Name: antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids at JoVE.com

J.H.N., T.B. og M.B. anerkende finansieringen af EU 's FW7 program (SYNPEPTIDE). F.-J.S. og T.F. anerkende finansieringen af det føderale ministerium for uddannelse og videnskab (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus projekt SynTUBio) og tyske Research Foundation (Cluster of Excellence "Unifying begreber i katalyse").

1. kloning af udtryk vektorer og transformation af en auxotrophic produktion stamme
Heri, er gener for nisin biosyntesen, nemlig nisABC, blevet taget fra L. lactis og overført til T7-baserede plasmid udtryk vektorer. Fuld DNA sekvenser af nisABC kan findes i GenBank post X6830734. Genet for forløber peptid (nisA) er blevet placeret på en pET-3a vektor, der giver ampicillin-resistensen. Gener for dehydratase (nisB) og cyclase (nisC) er blevet placeret på vektor pRSFDuet-1, som rapporterede tidligere35, som giver kanamycin modstand.
Bemærk: For nisA, kodon af de sidste fire aminosyrer (ASPR) af lederen sekvens var muteret til at indkode VSLR36 at gengive prolin rester i core peptid unikke og sikre korrekt prepeptide behandling af NisP. På N-terminus, blev en hexa-histidin tag flankeret af linker rester tilføjet til rensning formål (Se figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig1.jpg"> Figur 1 . Skematisk fremstilling af biosyntese og PTM af NisA i E. coli og leder spaltning af L. lactis indikator stamme i en efterfølgende aktivitet assay. I det første skridt, den inaktive lineære prenisin (bestående af en leder og en core peptid region som indeholder en unik prolin (pink) på position 9) kodet af nisA dannes ribosomally. Næste, prenisin er posttranslationally ændret ved inddampning af Serin og Threonin rester til dehydroalanine (Dha) og dehydrobutyrine (Dhb) som katalyseret af NisB. Cyclase NisC danner thioether broer via Michael tilsætning af cystein sulfhydryl grupper med Dha eller Dhb. Den inaktive modificerede prenisin er renset fra E. coli og testet for antimikrobiel aktivitet. Her, er det transporteret ind i cellen af Gram-positive L. lactis indikator stamme. Lederen er kløvet af protease NisP (som anført af en pilespids) for at frigøre fuldt aktiv nisin. Det kan også være fjernet in vitro- ved behandling med trypsin (*). <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<ol><li>Bruge standard heat-shock protokol37 eller elektroporation38 for at omdanne proline auxotrophic E. coli stamme (se ovenfor) med plasmider pET-3a nisA(VSLR) og pRSFDuet-1 nisBC.</li>
	<li>Der afpipetteres 25-100 µL af transformerede cellesuspension på agar plader der indeholder ampicillin, kanamycin og 1% (w/v) glukose. Bruge en tallerken spreder eller glasperler til at sprede løsningen jævnt på pladerne.</li>
	<li>Inkuber plader natten over ved 37 ° C.</li>
	<li>Den følgende eftermiddag, bruge en enkelt koloni til podes 10 mL LB medium indeholdende ampicillin, kanamycin og 1% (w/v) glukose i en 50 mL målekolbe.</li>
	<li>Ryst kultur natten over (12-16 h) ved 37 ° C og 200 rpm.</li>
	<li>Tag 250 µL sterilt 80% glycerol og 550 µL kultur, blandes godt i et 2 mL rør og gemme som frosne celle lager ved 80 ° C.</li>
</ol>2. nye minimal medium (NMM) forberedelse
Bemærk: Denne protokol bruger NMM20 som en kemisk definerede flydende bakterievækst medium. Også, det anbefales at følge rækkefølgen af forberedelse strengt. Ellers, nedbør kan forekomme. Om aminosyre former afviger fra dem, der er angivet i tabellen materialer (f.eks. hydrochlorides), kontrollere opløselighed. NMM19 indeholder 19 aminosyrer med undtagelse af cAA udskiftes (her, prolin) af ncAA analog. Se tabel 1 for de sidste ingrediens koncentrationer. Afhængigt af den bakterielle stamme bruges til produktion, være biotin og thiamin valgfri.
<ol><li>Forberedelse af aminosyre blanding<ol>
<li>Opløs 0,5 g Phe, Trp og Tyr i 100 mL ddH2O med tilføjelse af nogle få dråber koncentreret HCL indtil opløsning.</li>
		<li>Der afvejes 0,5 g af hver af de resterende 16 aminosyrer. Bland med 22 mL 1 M KH2PO4 og 48 mL 1 M K2HPO4. Tilføje ddH2O ~ 800 ml. Rør indtil opløsningen er klar.</li>
		<li>Tilsæt opløst Phe, Trp og Tyr og justere lydstyrken på løsningen til 1 L med ddH2O.</li>
		<li>Sterilisere aminosyre blanding af vakuum filtrering med en flaske top filterenhed.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lager løsninger for NMM19<ol>
<li>Først, forberede 1 M stamopløsninger af følgende komponenter: (NH4)2så4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 og en 5 M lager opløsning af NaCl. Steriliseres ved autoklavering.</li>
		<li>Forberede 50 mL bestande af D-glucose (1 M), CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), thiamin (10 g/L), biotin (10 g/L) og sporstoffer (CuSO4, ZnCl2, frihedsbevægelse2, (NH4)2MoO4, 1 mg/L ). Sterilisere hver af filtrering med en sprøjte filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NMM19 forberedelse<ol>
<li>Bland alle stock løsninger for at opnå en endelig koncentration på 7,5 mM (NH4)2SO4, 1,7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 og 20 mM D-glucose, 50 mg/L aminosyre Bland, 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L thiamin, 10 mg/L biotin og 0,01 µg/mL sporstoffer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. angivelse af rekombinant Nisin med inkorporering af prolin analoger af SPI
I dette afsnit, rekombinant udtryk for prepeptide (her: nisA) og PTM gener (her: nisBC) er udført. Først, celler dyrkes i overværelse af alle CAA, da LB komplekse mediet bruges. Glucose er tilføjet til at undertrykke target Gen-ekspression på baggrundsniveau, som ellers kunne føre til produktionen af wild-type peptid (her: nisin) på grund af leakiness af initiativtagerne. Kun efter målet cAA (her: prolin) er forarmet, ncAA er tilføjet og target genekspression er induceret i kemisk definerede medium. Inkubation af flydende kulturer bør udføres i egnede beholdere med beluftning (f.eks. 500 mL i en 2 L Erlenmeyer-kolbe på 200 rpm).
<ol><li>Ved hjælp af en steril pipette tip, starte en frisk overnight kultur fra frosne celle bestand eller frisk koloni (Se trin 1). Bruge 25 mL LB medium indeholdende ampicillin, kanamycin og 1% (w/v) glukose og inkuberes ved 37 ° C natten (12-16 h) og 200 rpm.</li>
	<li>Podes 1 L af sterile frisk medium med 10 mL overnight kultur (1% v/v) og inkuberes ved 37 ° C og 200 rpm indtil OD600 = 0,5.</li>
	<li>Der centrifugeres ved 4 ° C i 15 min. ved 4500 x g.</li>
	<li>Hæld supernatanten og resuspenderes med 20 mL NMM19 (udarbejdet i trin 2.3) indeholdende antibiotika og 1% (w/v) glukose. Der centrifugeres ved 4 ° C i 10 min på 4.500 x g.</li>
	<li>Resuspend celle pellet i 500 mL af samme medium og inkuberes ved 30 ° C og 200 rpm i 1 h. Bemærk: På dette trin, cAA udtynding (her, prolin) finder sted.</li>
	<li>Opdele kulturen i lige store dele, (en for hver ncAA). Fremkalde hver kultur med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og leverer 1 mM prolin analoger (4S/R- fluoroproline, 4S/R- hydroxyprolin eller 4S/R- methanoproline). Bemærk: Som kontrol, en kultur kan leveres med 1 mM prolin, hvilket resulterer i wild-type peptid produktion.</li>
	<li>Der inkuberes natten over (12-16 h) ved 28 ° C og 200 rpm.</li>
	<li>Der centrifugeres celle kulturer i 50 mL rør ved 4 ° C i 20 min. på 5.000 x g. Hæld supernatanten og gemme piller ved-80 ° C indtil rensning.</li>
</ol>4. isolering og oprensning af hans markeret Nisin analoger
Peptider er renset under denatureringen betingelser med guanidin hydrochlorid (GuHCl)39, en stærk denatureringsmiddel.
Forsigtig: GuHCl er skadelige, hvis indtagelse eller indåndes og forårsager huden og alvorlige øjenirritation. Bære øjenbeskyttelse og handsker.
<ol><li>Forberede 250 mL af bindende buffer (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4), vaskebuffer (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM imidazol, pH 7,4) og eluering buffer (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM imidazol, pH 7,4). For disse, overføre den faste stoffer i en 250 mL flaske og fylde op til 200 mL med ddH2O. Mix godt og ph indstilles til 7.4 med 1 M NaOH eller HCl. Derefter, fylde op til 250 mL med ddH2O. Filter alle buffer løsninger ved hjælp af en flaske top filterenhed.</li>
	<li>Celle lysis Her bruges en sonikator (med 200 W maksimale høj frekvens (HF) output); Bemærk at strømindstillinger nødvendige for celle forstyrrelse kan variere for andre instrumenter. Alle trin er udført på is. Alternativt, kemiske celle lysis, en flydende homogeniseringsapparat eller en fransk presse kan bruges.<ol>
<li>Tilføje 12 mL binding buffer til hver centrifugeglasset (fra trin 3.8) og resuspend af vortexing.</li>
		<li>Dykke spidsen af sonikator sonde ind i cellesuspension. Indstille sonikator på 40% amplitude med puls af 1 s på / 5 s off i 15 min. Bemærk: Ren sonikator spidsen mellem prøver at undgå fremførsel. Tør sonikator sonden med 70% ethanol.</li>
		<li>Der centrifugeres i mængden cellesuspension ved 4 ° C i 40 min på 15.000 x g at sammenpresse celle debris. Overføre analysere til en ny reaktion tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Affinitet kromatografi For immobiliseret metal ion affinitet kromatografi (IMAC)40, kan en peristaltisk pumpe eller en FPLC system bruges med en 1 mL patron (her fyldt med Ni-NTA harpiks). Til fremstilling af buffere, se trin 4.1. Bemærk: IMAC rensning er mulig, da den producerede rekombinant peptid bærer en N-terminalt hans markeret leader, som er fjernet i trin 6 af leder peptidase NisP, frigiver modne nisin. Udfør rensning ved stuetemperatur eller ved 4 ° C. Bruge en gennemstrømningshastighed på 1 mL per minut hvis relevant for IMAC patron.<ol>
<li>Første, vask patron med 5 kolonne diskenheder (cv) af Hedeselskabet2O fjerne opbevaring buffer.</li>
		<li>Reagensglasset med 10 cv binding buffer.</li>
		<li>Processen celle lysate (trin 4.2) med en sprøjte filter for at fjerne partikler, så gælder at patronen.</li>
		<li>Vask med 15 cv wash buffer for at fjerne uspecifikke og ubundne materiale.</li>
		<li>Elueres med 10 cv eluering buffer og indsamle 1 mL fraktioner i 1,5 mL rør. Gemme brøker ved 4 ° C for kort sigt (op til 3 dage) eller ved-20 ° C i længere tid vilkår.</li>
		<li>Til opbevaring, vaske patron med 10 cv af Hedeselskabet2O efterfulgt af 5 cv 20% ethanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. LC-ESI-TOF massespektrometrisk analyse af Nisin analoger
Bemærk: Se materialer tabel for eksempel instrumentering til højpræstationsvæskekromatografi kombineret med electrospray Ionisation time of flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS).
<ol><li>Udfør HPLC adskillelse af 15-20 µL peptid løsning (udarbejdet i trin 4.3) på en C5 kolonne med en mobil fase af vand (A) og acetonitril (B) begge suppleret med 0,1% myresyre og en gradient fra 5-80% B over 20 min. Massespektrometri (MS), bruge eluering efter 5 min. Bemærk: Afhængigt af peptid indhold og affinitet til HPLC kolonne, prøve diskenheder og adskillelse muligvis optimering.</li>
	<li>Bruge passende software til deconvolute de målte massespektre og beregne forskellige peptid afgift hedder41. Sammenligne observerede peptid arter massen til den beregnede vildtype masse ændret af cAA → ncAA substitution. Tage i betragtning at den lineære prepeptide posttranslationally modificeret af otte dehydrations (-8 H2O) og fem cyclizations (Se figur 1). Bemærk: Ved hjælp af natrium-holdige buffere, kan MS analyse i positiv tilstand vise natrium adukter. Disse blive synlig som yderligere toppene med højere deconvoluted masse (for hver natrium addukt, observerede deconvoluted massen er 22,99 Da højere). Hvis du vil fjerne disse adukter, HPLC rensning42 eller omfattende dialyse43 kan udføres.</li>
</ol>6. antimikrobiel aktivitet Test
<ol><li>Forberedelse af GM17-agar plader under sterile betingelser<ol>
<li>Forberede en overnight kultur indikator stamme L. lactis NZ9000 transporterer plasmid pNG nisPT44 ved 30 ° C i M17 bouillon45 med 1% (w/v) glukose (= GM17) og 5 µg/mL chloramphenicol.</li>
		<li>Måle OD600, podes frisk medium til OD600 = 0,1 og inkuberes indtil OD600 = 0,4-0,6. Placer derefter kolben på is. Bemærk: Hver OD600 måling vil forbruge kultur volumen. Husk at for hver assay agar plade, 1 mL bakteriekulturen vil være nødvendig. Hvis det er påkrævet, vinduesdiameter den flydende kultur i overensstemmelse hermed.</li>
		<li>For 1,5% agar, der afvejes 4,5 g agar i en glasflaske medier. Tilsæt 300 mL ddH2O, mix og autoklave.</li>
		<li>Forberede 2 x M17 bouillon (two-times koncentreret) i 300 mL ddH2O og autoklave.</li>
		<li>Bland 25 mL 2 x M17 bouillon indeholdende 10 µg/mL chloramphenicol og 2% glukose med 1 mL L. lactis preculture (4% v/v).</li>
		<li>Tilføj 25 mL smeltet 1,5% agar (frisk autoklaveres eller opvarmet i mikroovn). Bemærk: Før denne, lad den flaske cool at røre ved (omkring 50 ° C). Dette er nødvendigt, da L. lactis er en mesofil organisme følsomme over for høje temperaturer.</li>
		<li>Hæld opløsningen i en stor petriskål. Tørre plader for 10-15 min.</li>
		<li>Sterilisere enderne af et glas Pasteur pipette af flammen. Vente på at køle ned, så brug den brede ende for at skabe huller i den størknede GM17-agar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse af prøver<ol>
<li>Tage 1 mL af E. coli udtryk kulturer (skabt taktfast 3.7) i en mærket 1,5 mL rør og centrifugeres i 3 min på 7.000 x g. aspirat den resterende medium og resuspenderes celle i 500 µL Na-P (50 mM natrium fosfat buffer pH 7,4 lavet af 0,5 M dihydrogen natriumfosfat og 0,5 M dinatrium hydrogen fosfat).</li>
		<li>Der sonikeres prøver på is (Sammenlign trin 4.2.2). Dykke spidsen af sonikator sonde ind i cellesuspension. Indstille sonikator på 30% amplitude med puls af 1 s på og 5 s ud i 3 min.</li>
		<li>Der centrifugeres cellen lysate i 10 min på 13.000 x g at sammenpresse celle debris. Overføre supernatanten til en ny reaktion tube på is.</li>
		<li>Fortyndes og normalisere celle ekstrakt analysere til 1 mL OD600 = 0,6, i forhold til den høstede celle tæthed med Na-P.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aktivitet test<ol>
<li>Tilføje 40 µL af hver normaliseret prøve i et hul af indikator agar plade (figur 3). Bruge chloramphenicol på 400 µg/mL som antibakterielle kontrol sammensatte. Brug eluering buffer som en negativ kontrol. Vent, indtil alle prøver er diffust i agaren. Inkuber plade natten over ved 30 ° C.</li>
		<li>Tage billeder af agar plader ved hjælp af en flatbed-scanner eller digitalt kamera. Vækst hæmning halo størrelser kan være målt i hånden eller ved hjælp af ImageJ46.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Fluorescens mikroskopi
For at observere effekten af ampere på bakterieceller, kan lys og Fluorescens mikroskopi bruges. Bemærk, at nisin virkningsmekanisme afhængig af destabilisering og dannelsen af porer i bakteriel membraner6. Her, bruges Nile rød til at plette bakteriel cellemembranen, som bliver spredt og aggregerede ved celle lysering.
Bemærk: Se materialer tabel for eksempel instrumentation. Mængder af tilsat AMP løsning kan justeres afhængigt af peptid koncentration og bioactivity.
<ol><li>Celle forberedelse<ol>
<li>Forberede 10 mM Nilen røde stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO).</li>
		<li>Vokse L. lactis indikator stamme til OD600 = 1,0 som i trin 6.1.1-6.1.2.</li>
		<li>Der centrifugeres 1 mL kultur for 3 min. ved 4 ° C og 5.000 x g.</li>
		<li>Kassér supernatanten, resuspend i 1 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS)47.</li>
		<li>Centrifuge og resuspend igen.</li>
		<li>Tilføj 1 µL Nilen røde stamopløsning, blandes forsigtigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskopisk billede erhvervelse<ol>
<li>Tilføj 30 µL af celle forberedelse på et cover dias mens spændende på 520 nm.</li>
		<li>Indstille erhvervelse tid 0,2 s, kinetic serie 0,1 Hz, serie længde 200 billeder.</li>
		<li>Tilføje 0,3 - 1,5 µL af celle lysate eller IMAC prøve (fra trin 6.2.4 eller 4.3.5, henholdsvis). IMAC prøver, kan eluering buffer anvendes som en negativ kontrol.</li>
		<li>Overvåge og registrere fluorescens emission ved λ ≥ 560 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dataanalyse<ol>
<li>Mikroskopi billedsekvenser gemmes som filmfiler (.avi). Enkelt billeder er analyseret med ImageJ46.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Ved hjælp af SPI til indsættelse af prolin analoger, kan målrettet nisin strukturer ændres væsentligt, at skabe nye peptid varianter med unik sekvens kombinationer og kemiske egenskaber. På denne måde, kan den grundlæggende grænse for klassisk genteknologi omgås, som er begrænset til side kæde kemi af de 20 CAA. In vivo kemiske diversificering af nisin som eksemplificeret ovenfor viser en generel tilgang til at supplere naturlige PTMs og dramatisk forbedre den kemiske plads af RiPPs. Vi mener, at udvide repertoiret af de naturlige aminosyrer holder meget lovende især for ampere. I proteiner, kan en enorm vifte af funktionaliteter realiseres gennem en defineret arrangement af de 20 CAA i tre-dimensionelle strukturer. Med kun 7-100 aa i længde3ville måder at opnå sådanne strukturelle funktioner kun via CAA være begrænset til ampere. Det er således ikke overraskende, at naturlige ampere i form af RiPPs er almindeligvis ekstensivt post-translationally modificerede4. I den samme mode, ncAAs som alternative byggesten holder meget lovende til at forbedre deres farmakodynamiske og farmakokinetiske parametre (Se Baumann et al. 201735 og referencer heri).
SPI Metodevalg i dette arbejde fordele fra en forholdsvis nem eksperimentel opsætning, ligetil udførelse og høj reproducerbarhed. På grund af globale substitution er flere lokationer ncAA iblanding i target peptider også muligt. Metoden kan på den anden side ikke være tilstrækkelig for udskiftning af aminosyrer, ofte forekommer i target gen produkt. I princippet, uønskede holdninger kan ændres ved site-directed mutagenese, men disse yderligere ændringer kan også påvirke flere AMP egenskaber herunder struktur og bioactivity. Når en auxotrophic stamme for produktion er tilgængelig, kan flere ncAAs prøves uden at kræve omfattende ændringer på det genetiske niveau. Desuden er metoden er ikke begrænset til auxotrophic E. coli stammer, men kan også udføres ved hjælp af den naturlige produktion vært. For eksempel, Zhou et al. viste at SPI til produktion af roman RiPPs også virker de naturligt Trp-auxotroph L. lactis: bruger defineret medier, tre tryptophan analoger blev indarbejdet på fire positioner i nisin50.
Da metoden SPI fører til global udskiftning af valgt cAA af ncAA, er det generelt gælder for en bred vifte af target peptider og proteiner. En vifte af auxotrophic E. coli stammer, der er tilgængelige (Se trin 1), tillader flere CAA hver skal testes for udskiftning af ncAAs. Mødte analoger indarbejdet ved hjælp af metA-mangelfuld stammer (f.eks. B834(DE3)) oftest ansat. Eksempler på isostructural Met analoger er azidohomoalanine (Aha) og homopropargylglycine (hypothalamus), kommercielt tilgængelige ncAAs, som kan indarbejdes effektivt. Både indføre bioorthogonal håndtag, som giver mulighed for fastgørelse af molekyler transporterer en kompatibel alkyn eller indeholder funktionalitet, henholdsvis. For eksempel, fluorescerende farvestoffer eller polyethylenglycol (PEG) fraspaltning kan knyttes af kobber (I)-katalyseret indeholder alkyn cycloaddition (CuAAC)51.
Selv om begge rekombinant ncAA indarbejdelse metoder (SPI og SCS) normalt opnå tilstrækkelige mål mængder, udbyttet er ofte reduceret i forhold til wild-type produktion af den tilsvarende peptider og proteiner. Da purities ofte korrelerer med produktionseffektivitet, kan yderligere rensning trin være nødvendig, især for lav-rigelige arter. I dette tilfælde af rekombinant nisin produktion forenkler hans-tagged leder sekvens RiPP rensning af selektiv berigelse fra cellelysater. Rensning vist i denne protokol forbedrer renhed og koncentration af nisin, men ofte giver ikke AMP purities tilstraekkeligt at fastslaa udbyttet og specifikke aktivitet. Udover IMAC, almindeligt anvendte AMP rensning metoder omfatter HPLC, ionbytning kromatografi (IEC) og nedbør (fx. ved hjælp af acetone eller trichloreddikesyre (TCA)) eller kombinationer heraf - hvilket resulterer i en omstændelig rensning ordning52 . Det skal bemærkes, at deres almindeligt polycationic karakter kan lette IEC rensning. Frysetørring er ofte bruges til at gemme renset ampere.
Ideelt set ncAAs til indbygning i ampere skal være kommercielt tilgængelige til overkommelige priser eller produceret let af simpel og reproducerbar kemisk syntese protokoller. En lige så vigtig forudsætning for metoden SPI er at ncAA er anerkendt, aktiveret og opkræves på et beslægtet tRNA af den endogene eller sammen udtrykt aaRS. Dette kan være testet in vitro- af aminosyre aktivering eller tRNA aminoacylation assay53. Som et let alternativ, SPI test udtryk af model proteiner som grøn fluorescerende proteiner (NGL) udført både i tilstedeværelse og i mangel af ncAA tilskud kan udføres. Derudover Opløselighed i vækst medium og celle permeabilitet samt kemiske stabilitet udgør vigtige faktorer.
I dette eksempel, blev antimikrobiel aktivitet screenet ved hjælp af en Gram-positive indikator stamme. Som det udtrykker leder peptidase NisP, katalyseret det sidste trin af nisin modning. Fjernelse af leader-sekvens (hans-markeret til rensning formål) kan også være udført i vitro ved behandling med oprenset NisP50 eller trypsin54. Ud over dette arbejde, kan patogene organismer og multidrug resistente stammer derefter testes for bakteriostatisk eller bakteriedræbende hæmning af ampere ved hjælp af en lignende metode. Klinisk relevante målarter omfatter MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae. Udover agar plade diffusion assay præsenteres her, vækst hæmning kan også udføres ved hjælp af passende flydende medier podet med de bakteriearter og suppleret med AMP. Du bruger bouillon fortynding metoder, kan den minimale hæmmende koncentration (MIC) bestemmes ved hjælp af pure peptider55. Aktivitet assay præsenteres her kan også bruges til at vurdere bioactivity og styrken af AMP-holdige løsninger i forhold til reference forbindelser, for eksempel kommercielt tilgængelige nisin.
Rekombinant produktion af RiPPs er ofte muligt39, som almindeligvis omfatter Co udtryk for PTM gener. Så snart produktion stammen er overført til en kemisk definerede eller syntetiske minimal medium indeholdende en egnet ncAA, finder rest-specifikke udskiftning af tilsvarende cAA sted. Således kan andre RiPPs produceres af den samme metode, forudsat at deres rekombinant produktion er gennemførlig og betingelser kan findes hvor ncAA indarbejdelse og PTM give tilstrækkelige mængder af target produkt. Bemærk, at udover vært celle proteomet, peptid PTM maskiner kan også blive ncAA-ændret under SPI. Timingen af target udtryk induktion og længden af følgende inkubationstiden kan derfor kræver optimering. Da ncAA iblanding i PTM enzymer kan påvirke deres stabilitet og aktivitet, kan fremstilling af de forarbejdede RiPP i princippet blive påvirket. Tilstrækkelig PTM enzym effektivitet er angivet med dannelsen af forarbejdede prepeptide, som registreres af MS og bioactivity assays. Som indført ovenfor, forskellige inducerbar initiativtagere kan være ansat for at producere PTM gener først (i mangel af ncAA) efterfulgt af induktion af forløber peptid gen i tilstedeværelse af ncAA. Generelt skal produktionen af cAA-holdige target peptid undertrykkes før tilsætning af ncAA, hvorfor stramme undertrykkelse af forløber genet er påkrævet. Inden for denne protokol opnås dette ved kataboliske undertrykkelse gennem tilsætning af glucose til vækstmediet. Især da PTM enzymer kræves til prepeptide forarbejdning stammer normalt fra en genetisk fjerne vært, kan udtryk temperatur og codon brugen af de tilsvarende gener kræve optimering hvis rekombinant produktion ikke er endnu blevet etableret. I princippet, tilstedeværelsen af ncAAs i prepeptide kan blande sig med anerkendelse og behandling af PTM enzymer, i tilfælde af nisin NisBC og NisP. Til ncAA indbygning i ampere, er det derfor anbefales at udføre små udtryk forsøg først for at identificere passende udtryk betingelser og pålideligheden af AMP aktivitet assay.

Opdagelsen af antibiotika i det tyvende århundrede og den parallelle udvikling af nye antimikrobielle forbindelser mod sygdomsfremkaldende mikroorganismer aktiveret målrettede behandlinger af bakterielle infektioner. Men, på grund af fremkomsten af multidrug-resistente patogene organismer såsom methicillin-resistente Staphylococcusaureus (MRSA), vancomycin-resistente enterokokker (VRE), MDR (multiresistente) Salmonella typhimurium phage skrive 10 (DT10 ), og Klebsiella pneumoniae, det er tvingende nødvendigt at generere nye antimikrobielle stoffer1. Antimikrobielle peptider (AMP'er) er alsidigt, ofte meget specifikke forbindelser, der er lovende kandidater til udvikling af nye stoffer takket være deres fysisk-kemiske egenskaber, fleksibilitet, størrelse, hydrophobicity og tilstand af aktion2. Ampere er små peptider, som normalt består af 7-100 aminosyrer. De har ofte, en kationiske struktur rige i positivt ladede arginin og lysin restprodukter, som interagerer med den målrettede mikrobielle cellemembranen, som debiteres oppositely3. En særlig undergruppe af ampere er ribosomally syntetiseret og posttranslationally modificeret peptider (RiPPs)4. Disse er fremstillet af mange organismer fra Kongeriget svampe og bakterier-domænet. En af de bedst kendte og udbredte RiPPs er nisin, naturligt produceret af mælkesyre bakterie Lactococcus lactis (L. lactis). Aktivt mod et panel af Gram-positive bakterier, nisin er blevet brugt som en biopreservative i fødevareindustrien i mere end 50 år på grund af sin antimikrobielle egenskaber og fravær af udviklede resistens i målrettede mikrobielle stammer5. Undersøgelser har vist, at nisin destabiliserer og genererer porer i bakteriel cellemembraner, fører til antimikrobiel aktivitet mod både Gram-positive og Gram-negative patogener6. Ved binding til lipid II er bakterielle cellevæg syntesen hæmmet7. Nisin er kodet af nisA som en lineær forløber peptid, som er sammensat af en leder og en core peptid region (figur 1). Efter ribosomale syntese ændres prenisin først dehydratase NisB. Her, er Serin og Threonin restkoncentrationer i regionen prepeptide core dehydreret dehydroalanine (Dha) og dehydrobutyrine (Dhb)8. Efterfølgende, dehydreret rester er kombineret med cystein til form lanthionine ringe (deraf navnet "lantibiotic" for lanthionine ring-holdige antibiotika) af en enzym-katalyserede Michael tilføjelse. Denne posttranslationelle modifikation (PTM) er katalyseret af cyclase NisC. I L. lactis, den modificerede prenisin er derefter transporteres ud af cellen af transportør NisT og leder peptid er kløvet af proteinase NisP at frigive modne og aktive nisin form9. Den ansvarlige leder peptidase NisP har en høj substrat specificitet, da det kun processer modificeret nisin effektivt10.
I almindelighed, skyldes aktive RiPPs virkningen af PTM enzymer (f.eks NisBC), som drastisk øger den kemiske plads kort peptider, fx via acetylation, glykosylering, methylering eller fosforylering. Dette niveau af kompleksitet kan yderligere udvides ved en direkte inkorporering af ncAAs. Mens ofte muligt, er kemisk syntese af ampere en udfordring for storproduktion på grund af deres strukturelle kompleksitet. For eksempel, blev den samlede kemisk syntese af lantibiotic lactosin S i 71 reaktion trin opnået med en endelige udbytte på 10%, og at af nisin med en grov udbytte af kun 0,003%11,12. Derfor, biologisk produktion tilbyder et levedygtigt alternativ, på grund af generation af korrekte stereocenters og høj koncentration.
Op til i dag, mere end 150 ncAAs, f.eks., at have funktionelle grupper der indeholder fluor eller azider, er blevet indarbejdet i rekombinante proteiner, og flere eksempler på ncAA-modificerede ampere har været rapporteret13,14, 15,16. Med indførelsen af ncAAs, kan roman fysisk-kemiske egenskaber genereres i forhold til konventionelle mutagenese. Mangfoldighed af eksisterende peptider kan øges, eventuelt fører til nye antibiotika.
En metode til indbygning af ncAAs i rekombinant peptider er selektivt pres indarbejdelse (SPI) baseret på brugen af auxotrophic bakteriestammer17. Disse stammer er ikke i stand til at syntetisere den tilsvarende cAA analog af ncAA. Metoden bruger hyppigt bemaerket afslappet substrat specificitet, en funktion i mange naturlige aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Ud over deres naturlige cAA substrater er disse enzymer ofte i stand til at genkende og aktivere den ønskede ncAA og oplade det på deres beslægtet tRNA(s). Dette fører til ribosomale indarbejdelse af ncAA ind i målet gen produktet i en rest-specifik måde (dvs., cAA → ncAA substitution). Dette er naturligvis kun mulig, når den ønskede ncAA er strukturelt og kemisk svarer til den kanoniske aminosyre og tolereres af celle fysiologi, oversættelse maskiner og target peptid eller protein sekvens. I en særlig eksperimentel opsætning, er auxotrophic værtsceller kulturperler i definerede medium leveres med en begrænsende koncentration af den oprindelige aminosyre til erstattes. Den cellulære vækst eller udveksling af cAA-frit medium fører til intracellulær nedbrydning af cAA. I det næste trin, ncAA er tilføjet og genekspression mål er induceret. Uundgåeligt, ncAAs er nu også indarbejdet i mange andre proteiner i cellen vært i denne fase af target genekspression. Ikke desto mindre toksicitet af opsætningen af SPI er holdt på et lavt niveau siden Escherichia coli (E. coli) stamme er transformeret med et plasmid bærer target gen under kontrol af en stærk fortaler (almindeligvis den konkurrenceprægede T7 promotor / RNA polymerase system)19. Straks efter induktion (som regel når cAA er opbrugt), værten celler ophører med at vokse og deres cytoplasmatisk enzymatisk machineries anvendes primært til udtryk af plasmid-baseret mål-genet. Site-directed mutagenese kan bruges til at definere websteder af rest-specifikke ncAA installation i target gen20.
Som en model peptid for indarbejdelse af ncAAs, blev pentacyclic AMP nisin A valgt. Det er 34 aminosyrer lange og har kun en enkelt prolin rester i core peptid sekvens (figur 1). Subtilisin, ericin A og S og epidermin såvel som i nisin Z og nisin Q synes den bevarede prolin at være afgørende for aktivitet9,21. CAA prolin spiller en særlig vigtig rolle i peptidyl-prolyl akrylamid rotation og sekundær struktur stabilisering. Sin sidekæde ring konformationer (exo / endo puckers) er ansvarlig for et termodynamisk stabilisering af akrylamid bond. Målrettet kemiske ændringer (f.eks. hydroxylations, fluorinations, methylations) af prolyl rynker påvirke ofte kritisk folde stabilitet, stillads stivhed og funktioner af mange biologiske strukturer22. Derfor er det plausibelt at forvente at Pro→ prolin analog erstatninger vil begave ring B, den anden ring af nisin, med roman og usædvanlige egenskaber.
Her, en prolin-auxotrophic E. coli stamme blev brugt til fremstilling af rekombinant nisin. Dette kræver et udtryk for prepeptide gen nisA samt ændring enzym gener nisBC. Genetisk kodet peptid produktet bærer en N-terminalt hans markeret leder til rensning via affinitet kromatografi. Til bestemmelse af aktivitet bruges L. lactis udtrykker og udskiller NisPT til at aktivere rekombinant nisin varianter fra E. coli cellelysater eller renset peptid prøver (figur 1). Den modne AMP er frigivet efter spaltning af lederen af NisP. I denne agar diffusion metode, AMP prøven diffunderer ind i solid vækstmediet og kan hæmme væksten af de Gram-positive mikroorganisme. Efter inkubation, kan dette iagttages visuelt ved vækst hæmning glorier. Ud over L. lactis som indikator, ændret nisin varianter viste antimikrobiel aktivitet mod Enterococcus faecalis, Bacillus cereusog Staphylococcus aureus, Lactobacillus johnsonii 21,23.
En alternativ og eksperimentelt anderledes metode at indarbejde ncAAs i RiPPs er stop-codon suppression (SCS)24. For dette, en ortogonale tRNA / aminoacyl-tRNA syntetase (aaRS) par der kræves for den tilsvarende ncAA. Ideelt set, alle disse tre komponenter er bioorthogonal, dvs., de ikke interagere med den endogene tRNAer og aaRSs. En ncAA-specifikke aaRS kan genereres ved ændring af det enzym aktive site og screening af genetiske biblioteker af mutant synthetases25. Derudover kræver indførelsen af en ncAA en codon, som er overført og som ikke koder for cAA. Almindeligt, er rav stop-codon anvendte24,26.
For nylig, SPI blev etableret for indarbejdelse af α-chloracetamid-holdige og klik-kemi-kompatible ncAAs i NisA27. For eksempel, var Nε- alloc-lysin indarbejdet i lasso peptid captistruin med lokationsspecifikke (SCS) og rest-specifikke (SPI) iblanding metoder og efterfølgende modificeret in vitro af ruthenium-katalyseret metathesis28 . I forhold til SPI, SCS metode er mere komplicerede siden en ortogonale tRNA / aaRS par må være co udtrykt. Til dato, o-par for prolin indarbejdelse har været udviklede29, men til bedste af vores viden, ingen eksempel prolin analog vedtægter er blevet rapporteret.
Det skal bemærkes, at ikke alle ncAAs kan indarbejdes ved hjælp af metoden SPI. Først, optagelsen af ncAAs i cytoplasma er reguleret af en lang række transport proteiner, der er indlejret i den cytoplasmatiske membran, som er den indre membran for gramnegative bakterier som E. coli. E. coli er normalt i stand til at transportere en bred vifte af aminosyre analoger ind i cellen med sidekæder strukturelt og kemisk ligner kanoniske aminosyrer. Andet, mange kemisk reaktive eller ustabile ncAAs kan fungere som en inhibitor mod cellulære vækst, da de er giftige for stofskiftet og fysiologi af værten celle30. Således, optagelse og toksicitet af ncAA for produktion vært skal testes på forhånd. Du kan undgå inaktivering af PTM maskiner som en bivirkning ved et strengt kontrolleret udtryk opsætningen af de ansvarlige gener kan bruges til at indarbejde den naturlige aminosyre i ændring enzymer (f.eks. nisBC) og ncAA i target-genet ( fx nisA). Dette kan opnås ved hjælp af to forskellige projektledere og induktion af target genekspression, som påvist i specialdesignet SPI protokoller31. Som skitseret ovenfor, er metoden SPI baseret på afslappet substrat specificiteten af de årlige aktivitetsrapporter, som giver mulighed for ncAA aktivering og beslægtet tRNA opladning. Efterfølgende, er tRNA leveret til ribosomet efterfulgt af akrylamid bond dannelse og foldning af mål (poly) peptid. I denne processer, kan korrekturlæsning og redigering af mekanismer, der blive relevante32. Af disse grunde er det af stor betydning at have et mål ncAA, der er strukturelt og kemisk svarer til cAA. Andre vigtige punkter er tilstrækkelig stabilitet (begge i vækst medier og udsat for den cellulære metabolisme) og Opløselighed af ncAA. Derudover bør det være enten kommercielt tilgængelige eller lette at være syntetiseret kemisk.
Her, beskriver vi en protokol til SPI, at tillade restkoncentrationer-specifikke indarbejdelse af ncAAs i rekombinante RiPPs. Især forskellige prolin analoger er indarbejdet i den antimikrobielle peptid nisin A ved hjælp af E. coli som værtsorganisme. Massespektrometri bruges til at kontrollere aminosyre udskiftning og peptid produkter analyseres for bioactivity ved hjælp af vækst hæmning assays og Fluorescens mikroskopi ved hjælp af mikrobielle indikator stammer.
Den grundlæggende forudsætning for en vellykket rekombinant nisin udtryk med definerede ncAAs kræver en egnet proline auxotrophic E. coli stamme. Til dette auxotrophy, proA må være dysfunktionel, for eksempel opnås ved genomisk knockout. Celler frataget fuldt intracellulære Pro biosyntese (dvs. fjernelse af proABC) uden mulighed for tilbagefald er stabile auxotrophs. Udbredte gen knockout metoder er phage transduktion eller enkelt-gen knockout ifølge Datsenko & Wanner33. Derudover kan proA knockout stammer fås fra offentlige arkiver som Addgene, CGSC eller Keio samling. Da den rekombinante nisABC udtryk vist her er baseret på brugen af T7 initiativtagere, har udtrykket vært stamme til at bære en inducerbar genet for T7 RNA polymerase. Dette kan ske ved tilførsel til vært genom, for eksempel ved hjælp af kommerciel kit af λDE3 prophage. Alternativt kan stammer som BL21(DE3) foretages auxotrophic som beskrevet ovenfor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">P029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guanidine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0035.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dipotassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P749.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3904.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P030.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-alanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-arginine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3144.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-asparagine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>HN23.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T202.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3467.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3772.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3774.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glycine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3187.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-histidine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3852.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-isoleucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3922.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-leucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-methionine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>9359.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-phenylalanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4491.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-proline</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-serine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4682.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-threonine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T206.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tryptophan</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4858.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tyrosine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-valine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4879.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3746.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">magnesium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">D-glucose</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>6780</td>
			<td style="width:167px;">prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>PN93.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iron(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>372870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">biotin</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3822.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>102792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manganese(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">zinc chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>108816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">immonium orthomolybdate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>7533.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K029.5</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 100 &#181;g/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T832.2</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 50 &#181;g/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3886.1</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 5 &#181;g/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4R)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">(4R)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">(4S)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">(4R)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P074.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ethanol</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>20825.324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;">M17-broth</td>
			<td style="width:123px;">Sigmal-Aldrich, Germany</td>
			<td>56156</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, see Terzaghi BE &#38; Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">agar-agar</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>5210.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nisin from Lactococcus lactis&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">N5764</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, can be used as reference for bioactivity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">imidazole</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3899.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL autosampler vial for LC-MS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formic acid</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">29-0486-31</td>
			<td style="width:167px;">different manufacturers and resins available for IMAC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">0.45 &#181;m bottle top filter unit</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>10040-470</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">0.45 &#181;m syringe filter PVDF membrane</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">CCY1.1</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">luer-lock syringe, PP, 50 ml</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T552.2</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">30120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">TA19</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Nile red</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">72485</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli &#916;proA strain</td>
			<td style="width:123px;">CGSC, Keio collection</td>
			<td style="width:344px;">JW0233-2</td>
			<td style="width:167px;">proline-auxotrophic E. coli K-12 strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli B834(DE3)</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td>69041</td>
			<td style="width:167px;">methionine-auxotrophic E. coli B strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#955;DE3 Lysogenization Kit</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td style="width:344px;">69734-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">bacterial indicator strain, see Khusainov R &#38; Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">5427 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peristaltic pump</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">P1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FPLC system</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">&#196;kta Purifier 10 or the like</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">inverted microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:344px;">TI Eclipse wide-field fluorescence microscope&#160; with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">electron multiplying CCD (EMCCD) camera</td>
			<td style="width:123px;">Andor Technologies, UK</td>
			<td style="width:344px;">Andor Luca&#160;</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fluorescence excitation filter</td>
			<td style="width:123px;">Thorlabs, USA</td>
			<td style="width:344px;">Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC)</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">fluorescence emission filter</td>
			<td style="width:123px;">AHF Analysentechnik, Germany</td>
			<td style="width:344px;">T 560 LPXR</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cover slip 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">LH26.1</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Immersion Oil</td>
			<td style="width:123px;">Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>Immersol 518 F</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">probe sonicator</td>
			<td style="width:123px;">Bandelin, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72</td>
			<td style="width:167px;">200 W maximum HF output</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 &#181;m particle size)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">567227-U</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ESI-TOF coupled to HPLC system</td>
			<td style="width:123px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:344px;">Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids

Naturen har en bred vifte af muligheder for at skabe nye protein funktioner ved at ændre rækkefølgen af enkelte aminosyre-byggesten. Alle varianter er imidlertid baseret på de 20 kanoniske aminosyrer (CAA). Som en måde til at indføre yderligere fysisk-kemiske egenskaber i polypeptider, bruges inddragelsen af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i stigende grad i protein engineering. På grund af deres relativt korte længde er ændring af ribosomally syntetiseret og post-translationally modificeret peptider af ncAAs særligt attraktive. Nye funktionaliteter og kemiske håndtag kan genereres ved særlige ændringer af enkelte rester. Selektiv pres indarbejdelse (SPI) metode udnytter auxotrophic vært stammer, der er berøvet en essentiel aminosyre i kemisk definerede vækst medier. Flere strukturelt og kemisk lignende aminosyre analoger kan derefter aktiveres af den tilsvarende aminoacyl-tRNA syntetase og give rest-specifikke cAA(s) → ncAA(s) udskiftninger i target peptid eller protein sekvens. Selv om i forbindelse med metoden SPI, ncAAs indgår også i vært proteomet fase af rekombinant genekspression, tildeles størstedelen af cellens ressourcer til ekspression af target-genet. Dette giver mulighed for effektiv rest-specifikke indarbejdelse af ncAAs ofte ledsaget med store mængder af modificerede mål. Det præsenterede arbejde beskrives i vivo -inkorporering af seks prolin analoger i antimikrobielle peptid nisin, et lantibiotic, naturligt produceret af Lactococcus lactis. Antimikrobielle egenskaber af nisin kan ændres og yderligere udvidet i løbet af sin gæring og udtryk i auxotrophic Escherichia coli stammer i definerede vækst medier. Dermed, kan virkningerne af rest-specifikke udskiftning af CAA med ncAAs levere ændringer i antimikrobiel aktivitet og specificitet. Antimikrobiel aktivitet assays og Fluorescens mikroskopi bruges til at teste de nye nisin varianter for væksthæmning af en Gram-positive Lactococcus lactis indikator stamme. Masse spektroskopi bruges til at bekræfte ncAA indarbejdelse i bioaktive nisin varianter.

Denne protokol er designet til at aktiverer produktionen af ncAA-modificerede nisin varianter med rest-specifikke inkorporering af prolin analoger af metoden SPI. Tidligere blev feasibility og udbyttet af 24 mg/L rapporteret til rekombinant produktion af fuldt modificerede vildtype nisin39. Ved hjælp af metoden SPI, target peptid/protein udbytter er ofte god og kan nå mængder tæt på wild-type produktion48. Som første eksperimenter afprøves rekombinant vildtype RiPP produktion i den valgte auxotrophic vært. Her, proline-auxotrophic E. coli MG1655 ΔproBA:: frt ΔproC:: frt (DE3) blev brugt som vært stamme. Henblik på indbygning af ncAAs, dyrkning og induktion kan timing samt mellemstore sammensætning og temperaturen optimeres mod maksimale peptid udbytte.
Antimikrobiel aktivitet assay Wild-type rekombinant nisin produktion og rensning blev udført efter den ovennævnte protokol. I dette tilfælde blev prolin brugt i stedet for derivater ncAA på trin 3.6. En antimikrobiel aktivitet assay blev brugt til at kontrollere RiPP produktion og sammenligne den antimikrobielle aktivitet før og efter rensning. For assay aktivitet blev eluering brøker og IMAC-gennemstrømnings brugt direkte og testet mod Gram-positive L. lactis indikator stamme (figur 2). Som denne stamme udtrykker NisP, nisin varianter indeholdt i E. coli cellelysater eller renset peptid prøver, henholdsvis blive aktiveret af proteolytiske kløvningen af leader-peptid. Åbenbart, gennemstrømnings-viste vækst-hæmmende aktivitet. Dette kan forklares ved bioaktive materiale ikke bindende til kolonnen IMAC. De testede eluering fraktioner alle viste øget aktivitet i forhold til inden prøven, der angiver en koncentration af hans markeret peptid af IMAC. Bemærk at eluering buffer (som negativ kontrol) ikke påvirke væksten af L. lactis i denne analyse.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> Figur 2 . Antimikrobiel aktivitet test efter IMAC rensning af recombinantly produceret vildtype nisin. Eluering fraktioner 5 til 15 og gennemstrømningen af IMAC rensning blev testet i forhold til urensede cellens lysate (fortyndet til OD600 normalisering) mod L. lactis indikator stamme. Størrelsen af vækst hæmning glorier angiver antimikrobiel aktivitet. Chloramphenicol i en koncentration på 400 µg/mL blev anvendt som positiv kontrol og IMAC eluering buffer som negativ kontrol. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For at bevise den antimikrobiel aktivitet af recombinantly produceret nisin varianter indeholder seks forskellige prolin analoger, en aktivitet assay blev udført for at teste hæmning af L. lactis indikator stamme. Figur 3 viser væksthæmning for fem af seks prøver fremstillet ved hjælp af prolin analoger. De bedste resultater (som bedømt ud fra halo størrelser) blev observeret for iblanding eksperimenter af analog (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroxyprolin og (4S)-methanoproline. Sammenligne vækst hæmning halo størrelse til vildtype nisin produceret og testet i parallel, alle tre nisin varianter viste lignende hæmning styrke. Men halo størrelsen alene kan ikke være brugt til æsler en specifik aktivitet, da koncentrationen af AMP ikke blev bestemt. Derfor, assays tjener kun til at teste kvalitativt om antimikrobiel aktivitet af de resulterende nisin varianter er bevaret eller mistet. For at bestemme den specifikke aktivitet, skal koncentrationen af nisin varianter kvantificerede (Se diskussion).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> Figur 3 . Antimikrobiel aktivitet assay af cellelysater indeholdende nisin varianter produceret via SPI med prolin analoger. Sammenligning af nisin varianter med rekombinant vildtype prøver. Alle prøver blev OD600-normaliseret efter celle lysis i forhold til den høstede celle kultur tæthed. Glorier angiver bioactivity i form af indikator stamme væksthæmning. Første række fra venstre til højre: (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroxyprolin, (4R) - methanoproline og chloramphenicol (400 µg/mL, antimikrobiel positiv kontrol). Anden række: (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroxyprolin, (4S) - methanoproline og prolin (wild-type kontrol). Bemærk den kemiske nomenklatur; f.eks. (4R) - fluoroproline omtales også som trans-4 - fluoroproline. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
LC-ESI-TOF-massespektrometri Efter IMAC rensning, blev inkorporering af ncAAs i nisin analyseret af LC-ESI-TOF-massespektrometri. Figur 4 viser de deconvoluted massespektre af nisin variant indeholdende (4R)-fluoroproline. Denne variant var IMAC renset som beskrevet ovenfor og efterfølgende analyseres af LC-ESI-TOF-massespektrometri, så den stadig foretog lederen. Det største bjerg i figur 4A svarer til den ændrede nisin indeholdende (4R)-fluoroproline med en deconvoluted massen af 6883.18 Da (beregnede masse 6882.05 Da, beregnes massen af den tilsvarende vildtype peptid med prolin på position 9 er 6864.06 Da). De to toppe med lavere overflod og højere masse svarer til natrium adukter som angivet. Figur 4 B viser forskelligt opladet arter af vigtigste stof som findes ved deconvolution algoritme. For eksempel peak på 1148.11 m/z svarer til de seks gange ladede arter ([M + 6H]6 +).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> Figur 4 . LC-ESI-TOF-massespektrometri af IMAC-renset rekombinant nisin varianter indeholder (4R)-fluoroproline. (A) Deconvoluted massespektrometri kromatogram (zoomet ud i indsatsen) til nisin variant (stadig bærer lederen) med (4R)-fluoroproline (forventet masserne (Da): [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) sammensatte spektre for arter [M + H]+. Forventet masserne (Da): [M + 5H]5 + = 1377.41, [M + 6 H]6 + = 1148.01, [M + 7 H]7 + = 984.15, [M + 8 H]8 + = 861.26, [M + 9 H]9 + = 765.67, [M + 10 H]10 + = 689.21, [M + 11 H]11 + = 626.64, [M + 12 H] 12 + = 574.50. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Fluorescens mikroskopi Antimikrobiel aktivitet af rekombinant nisin og dens ncAA-holdige varianter kan også påvises ved direkte observation af L. lactis indikator stamme via Fluorescens mikroskopi. Nile rød, et stærkt hydrofobe fluorescerende farvestof, blev brugt til at plette den bakterielle cellemembranen. Figur 5 viser de kvalitative ændring stats sammenlægning af cellekultur og enkelt celle morfologi. Celler var farves med Nilen rød og deponeres på en mikroskopi dække dias. Den øverste række viser celler direkte i begyndelsen når buffer, rekombinant vildtype nisin eller nisin indeholder (4R)-fluoroproline, eller (4R)-hydroxyprolin blev tilføjet. Nederste panel viser de tilsvarende billeder efter 20 minutters inkubation.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> Figur 5 . Fluorescens mikroskopi af rekombinant nisin virkninger på Gram-positive celler. Mikroskopiske billeder af 30 µL L. lactis indikator stamme (OD600 = 1) markeret med Nilen red taget før (øverste panel) og efter (nederste panel) 20 min inkubation med 1 µL buffer (A), 0,3 µL rekombinant vildtype nisin (B) og 0,6 µL nisin varianter indeholder (4R)-fluoroproline (C) og (4R)-hydroxyprolin (D). Blå cirkler markerer områder med aggregerede eller deforme celler, blå pile peger på områder hvor diffusion af fluorescerende membran fragmenter kan observeres. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Figur 5 A viser, at helhedsindtrykket af cellerne ikke ændre inden for 20 minutter af observation. Kun antallet celler, der deponeres under tid rose og derfor en større mængde af celler er synlige inden for 80 µm x 80 µm i regionen observerede. Figur 5 B viser, at de Gram-positive celler optrådt samlet og sløret (markeret med blå cirkler) efter 20 minutter af eksponering for vildtype nisin, blev selv når lavt beløb (her, 0,3 µL IMAC eluering) tilføjet. Derudover diffust lys materiale fra cellerne i bufferen, der angiver, at membranen fragmenter markeret med Nilen rød blev mobiliseret under tidsramme (markeret med blå pile). Disse fund indikerer celle lysis som det viste sig at opstå ved behandling med nisin6,49. Lignende effekter blev observeret efter inkubation med den nisin variant, der indeholder (4R) - fluoroproline (figur 5C) og nisin indeholdende (4R) - hydroxyprolin (fig. 5D) begge viser stor mængder af forvrænget og aggregerede celler efter 20 minutter, i skærende kontrast til kontrolprøve (figur 5A).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4) 2 SÅ4 </td>
			<td>7.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>8,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glukose</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alle kanoniske aminosyrer (bortset fra den ene til at erstatte)</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sporstoffer (Cu2 +Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)</td>
			<td>0,01 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thiamin</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Sammensætningen af NMM19 definerede kemisk bakterievækst medium efter forberedelse efter trin 2.

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids at JoVE.com

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Protokollen præsenterer Escherichia coli-baseret selektivt pres indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i lactococcal antimikrobielle peptid nisin. Dens egenskaber kan ændres under rekombinant udtryk via substitution med ønskede ncAAs i definerede vækst medier. Deraf følgende ændringer i bioactivity er kortlagt af vækst hæmning assays og Fluorescens mikroskopi.

Antimikrobielle peptider produceret af selektiv pres indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Levering af proteiner, peptider eller celleimpermeable små molekyler i levende celler ved inkubering med Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Ammoniak syntese ved lavt tryk

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønster bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel ved hjælp af fotokemi for biologiske applikationer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Visuel genkendelse af flere nukleinsyrer i en kapillær Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Gyldne' fluorescens af selektiv pres indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer og proteinanalyse af massespektrometri og fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Microdissection af primær Renal væv segmenter og iblandingen med romanen stillads-fri konstruktion teknologi

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Vurdering af kollagen og Elastin pres-afhængige Microarchitectures i Live, menneskelige modstand arterierne af Label-fri Fluorescens mikroskopi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

Antimikrobiel karakterisering af avancerede materialer til bioteknologi applikationer

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...