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">LH26.1</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Immersion Oil</td>
			<td style="width:123px;">Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>Immersol 518 F</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">probe sonicator</td>
			<td style="width:123px;">Bandelin, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72</td>
			<td style="width:167px;">200 W maximum HF output</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 &#181;m particle size)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">567227-U</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ESI-TOF coupled to HPLC system</td>
			<td style="width:123px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:344px;">Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids

الطبيعة لديها مجموعة متنوعة من الإمكانيات لإنشاء مهام جديدة من البروتين عن طريق تعديل التسلسل لبنات بناء الأحماض الأمينية الفردية. ومع ذلك، تستند كافة التباينات 20 الأحماض الأمينية الكنسي (الهيئة). كوسيلة لإدخال إضافية الخصائص الفيزيائية الكيميائية البروتينية، يزداد يستخدم دمج الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) في هندسة البروتينات. نظراً لمدة قصيرة نسبيا، تعديل الببتيدات تجميعي مشفر وتعديل بوستترانسلاتيونالي من ncAAs جاذبية خاصة. يمكن إنشاء وظائف جديدة ومقابض الكيميائية بتعديلات محددة من بقايا الفردية. تستخدم طريقة إدماج (SPI) الضغط الانتقائي سلالات المضيف أوكسوتروفيك أن يحرم من الأحماض الأمينية الأساسية في وسائط النمو محددة كيميائيا. يمكن ثم يمكن تنشيطه بواسطة سينثاتيز aminoacyl-الحمض الريبي النووي النقال المقابلة عدة النظير من الأحماض الأمينية متشابهة كيميائيا وهيكليا وتوفير cAA(s) الخاصة بالمخلفات ← ncAA(s) استبدالات في تسلسل الببتيد أو البروتين الهدف. على الرغم من ذلك، في سياق الأسلوب SPI، أدرجت أيضا ncAAs في البروتين المضيف أثناء مرحلة التعبير الجيني المؤتلف، يتم تعيين معظم الموارد للخلية للتعبير عن الجين المستهدف. وهذا يتيح إدراج خاصة ببقايا كفاءة ncAAs غالباً ما يترافق مع كميات كبيرة من المعدل المستهدف. يصف العمل الذي قدم في فيفو إدراج ستة برولين النظير في نيسين الببتيد مضادات الميكروبات، لانتيبيوتيك طبيعة الحال التي تنتجها لاكتيس لاكتوكوككوس. يمكن تغيير خصائص مضادات الميكروبات نيسين وتوسيع أثناء التخمير والتعبير في أوكسوتروفيك الإشريكيّة القولونية سلالات في وسائط النمو المحددة. وبالتالي، يمكن تسليم آثار الاستبدال الخاصة بالمخلفات من الهيئة مع ncAAs التغيرات في نشاط مضادات الميكروبات وخصوصية. فحوصات نشاط مضادات الميكروبات والأسفار الفحص المجهري تستخدم لاختبار المتغيرات نيسين الجديدة لتثبيط النمو من سلالة مؤشرات إيجابية لاكتيس لاكتوكوككوس . يتم استخدام التحليل الطيفي الشامل للتأكد من إدماج نكا في المتغيرات نيسين النشطة بيولوجيا.

هذا البروتوكول يهدف إلى تمكين إنتاج متغيرات معدلة نكا نيسين مع التأسيس الخاصة بالمخلفات من النظير برولين بواسطة الأسلوب SPI. سابقا، أفيد عن المؤتلف إنتاج معدلة تماما البرية من نوع نيسين39جدوى ومردود 24 ملغم/لتر. استخدام الأسلوب SPI، غلة الببتيد/البروتين المستهدف جيدة كثيرا ويمكن أن تصل كميات قريبة من الإنتاج البرية من نوع48. كالتجارب الأولى، ينبغي اختبار البرية من نوع المؤتلف شأن الإنتاج في البلد المضيف أوكسوتروفيك الذي تم اختياره. هنا، برولين أوكسوتروفيك كولاي MG1655 ΔproBA:: frt Δبروك:: frt (DE3) استخدمت كسلالة المضيف. لدمج ncAAs وزراعة وتحريض تكوين التوقيت فضلا عن المتوسط ودرجة الحرارة يمكن أن يكون الأمثل نحو الغلة القصوى الببتيد.
تحليل نشاط مضادات الميكروبات نيسين المؤتلف البرية من نوع الإنتاج وتنقية أجريت في أعقاب البروتوكول أعلاه. وفي هذه الحالة، استخدم برولين بدلاً من مشتقاته نكا في الخطوة 3، 6. فحص نشاط مضادات الميكروبات واستخدمت للتحقق من شأن الإنتاج ومقارنة نشاط مضادات الميكروبات قبل وبعد تنقية. لتحليل النشاط، الكسور شطف ايماك التدفق من خلال استخدامها مباشرة واختبارها ضد سلالة مؤشرات إيجابية لاكتيس لام (الشكل 2). كما تعرب هذه السلالة عن نسب، تصبح تنشيط نيسين المتغيرات الواردة في ليساتيس كولاي الخلية أو تنقية العينات الببتيد، على التوالي، بانشقاق proteolytic من الببتيد الزعيم. ومن الواضح أن التدفق عبر أظهرت نشاط النمو المثبطة. وهذا يمكن تفسيره بالمواد النشطة بيولوجيا ليست ملزمة للعمود ايماك. الكسور شطف اختبار كافة أظهرت زيادة النشاط مقارنة بالعينة أونبوريفيد، مما يشير إلى تركيز الببتيد صاحب معلم من ايماك. علما بأن المخزن المؤقت شطف (كالمراقبة السلبية) لم تؤثر عدم نمو L. lactis في هذا التحليل.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> الشكل 2 . اختبار نشاط مضادات الميكروبات بعد تنقية ايماك لإنتاج ريكومبينانتلي البرية من نوع نيسين. تم اختبار شطف كسور 5 إلى 15 والتدفق من خلال تنقية ايماك بالمقارنة مع الخلية أونبوريفيد ليستي (المخفف لتطبيع600 OD) ضد سلالة مؤشر لاكتيس لام . يشير حجم هالات تثبيط النمو إلى نشاط مضادات الميكروبات. الكلورامفينيكول بتركيز 400 ميكروغرام/مل كمراقبة سلبية كعنصر إيجابي وشطف ايماك المخزن المؤقت. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
لإثبات نشاط مضادات الميكروبات ريكومبينانتلي أنتجت نيسين المتغيرات التي تحتوي على ستة برولين مختلفة النظير، أنجز نشاط الإنزيم لاختبار تثبيط سلالة مؤشر لاكتيس لام . ويبين الشكل 3 تثبيط النمو لخمسة من ستة العينات المنتجة باستخدام النظير برولين. ولوحظت أفضل النتائج (كما يحكم من أحجام هالو) لإدماج تجارب التناظرية (4ص)-فلوروبروليني، (ص4)-برولين و (4S)-ميثانوبروليني. مقارنة حجم هالة تثبيط النمو إلى نيسين البرية من نوع أنتجت واختبرت في نفس الوقت، أظهرت كل ثلاثة متغيرات نيسين مماثلة تثبيط قوة. ومع ذلك، لا يمكن أن يكون حجم هالة وحدها المستخدمة لتقويم نشاط معين، حيث لم يتحدد تركيز أمبير. ولذلك، فحوصات لا تؤدي إلا إلى اختبار نوعيا عما إذا كان هو الحفاظ على نشاط مضادات الميكروبات من الخيارين نيسين الناتجة أو فقدت. لتحديد نشاط معين، يجب أن يكون تركيز المتغيرات نيسين كمياً (انظر المناقشة).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> الشكل 3 . تحليل نشاط مضادات الميكروبات من ليساتيس الخلية التي تحتوي على متغيرات نيسين أنتجت عن طريق SPI مع النظير برولين. مقارنة بين المتغيرات نيسين مع المؤتلف البرية من نوع العينات. وكانت جميع عينات OD600-تطبيع بعد تحلل الخلية بالنسبة لكثافة ثقافة الخلية المقطوع. وتبين هالات بيواكتيفيتي في شكل مؤشر سلالة إعاقة النمو. الصف الأول من اليسار إلى اليمين: (4ص)-فلوروبروليني، (ص4)-برولين، (ص4)-ميثانوبروليني والكلورامفينيكول (400 ميكروغرام/مل؛ مراقبة إيجابية مضادات الميكروبات). الصف الثاني: (4S)-فلوروبروليني، (ق4)-برولين، (4S)-ميثانوبروليني وبرولين (البرية من نوع عنصر التحكم). ملاحظة التسمية الكيميائية؛ على سبيل المثال، (4ص)-فلوروبروليني ويشار أيضا إلى ترانس-4-فلوروبروليني. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
LC-ESI-TOF الكتلي بعد تنقية ايماك، إدماج ncAAs نيسين تم تحليلها بواسطة LC-ESI-TOF الكتلي. ويبين الشكل 4 الأطياف الشامل ديكونفولوتيد من نيسين متغير يحتوي على (4ص)-فلوروبروليني. وكان هذا البديل ايماك تنقيته كما هو موضح أعلاه، وبعد تحليلها بواسطة LC-ESI-TOF الكتلي، حيث أنه مازال يحمل الزعيم. الذروة الرئيسية في الشكل 4A يناظر نيسين المعدلة تتضمن (4ص)-فلوروبروليني مع كتلة ديكونفولوتيد دا 6883.18 (الكتلة المحسوبة 6882.05 دا، حسبت كتلة من الببتيد البرية من نوع المقابلة مع برولين في هو موقف 9 دا 6864.06). تتوافق مع قمم اثنين مع وفرة أدنى وأعلى كتلة الصوديوم adducts كما هو مبين. الشكل 4 ب يبين مشحونة بمختلف الأنواع الرئيسية المركبة التي توصلت إليها خوارزمية deconvolution. على سبيل المثال، يتوافق مع الذروة في 1148.11 m/z للأنواع مشحونة بمقدار ستة إضعاف ([M + 6 ح]6 +).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> الشكل 4 . LC-ESI-TOF الكتلي لتنقية ايماك نيسين المؤتلف المتغيرات التي تحتوي على (4ص)-فلوروبروليني. (أ) ديكونفولوتيد تشروماتوجرام الكتلي (التصغير في اقحم) للبديل نيسين (التي لا تزال تحمل الزعيم) مع (4ص)-فلوروبروليني (المتوقع أن الجماهير (دا): [M + H]+ = 6882.05، [M + Na]+ = 6904.03، [M + 2Na]2 + = 6926.02). (ب) مركب الأطياف للأنواع [M + H]+. توقع الجماهير (دا): [M + 5 ح]5 + = 1377.41، [M + 6 ح]6 + = 1148.01، [M + 7 ح]7 + = 984.15، [M + 8 س]8 + = 861.26، [M + 9 ح]9 + = 765.67، [M + 10 ح]10 + = 689.21، [M + H 11]11 + = 626.64، [M + H 12] 12 + = 574.50. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
مجهر الأسفار يمكن أيضا إظهار نشاط مضادات الميكروبات نيسين المؤتلف وعن المتغيرات التي تحتوي على الرابطة الوطنية لرياضة بالملاحظة المباشرة من سلالة لاكتيس L. المؤشر عبر مجهرية الأسفار. النيل الأحمر وصبغة فلورسنت عالية مسعور، استخدمت لوصمة عار غشاء الخلية البكتيرية. يبين الشكل 5 التغيير النوعي من الدولة التراكم الثقافة خلية ومورفولوجيا خلية مفردة. كانت ملطخة بالأحمر النيل الخلايا وأودعت على شريحة مجهرية غطاء. تظهر الخلايا مباشرة في البداية من الصف العلوي عند المخزن المؤقت، المؤتلف البرية من نوع نيسين، أو تتضمن نيسين (4ص)-فلوروبروليني، أو (4ص)-أضيفت برولين. لوحة أقل يظهر الصور المقابلة بعد 20 دقيقة حضانة.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> الشكل 5 . مجهر الأسفار من آثار نيسين المؤتلف في الخلايا إيجابية. الصور المجهرية من 30 ميليلتر L. lactis مؤشر الضغط (OD600 = 1) تميز بالنيل الأحمر قد اتخذت قبل (اللوحة العلوية) وبعد (أسفل اللوحة) الحضانة 20 دقيقة مع المخزن المؤقت 1 ميليلتر (A)، 0.3 ميليلتر المؤتلف البرية من نوع نيسين (ب) و ميليلتر 0.6 نيسين المتغيرات التي تحتوي على (4ص)-فلوروبروليني (ج) و (4ص)-برولين (د). دوائر زرقاء علامة المناطق مع الخلايا المجمعة أو مشوهة، والأزرق الأسهم نقطة إلى المناطق حيث يمكن ملاحظة انتشار شظايا غشاء الفلورسنت. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
الشكل 5 ويبين أن المظهر العام للخلايا لم تتغير في غضون 20 دقيقة للمراقبة. عدد الخلايا التي أودعت خلال روز مرة فقط، وبالتالي، كمية أكبر من الخلايا مرئياً ضمن ميكرومتر 80 µm x 80 من منطقة المشاهدة. الشكل 5 ب يبين أن الخلايا إيجابية ظهرت مجمعة وضبابية (ملحوظ مع دوائر زرقاء) بعد 20 دقيقة تعرض إلى البرية من نوع نيسين، أضيفت المبالغ حتى عندما منخفضة (هنا، 0.3 شطف ايماك ميليلتر). وبالإضافة إلى ذلك، تنتشر المواد الخفيفة من الخلايا في المخزن المؤقت، مشيراً إلى أن أجزاء الغشاء ملحوظ مع النيل الأحمر حشدت خلال الإطار الزمني (تميزت أسهم زرقاء). تشير هذه النتائج إلى تحلل الخلية كما اتضح أن تحدث عند العلاج مع نيسين6،49. ولوحظت آثار مماثلة بعد الحضانة مع نيسين متغير يحتوي على (4ص)-فلوروبروليني (الشكل 5ج) ونيسين الذي يحتوي على (4ص)-برولين (الشكل 5د) كل عرض كبير كميات من خلايا مشوهة ومجمعة بعد 20 دقيقة، في تناقض ملحوظ إلى نموذج عنصر تحكم (الشكل 5ألف).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>المكون</td>
			<td>تركيز</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4) 2 حتى4 </td>
			<td>7.5 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>كلوريد الصوديوم</td>
			<td>8.5 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>خ2ص4
</td>
			<td>22 ملم</td>
		</tr>
<tr>
<td>ك2هبو4
</td>
			<td>50 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجسو4
</td>
			<td>1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>د-الجلوكوز</td>
			<td>20 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>جميع الأحماض الأمينية متعارف عليه (باستثناء واحد ليحل محل)</td>
			<td>50 مغ/لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +
</td>
			<td>1 ميكروغرام/مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe2 +
</td>
			<td>1 ميكروغرام/مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>عناصر التتبع (Cu2 +Zn2 +Mn2 +،، موه2 +)</td>
			<td>0.01 ميكروغرام/مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>الثيامين</td>
			<td>10 ميكروغرام/مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>بيوتين</td>
			<td>10 ميكروغرام/مل</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1. تحديد تشكيلة NMM19 كيميائيا المتوسطة النمو البكتيري بعد إعداد وفقا للخطوة 2.

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids at JoVE.com

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

ويقدم البروتوكول الإشريكيّة القولونية-على أساس إدماج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) في نيسين الببتيد الميكروبات لاكتوكوككال. يمكن تغيير الخصائص الخاصة به أثناء المؤتلف التعبير عن طريق استبدال مع ncAAs المطلوب في وسائط النمو المحددة. يتم تعيين التغييرات الناجمة عن ذلك في بيواكتيفيتي فحوصات تثبيط النمو والفحص المجهري الأسفار.

مضادات الميكروبات الببتيدات ينتجها إدماج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير متعارف عليه

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

تسليم والبروتينات، والببتيدات أو خلية بردة الجزيئات الصغيرة إلى الخلايا الحية التي الحضانة مع Endosomolytic الكاشف dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Ammonia Synthesis at Low Pressure

توليف الأمونيا في الضغط المنخفض

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

هندسة Fluorescence 'الذهبي' بإدراج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول وتحليل البروتين الكتلي والأسفار

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

ميكروديسيكشن شرائح الأنسجة الكلوية الأولية، وإدماج مع تكنولوجيا بناء رواية خالية من السقالة

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

تقييم الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس تعتمد على الضغط في الشرايين المقاومة البشرية، والعيش بالفحص المجهري Fluorescence تسمية خالية

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

مضادات الميكروبات توصيف المواد المتقدمة لتطبيقات الهندسة الحيوية

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

Mouse Model of Pressure Ulcers After Spinal Cord Injury

نموذج الفأر من قرحة الضغط بعد إصابة الحبل الشوكي

Pressure ulcers (PUs) are common debilitating complications of traumatic spinal cord injury (SCI) and tend to occur in soft tissues around bony ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...