Name: antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids at JoVE.com

J.H.N., T.B. en M.B. erkennen financiering door de EU FW7-programma (SYNPEPTIDE). F.-J.S. en T.F. erkennen financiering door het federale ministerie van onderwijs en wetenschap (goedgekeurd programma "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) en de Duitse Research Foundation (Cluster van Excellence "Unifying concepts in katalyse").

1. klonen van expressievectoren en transformatie van een auxotrofe productiestam
Hierin zijn de genen voor nisine biosynthese, namelijk nisABC, ontleend aan L. lactis en overgebracht naar T7 gebaseerde plasmide expressievectoren. Volledige DNA-sequenties van nisABC kunnen worden gevonden in GenBank vermelding X6830734. Het gen voor de voorloper van peptide (nisA) is gelegd op een huisdier-3a-vector die ampicilline-resistentie verleent. Genen voor de dehydratase (nisB) en cyclase (nisC) hebben gelegd op vector pRSFDuet-1, als de gerapporteerde eerdere35, waarin kanamycine weerstand verleent.
Opmerking: Voor nisA, werden de codonen van de laatste vier aminozuren (ASPR) van de leider-sequentie om te coderen VSLR36 te maken het proline-residu in de kern-peptide unieke en goede prepeptide verwerking door NisP gemuteerd. Op de N-terminus, is een label van de hexa-histidine geflankeerd door linker residuen toegevoegd voor zuivering doeleinden (Zie Figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig1.jpg"> Figuur 1 . Schematische weergave van de biosynthese en PTM van NisA in E. coli en leider decolleté door de stam van L. lactis indicator in een latere activiteit assay. In de eerste stap, de inactieve lineaire prenisin (bestaande uit een leider en een core peptide regio met een unieke proline (roze) positie 9) gecodeerd door nisA ribosoom is gesynthetiseerd. Prenisin wordt vervolgens posttranslationally gewijzigd door dehydratie van serine en threonine residuen dehydroalanine (Dha) en dehydrobutyrine (Dhb) zoals gekatalyseerd door NisB. De cyclase NisC vormt de thioether bruggen via Michael toevoeging van cysteïne sulfaatzuurstof groepen met Dha of Dhb. De inactieve gewijzigde prenisin is gezuiverd van E. coli en getest voor antimicrobiële activiteit. Hier, wordt het in de cel van de stam van de indicator Gram-positive L. lactis vervoerd. De leider is gekloofd door protease NisP (zoals aangegeven door een pijlpunt) om volledig actief nisine vrij te geven. Het kan ook worden verwijderd in vitro door behandeling met trypsine (*). <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol><li>Gebruik van standaard warmte-schok protocol37 of electroporation38 om te transformeren de proline auxotrofe E. coli stam (zie hierboven) met de plasmiden huisdier-3a nisA(VSLR) en pRSFDuet-1 nisBC.</li>
	<li>Pipetteer 25-100 µL van getransformeerde celsuspensie op agar platen met ampicilline, kanamycine en 1% (m/v) glucose. Via een spreider plaat of glaskralen te verspreiden de oplossing gelijkmatig op de platen.</li>
	<li>Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C.</li>
	<li>De volgende middag, gebruik een één kolonie om te enten 10 mL LB opslagmedium met ampicilline, kanamycine en 1% (m/v) in een maatkolf van 50 mL glucose.</li>
	<li>Schud cultuur 's nachts (12-16 h) bij 37 ° C en 200 rpm.</li>
	<li>Nemen van 250 µL steriele 80% glycerol en 550 µL cultuur, meng goed in een tube 2 mL en opslaan als bevroren cel voorraad bij 80 ° C.</li>
</ol>2. nieuwe minimaal medium (NMM) voorbereiding
Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van NMM20 als een chemisch welbepaalde vloeibare bacteriegroei-medium. Ook, is het aangeraden om het strikt volgen van de volgorde van voorbereiding. Anders, neerslag kan optreden. Controleer voor aminozuur formulieren verschilt van die welke zijn vermeld in de tabel van de materialen (bijvoorbeeld hydrochlorides), oplosbaarheid. NMM19 bevat 19 aminozuren met uitzondering van de cAA worden vervangen (hier, proline) door de ncAA analoge. Zie tabel 1 voor de laatste ingrediënt concentraties. Afhankelijk van de gebruikte voor de productie van bacteriële stam, Biotine en thiamine kunnen optioneel zijn.
<ol><li>Voorbereiding van het aminozuur mengsel<ol>
<li>Los 0,5 g Phe, Trp en Tyr in 100 mL ddH2O met de toevoeging van een paar druppels geconcentreerd HCl tot ontbinding.</li>
		<li>Weeg 0,5 g van elk van de resterende 16 aminozuren. Meng met 22 mL 1 M KH2PO4 en 48 mL 1 M K2HPO4. DdH2O aan ~ 800 mL toevoegen. Roer de oplossing pas duidelijk.</li>
		<li>Voeg de opgeloste Phe, Trp en Tyr en regel het volume van de oplossing tot 1 L met ddH2O.</li>
		<li>Het aminozuur mengsel steriliseren door vacuüm filtratie met een fles top filter eenheid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stamoplossingen voor NMM19<ol>
<li>Ten eerste bereiden 1 M stamoplossingen van de volgende onderdelen: (NH4)2dus4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 en een 5 M stockoplossing van NaCl. Steriliseren in autoclaaf.</li>
		<li>Bereiden van 50 mL voorraden van D-glucose (1 M) CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), thiamine (10 g/L), Biotine (10 g/L) en sporenelementen (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4; 1 mg/L ). Steriliseren elk door filtratie met een spuit-filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NMM19 voorbereiding<ol>
<li>Vermeng alle voorraad oplossingen om het verkrijgen van een eindconcentratie van 7,5 mM (NH4)2SO4, 1.7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 en 20 mM D-glucose, 50 mg/L aminozuur mix, 1 µg/L CaCl2en 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L thiamine, Biotine 10 mg/L, 0,01 µg/mL sporenelementen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. weergave van recombinante nisine met opneming van Proline-analogen door SPI
In deze sectie, recombinante uitdrukking van de prepeptide (hier: nisA) en PTM genen (hier: nisBC) wordt uitgevoerd. Ten eerste, cellen zijn geteeld in het bijzijn van alle burgerluchtvaartautoriteiten, aangezien LB complexe voedingsbodem wordt gebruikt. Glucose wordt toegevoegd aan de doel-genexpressie achtergrond niveau, die anders zou kunnen tot de productie van wild-type peptide leiden onderdrukken (hier: nisine) als gevolg van de leakiness van de initiatiefnemers. Pas na het doel cAA (hier: proline) is uitgeput, de ncAA wordt toegevoegd en doel genexpressie wordt geïnduceerd in chemisch beschreven medium. Incubatie van vloeibare culturen moet worden uitgevoerd in geschikte kolven met beluchting (bijvoorbeeld 500 mL in een erlenmeyer van 2 L bij 200 omwentelingen per minuut).
<ol><li>Met behulp van een steriele Pipetteer tip, vanaf een verse overnachting cultuur bevroren cel voorraad of verse kolonie (zie stap 1). Gebruik 25 mL LB medium met ampicilline, kanamycine en 1% (m/v) glucose en overnachting (12-16 h) bij 37 ° C en 200 rpm uit te broeden.</li>
	<li>1 L van steriele verse medium met 10 mL overnachting cultuur (1% v/v) beënten en incuberen bij 37 ° C en 200 rpm tot OD600 = 0,5.</li>
	<li>Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten op 4.500 x g.</li>
	<li>Giet af het supernatant en resuspendeer de pellet met 20 mL NMM19 (bereid in stap 2.3) met antibiotica en 1% (m/v) glucose. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 4.500 x g.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 500 mL hetzelfde medium en Incubeer bij 30 ° C en 200 rpm gedurende 1 uur. Opmerking: Bij deze stap, de uitputting van de cAA (hier, proline) plaatsvindt.</li>
	<li>Verdeel de cultuur in gelijke delen (één voor elke ncAA). Induceren van elke cultuur met 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en leveren van 1 mM proline analogen (4S/R- fluoroproline, 4S/R- hydroxyproline of 4S/R- methanoproline). Opmerking: Als besturingselement, één cultuur kan worden geleverd met 1 mM proline, resulterend in wild-type peptide de productie.</li>
	<li>Incubeer overnachting (12-16 h) bij 28 ° C en 200 rpm.</li>
	<li>Centrifugeer de cel culturen in 50 mL buizen bij 4 ° C gedurende 20 minuten op 5000 x g. Giet af het supernatant en bewaren van pellets bij-80 ° C tot zuivering.</li>
</ol>4. isolatie en zuivering van Zijne-gelabeld nisine-analogen
Peptiden zijn gezuiverd onder voorwaarden met guanidine hydrochloride (GuHCl)39, een sterke denatureringsmiddel denaturering.
Let op: GuHCl is schadelijk als ingeslikt of ingeademd en zorgt ervoor dat huid en ernstige oogirritatie. Draag een veiligheidsbril en handschoenen.
<ol><li>250 mL buffer (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7.4), was buffer (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM imidazool, pH 7.4) en elutie buffer (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM imidazool, pH 7.4) bindend voor te bereiden. Voor deze, breng de lichamen in een fles van 250 mL en vul aan tot 200 mL met ddH2O. Mix goed en breng de pH op 7.4 met 1 M NaOH of HCl. Dan, vul aan tot 250 mL met ddH2O. Filter alle bufferoplossingen met behulp van een fles top filter eenheid.</li>
	<li>Lysis van de cel Hier, wordt een ultrasoonapparaat (met 200 W maximale hoge frequentie (HF) output) gebruikt; Let op dat de energiebeheerinstellingen die nodig zijn voor verstoring van de cel voor andere instrumenten kunnen afwijken. Alle stappen worden uitgevoerd op het ijs. U kunt ook kan chemische cellysis, een vloeibare homogenizer of een Franse pers worden gebruikt.<ol>
<li>12 mL bindende buffer toevoegen aan elke centrifugebuis (uit stap 3.8) en resuspendeer door vortexing.</li>
		<li>Het uiteinde van de sonde ultrasoonapparaat onderdompelen in de celsuspensie. Ultrasoonapparaat vastgesteldop 40% amplitude met pulse of 1 s op / 5 s uit voor 15 min. Opmerking: Reinig de ultrasoonapparaat tip tussen monsters te vermijden van overdracht. Veeg de ultrasoonapparaat sonde met 70% ethanol.</li>
		<li>Centrifugeer het lysed celsuspensie bij 4 ° C voor 40 min bij 15.000 x g naar pellet cel puin. Het supernatant overbrengen in een nieuwe reactiebuis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chromatografie van de affiniteit Voor geïmmobiliseerdet metaalion affinity chromatografie (IMAC)40, kan een peristaltische pomp of een FPLC-systeem worden gebruikt met een 1 mL koker (hier gevuld met Ni-NTA hars). Zie stap 4.1 voor bereiding van buffers. Opmerking: IMAC zuivering is haalbaar, aangezien de geproduceerde recombinante peptide een N-terminaal zijn-gelabeld leider, die is verwijderd in stap 6 door leider peptidase NisP draagt, het vrijgeven van volwassen nisinee. Uitvoeren van zuivering bij kamertemperatuur of bij 4 ° C. Gebruik een debiet van 1 mL per minuut indien van toepassing voor de IMAC-patroon.<ol>
<li>Ten eerste was de cartridge met 5 kolom volumes (cv) van ddH2O opslag buffer verwijderen.</li>
		<li>Equilibreer met 10 cv van bindende buffer.</li>
		<li>Proces cel lysate (stap 4.2) met behulp van een injectiespuit filter voor het verwijderen van deeltjes, dan van toepassing op de cartridge.</li>
		<li>Wassen met 15 cv van was buffer om niet-specifieke en niet-afhankelijke materiaal verwijderen.</li>
		<li>Elueer met 10 cv van elutie buffer en verzamelen 1 mL breuken in 1,5 mL tubes. Bewaar de breuken bij 4 ° C voor korte termijn (maximaal 3 dagen) of bij-20 ° C voor langere termijnen.</li>
		<li>Voor de opslag, het wassen van de cartridge met 10 cv van ddH2O gevolgd door 5 cv van 20% ethanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. LC-ESI-TOF massa-spectrometrische analyse van nisine-analogen
Opmerking: Zie materialen tabel bijvoorbeeld instrumentatie voor vloeistofchromatografie gekoppeld aan electrospray ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (LC-ESI-TOF-MS).
<ol><li>HPLC-scheiding van 15-20 µL peptide oplossing (bereid in stap 4.3) uitvoeren op een C5-kolom met een mobiele fase van water (A) en acetonitril (B) beide aangevuld met 0,1% mierenzuur en een gradiënt van 5-80% B meer dan 20 min. Gebruik voor massaspectrometrie (MS), elutie na 5 min. Opmerking: Afhankelijk van de inhoud van de peptide en affiniteit met de HPLC-kolom, monster volumes en scheiding wellicht optimalisatie.</li>
	<li>Juiste software gebruiken voor het deconvolute van de gemeten massaspectra en bereken dat de kosten van de verschillende peptide verklaart41. Vergelijk de massa soort(en) waargenomen peptide de berekende wild-type massa veranderd door de cAA → ncAA substitutie. Rekening houden dat de lineaire prepeptide posttranslationally is gewijzigd door acht dehydrations (-8 H2O) en vijf cyclizations (Zie Figuur 1). Opmerking: Het gebruik van natrium-bevattende buffers, kan MS analyse in positieve Toon natrium adducten. Deze worden zichtbaar als extra pieken met hogere deconvoluted massa (voor elke natrium adductie, de waargenomen deconvoluted massa 22.99 Da hoger is). Schakel deze adducten, HPLC zuivering42 of uitgebreide dialyse43 kan worden uitgevoerd.</li>
</ol>6. antimicrobiële activiteit Test
<ol><li>Voorbereiding van GM17-agar platen onder steriele omstandigheden<ol>
<li>Een overnachting cultuur van de indicator stam L. lactis NZ9000 uitvoering plasmide pNG nisPT44 bij 30 ° C in M17 Bouillon45 met 1% (m/v)-glucose (= GM17) en 5 µg Mn/mL chlooramfenicol voor te bereiden.</li>
		<li>Meten van OD600, beënten verse middellange tot OD600 = 0.1 en incubeer tot OD600 = 0,4-0,6. Plaats de kolf dan op ijs. Opmerking: Elke OD600 meting zal verbruiken cultuur volume. Houd er rekening mee dat voor elk assay agarplaat, 1 mL bacteriecultuur nodig zullen zijn. Indien nodig, vergroot het de vloeibare cultuur volume dienovereenkomstig.</li>
		<li>Weeg voor 1,5% agar, 4.5 g agar in een fles van de media. Voeg 300 mL ddH2O, mix en autoclaaf.</li>
		<li>2 x M17 Bouillon (dubbele geconcentreerd) in 300 mL ddH2O en autoclaaf voor te bereiden.</li>
		<li>Meng 25 mL 2 x M17 bouillon met 10 µg/mL chlooramfenicol en 2% glucose met 1 mL L. lactis preculture (4% v/v).</li>
		<li>Voeg toe 25 mL gesmolten 1,5% agar (vers gesteriliseerde met autoclaaf of verwarmd in een magnetron). Opmerking: Voorafgaand aan deze, laat het afkoelen van de fles aan de Aanraking (ongeveer 50 ° C). Dit is noodzakelijk aangezien L. lactis een mesofiele organisme gevoelig is voor hoge temperaturen is.</li>
		<li>Giet de oplossing in een grote petrischaal. Droge platen voor 10-15 min.</li>
		<li>De uiteinden van een glazen pipet van Pasteur door vlam steriliseren. Wachten tot het afkoelen, en gebruik vervolgens het brede einde maken van gaten in de gestolde GM17-agar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van de monsters<ol>
<li>Neem 1 mL van de E. coli expressie culturen (gemaakt in stap 3.7) in een tube gelabelde 1,5 mL en centrifuge voor 3 min op 7.000 x g. Aspirate het resterende medium en resuspendeer de pellet cel in 500 µL nb-P (50 mM natriumfosfaat buffer pH 7.4 gemaakt van 0.5 M natriumfosfaat kaliumdiwaterstoffosfaat p.a. in water en 0.5 M Dinatrium waterstof fosfaat).</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters op ijs (vergelijk stap 4.2.2). Het uiteinde van de sonde ultrasoonapparaat onderdompelen in de celsuspensie. Ultrasoonapparaat vastgesteldop 30% amplitude met pulse of 1 s op en 5 s uit voor 3 min.</li>
		<li>Centrifugeer de cel lysate gedurende 10 minuten bij 13.000 x g naar pellet cel puin. Het supernatant overbrengen in een nieuwe reactiebuis op ijs.</li>
		<li>Verdun en normaliseren van de cel extract supernatant op 1 mL OD600 = 0,6, ten opzichte van de geoogste celdichtheid, met Na-P.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Activiteiten test<ol>
<li>Voeg 40 µL van elk genormaliseerde monster in een gat van de indicator agarplaat (Figuur 3). Het gebruik van chlooramfenicol op 400 µg/mL als antibacteriële controle samengestelde. Gebruik elutie buffer als een negatieve controle. Wacht totdat alle monsters in de agar worden verspreid. Incubeer de plaat 's nachts bij 30 ° C.</li>
		<li>Neem foto's van de agar platen met een flatbedscanner of digitale camera. Groei remming halo maten kunnen worden gemeten met de hand of met behulp van de ImageJ46.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. fluorescentie microscopie
Om te kijken wat het effect van versterkers op bacteriële cellen, kan licht- en fluorescentie microscopie worden gebruikt. Merk op dat het nisine werkingsmechanisme op de destabilisatie en de vorming van poriën in bacteriële membranen6 berust. Hier, wordt Nijl rood gebruikt om de bacteriële cel membraan, dat verspreid en geaggregeerde op cellysis wordt vlek.
Opmerking: Zie materialen tabel bijvoorbeeld instrumentatie. Hoeveelheid toegevoegde AMP oplossing kunnen worden aangepast afhankelijk van de concentratie van de peptide en topicale.
<ol><li>Voorbereiding van de cel<ol>
<li>10 mM Nijl rode stockoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) voor te bereiden.</li>
		<li>L. lactis indicator stam groeien tot OD600 = 1.0 zoals in stap 6.1.1-6.1.2.</li>
		<li>1 mL cultuur gedurende 3 minuten bij 4 ° C en 5.000 x g centrifugeren.</li>
		<li>Vloeistof wordt weggeworpen, resuspendeer in 1 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)47.</li>
		<li>Centrifuge en resuspendeer opnieuw.</li>
		<li>Voeg 1 µL Nile rode stockoplossing, meng voorzichtig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microscopische Beeldacquisitie<ol>
<li>Voeg 30 µL van cel voorbereiding op een dia dekking terwijl spannend op 520 nm.</li>
		<li>Instellen van acquisitie tijd 0,2 s, kinetische serie 0,1 Hz, serie lengte 200 beelden.</li>
		<li>Toevoegen van 0,3 - 1,5 µL van cel lysate of IMAC voorbeeld (uit stap 6.2.4 of 4.3.5, respectievelijk). Voor IMAC monsters, kan elutie buffer worden gebruikt als een negatieve controle.</li>
		<li>Monitor en record fluorescentie emissie bij λ ≥ 560 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Data-analyse<ol>
<li>Microscopie beeldsequenties worden opgeslagen als filmbestanden (AVI). Enkele beelden worden geanalyseerd met ImageJ46.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Met behulp van SPI voor het inbrengen van proline-analogen, kunnen de gerichte nisine structuren aanzienlijk worden gewijzigd, het creëren van nieuwe peptide varianten met unieke reeks combinaties en chemische eigenschappen. Op deze manier kan de fundamentele grenzen van klassieke gentechnologie worden omzeild, die is beperkt tot de oplossingen van de ketting kant van de 20 burgerluchtvaartautoriteiten. In vivo chemische diversificatie van nisine zoals wordt geïllustreerd hierboven toont een algemene aanpak ter aanvulling van de natuurlijke PTMs en de chemische ruimte van RiPPs dramatisch te verbeteren. Wij zijn van mening dat uitbreiding van het repertoire van de natuurlijke aminozuren veelbelovend met name voor versterkers geldt. In eiwitten, kan een enorme scala aan functies worden gerealiseerd door een bepaalde regeling van de 20 burgerluchtvaartautoriteiten in driedimensionale structuren. Met slechts 7-100 aa in lengte3zou de manieren om te bereiken van dergelijke structurele functies alleen door de burgerluchtvaartautoriteiten beperkt voor versterkers. Het is dus niet verwonderlijk dat natuurlijke versterkers in de vorm van RiPPs vaak uitgebreid post-translationally gemodificeerde4 zijn. Op dezelfde manier, ncAAs als alternatieve bouwstenen houden grote belofte om hun farmacodynamische en farmacokinetische parameters (Zie Baumann et al. 201735 en verwijzingen daarin).
De SPI-methodologie gebruikt in dit werk profiteert van een relatief eenvoudig experimentele opzet, eenvoudige uitvoering en hoge reproduceerbaarheid. Als gevolg van de vervanging van het globale is multisite ncAA opneming in de target peptiden ook mogelijk. Aan de andere kant, kan de methode niet toereikend zijn voor vervanging van aminozuren die vaak voorkomen in het doelproduct gen. In principe, ongewenste posities kunnen worden gewijzigd door plaats-geleide mutagenese, maar deze extra wijzigingen kunnen ook van invloed op de verschillende AMP eigenschappen met inbegrip van structuur en topicale. Zodra een auxotrofe stam voor productie beschikbaar is, kunnen verschillende ncAAs worden getest zonder ingrijpende veranderingen op het genetische niveau. Bovendien, de methode is niet beperkt tot auxotrofe E. coli stammen, maar kan ook worden uitgevoerd met behulp van de natuurlijke productie-host. Zhou et al. blijkt bijvoorbeeld dat SPI voor productie van roman RiPPs werkt ook de natuurlijk Trp-auxotroph L. lactis: met behulp van media gedefinieerd, drie tryptofaan-analogen zijn opgenomen op vier posities in nisine50.
Aangezien de SPI-methode tot wereldwijde vervanging van de gekozen leidt cAA door de ncAA, het geldt in het algemeen tot een brede waaier van doel peptides en proteïnen. Een bereik van auxotrofe E. coli stammen beschikbaar is (zie stap 1), waardoor verschillende burgerluchtvaartautoriteiten elke te beproeven voor vervanging door ncAAs. Ontmoet analogen opgenomen met behulp van metA-deficiënte stammen (bijvoorbeeld B834(DE3)) zijn meestal in dienst. Voorbeelden van isostructural Met analogen zijn azidohomoalanine (Aha) en homopropargylglycine (Hpg), verkrijgbare ncAAs dat efficiënt kan worden opgenomen. Beide introduceren bioorthogonal handgrepen waarmee bijlage van moleculen die een compatibel alkyn of azide functionaliteit, respectievelijk. Bijvoorbeeld, fluorescente kleurstoffen of polyethyleenglycol (PEG) wordt kunnen worden bevestigd door de koper (I)-gekatalyseerde azide alkyn cycloadditie (CuAAC)51.
Hoewel beide recombinante ncAA opneming methoden (SPI en SCS) meestal bereiken doelstelling in voldoende hoeveelheden, opbrengsten zijn vaak gereduceerd ten opzichte van de wild-type productie van de overeenkomstige peptides en proteïnen. Zoals de purities vaak met productie-efficiëntie correleren, mogelijk extra zuivering stappen vereist, met name voor lage-overvloedig soorten. In dit specifieke geval van de productie van recombinante nisine vereenvoudigt de leider zijn-gelabeld volgorde RiPP zuivering door selectieve verrijking van de cel lysates. De zuivering wordt weergegeven in dit protocol verbetert de zuiverheid en de concentratie van nisine, maar vaak geen oplevert AMP purities volstaat het te bepalen van de opbrengst en de specifieke activiteit. Naast de IMAC, gebruikte AMP zuivering methoden omvatten HPLC, ion exchange chromatografie (IEC) en neerslag (bijv. met behulp van aceton of Trichloorazijnzuur (TCA)) of combinaties daarvan - resulterend in een meerstaps zuivering regeling52 . Opgemerkt moet worden dat hun algemeen polycationic natuur IEC zuivering kan vergemakkelijken. Vriesdrogen wordt vaak gebruikt voor het opslaan van gezuiverde versterkers.
In het ideale geval ncAAs voor inbouw in ampère moet commercieel verkrijgbaar tegen betaalbare prijzen of gemakkelijk geproduceerd door eenvoudige en reproduceerbare chemische synthese protocollen. Een even belangrijke voorwaarde voor de SPI-methode is dat de ncAA is herkend, geactiveerd en door de jaarlijkse activiteitenverslagen van endogene of mede uitgedrukt in rekening op de cognaat tRNA gebracht. Dit kan worden getest in vitro door aminozuur activering of tRNA aminoacylation assay53. Als een gemakkelijk alternatief, SPI test expressies van model eiwitten zoals groen fluorescente proteïne (GFP) uitgevoerd zowel in aanwezigheid en afwezigheid van ncAA suppletie kunnen worden uitgevoerd. Oplosbaarheid in het medium en cel permeabiliteit van de groei, evenals de chemische stabiliteit vormen bovendien belangrijke factoren.
In dit voorbeeld werd antimicrobiële activiteit vertoond met behulp van een gram-positieve indicator-stam. Als hij de leider peptidase NisP spreekt, wordt de laatste stap van nisine rijping gekatalyseerd. Verwijdering van de leider-reeks (zijne-gelabeld voor zuivering doeleinden) kan ook worden uitgevoerd in vitro door behandeling met gezuiverde NisP50 of trypsine54. Buiten het bestek van dit werk, kunnen pathogene organismen en multi-resistente stammen vervolgens worden getest voor bacteriostatische of bactericide remming door versterkers met behulp van een soortgelijke methodologie. Klinisch relevante doelsoorten omvatten MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, immunodeficientie baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa en Klebsiella pneumoniae. Naast de verspreiding van de plaat agar assay gepresenteerde, groei remming kan ook worden uitgevoerd met behulp van passende vloeibare media geënt met de bacteriesoorten en aangevuld met AMP. Met behulp van Bouillon verdunning methoden kan de minimaal remmende concentratie (MIC) worden bepaald met behulp van zuivere peptiden55. De bepaling van de activiteit hier gepresenteerd kan ook worden gebruikt om te schatten de topicale en potentie van AMP-bevattende ten opzichte van de referentiestoffen, bijvoorbeeld in de handel verkrijgbare nisine oplossingen.
Recombinante productie van RiPPs is vaak haalbaar39, waarin vaak mede expressie van genen die PTM. Zodra de productiestam wordt omgezet in een chemisch gedefinieerde of synthetische minimaal medium met een geschikt ncAA, plaatsvindt residu-specifieke vervanging van de overeenkomstige cAA. Dus kunnen andere RiPPs worden geproduceerd door dezelfde methode, mits hun recombinante productie haalbaar is en voorwaarden kunnen worden gevonden indien ncAA opneming en PTM voldoende hoeveelheden doelproduct opbrengst. Merk op dat naast de ontvangende cel Proteoom, de peptide PTM machine kan ook worden ncAA gemodificeerde tijdens SPI. Bijgevolg kunnen de timing van doel expressie inductie en lengte van de volgende incubatieperiode optimalisatie nodig. Aangezien ncAA opneming in de PTM enzymen kan invloed hebben op hun stabiliteit en activiteit, kan de productie van het verwerkte RiPP in principe worden beïnvloed. Voldoende PTM enzym werkzaamheid wordt aangegeven door de vorming van verwerkte prepeptide, zoals gedetecteerd door MS en topicale testen. Zoals hierboven geïntroduceerde, verschillende afleidbare initiatiefnemers kon worden ingezet om te produceren de PTM genen eerst (in afwezigheid van de ncAA) gevolgd door inductie van de voorloper van peptide gen in aanwezigheid van de ncAA. In het algemeen moet de productie van cAA-bevattende doel peptide worden onderdrukt vóór toevoeging van de ncAA, vandaar dat strakke onderdrukking van het gen voorloper is vereist. Binnen dit protocol, wordt dit bereikt door katabole repressie door de toevoeging van glucose aan het groeimedium. Vooral omdat de PTM enzymen nodig voor prepeptide verwerking zijn meestal afkomstig uit een genetisch verre host, kan expressie temperatuur en codon gebruik van de overeenkomstige genen nodig optimalisatie recombinante productie nog niet is opgericht. In principe, kan de aanwezigheid van ncAAs in de prepeptide interfereren met de opname en verwerking van de PTM enzymen, in het geval van nisine NisBC en NisP. Voor de opneming van de ncAA in ampère, dus verdient voor het uitvoeren van kleinschalige expressie experimenten eerst ter identificatie van geschikte expressie voorwaarden en de betrouwbaarheid van de bepaling van de activiteit AMP.

De ontdekking van antibiotica in de twintigste eeuw en de parallelle ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële verbindingen tegen pathogene micro-organismen ingeschakeld gerichte behandelingen voor bacteriële infecties. Echter, als gevolg van de opkomst van multiresistente pathogenen, zoals methicilline-resistente Staphylococcusaureus (MRSA), vancomycine-resistente enterokokken (VRE), MDR (multiresistente) Salmonella typhimurium faag typ 10 (DT10 ), en Klebsiella pneumoniae, het is dringend noodzakelijk voor het genereren van nieuwe antimicrobiële stoffen1. Antimicrobiële peptiden (AMPs) zijn veelzijdige, vaak zeer specifieke verbindingen die veelbelovende kandidaten voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen dankzij hun fysisch-chemische eigenschappen, flexibiliteit, omvang, hydrophobicity en wijze van actie2 zijn. Versterkers zijn kleine peptiden, meestal bestaande uit 7-100 aminozuren. Vaak hebben ze een kationische structuur rijk aan positief geladen arginine en lysine residuen, die samenwerken met de gerichte microbiële celmembraan, die tegengesteld3 betaalt. Een bepaalde deelgroep van versterkers zijn ribosoom gesynthetiseerde en posttranslationally gewijzigde peptiden (RiPPs)4. Deze worden geproduceerd door vele organismen uit het Koninkrijk van schimmels en het domein van bacteriën. Een van de bekendste en meest gebruikte RiPPs is nisine, natuurlijk geproduceerd door de melkzuur-bacterie Lactococcus lactis (L. lactis). Actief tegen een panel van gram-positieve bacteriën, nisine is gebruikt als een biopreservative in de voedingsindustrie voor meer dan 50 jaar wegens haar antimicrobiële eigenschappen en het ontbreken van geëvolueerd weerstand in de gerichte microbiële stammen5. Studies hebben aangetoond dat nisinee destabiliseert en poriën in de bacteriële cel membranen, wat leidt tot antimicrobiële activiteit tegen zowel gram-positieve en gram-negatieve ziekteverwekkers6genereert. Door binding aan lipide II is de synthese van de bacteriële celwand geremde7. Nisine is gecodeerd door nisA als een voorloper van de lineaire peptide, die is samengesteld uit een leider en een core peptide regio (Figuur 1). Prenisin is na ribosomal synthese, eerst door de dehydratase NisB gewijzigd. Hier zijn de serine en threonine residuen in de regio prepeptide kern gedehydrateerde dehydroalanine (Dha) en dehydrobutyrine (Dhb)8. Vervolgens de gedehydrateerde residuen cysteïne tot formulier lanthionine ringen zijn gekoppeld (vandaar de naam "lantibioticum" voor lanthionine ring-bevattende antibiotica) door een enzym-gekatalyseerde Michael toevoeging. Deze posttranslationele wijziging (PTM) wordt gekatalyseerd door de cyclase NisC. In L. lactis, de gewijzigde prenisin is vervolgens vervoerd buiten de cel door vervoerder NisT en gekloofd de leider peptide is door de proteïnase NisP om de volwassen en actieve nisine formulier9vrij te geven. De verantwoordelijke leider peptidase NisP heeft een hoge substraat specificiteit, omdat het alleen processen gewijzigd nisine efficiënt10.
In het algemeen, voortvloeien active RiPPs uit de werking van PTM enzymen (bijvoorbeeld NisBC), die de chemische ruimte of korte peptides, bijvoorbeeld via acetylation, glycosylation, methylering fosforylatie drastisch te verhogen. Dit niveau van complexiteit kan verder worden uitgebreid door de directe integratie van ncAAs. Terwijl vaak haalbaar, is chemische synthese van versterkers een uitdaging voor grootschalige productie als gevolg van hun structurele complexiteit. Bijvoorbeeld, werd de totale chemische synthese van het lantibioticum lactosin S in stappen van 71 reactie bereikt met een definitieve rendement van 10% en die van nisine met een ruwe rendement van slechts 0.003%11,12. Biologische productie biedt daarom een levensvatbaar alternatief, als gevolg van de generatie van de juiste stereocenters en hoge product concentratie.
Tot vandaag, meer dan 150 ncAAs, bijvoorbeeld met functionele groepen met fluor of aziden, zijn opgenomen in de recombinante eiwitten, en diverse voorbeelden van gemodificeerde ncAA-AMPs geweest gerapporteerde13,14, 15,16. Met de introductie van ncAAs, kunnen roman fysisch-chemische eigenschappen worden gegenereerd ten opzichte van conventionele mutagenese. De diversiteit van de bestaande peptiden kan worden verhoogd, eventueel leiden tot nieuwe antibiotica.
Een methode voor de opneming van ncAAs in recombinante peptiden is selectieve druk opneming (SPI) gebaseerd op het gebruik van auxotrofe bacteriestammen17. Deze stammen zijn niet geschikt voor de synthese van het overeenkomstige cAA analogon van de ncAA. De methode maakt gebruik van de specificiteit van de vaak waargenomen ontspannen substraat, een functie van vele natuurlijke aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Afgezien van hun natuurlijke cAA substraten zijn deze enzymen vaak in staat te herkennen en de gewenste ncAA activeren en om het te laden op hun cognaat tRNA(s). Dit leidt tot ribosomal opneming van de ncAA in het doelproduct gen in een residu-specifieke manier (dat wil zeggen, cAA → ncAA substitutie). Dit is natuurlijk alleen mogelijk als de gewenste ncAA structureel en chemisch vergelijkbaar met het canonieke aminozuur is en getolereerd door de celfysiologie, de machine vertaling en de doelgroep peptide of eiwit sequentie. In een bepaalde experimentele opstelling, worden de auxotrofe gastheer cellen gekweekt in beschreven medium geleverd met een beperkende concentratie van het inheemse aminozuur te vervangen. De cellulaire groei of omruiling door cAA-gratis medium leidt tot uitputting van de intracellulaire van de cAA. In de volgende stap, de ncAA is toegevoegd en de genexpressie doel wordt geïnduceerd. Onvermijdelijk, ncAAs zijn nu ook verwerkt in veel andere eiwitten in de gastheercel tijdens deze fase van de target genexpressie. Echter de toxiciteit van de SPI-setup wordt gehouden op een laag niveau, omdat de Escherichia coli (E. coli)-stam wordt omgezet met een plasmide uitvoering van het target-gen onder controle van een sterke promotor (meestal de zeer concurrerende T7 promotor / RNA polymerase systeem)19. Onmiddellijk na de inductie (meestal wanneer de cAA is uitgeput), de gastheer cellen ophouden te groeien en hun cytoplasmatische enzymatische machineries worden hoofdzakelijk gebruikt voor expressie van het plasmide gebaseerde target-gen. Plaats-geleide mutagenese kan worden gebruikt om te definiëren van de site (s) van residu-specifieke ncAA installatie in de target-gen20.
Als een model voor de opneming van ncAAs peptide, werd het Pentacyclische AMP nisine A gekozen. Het is 34 aminozuren lange en heeft slechts een enkele proline residu in de kern peptide volgorde (Figuur 1). Zoals in subtilisin, ericin A en S en epidermin zo goed zoals in nisine Z en nisine Q lijkt de geconserveerde proline te zijn essentieel voor de activiteit9,21. De cAA proline speelt een bijzonder belangrijke rol in peptide-prolyl amide rotatie en de stabilisatie van de secundaire structuur. De zijketen ring conformaties (exo / endo plooien) zijn verantwoordelijk voor een thermodynamische stabilisatie van de amide-binding. Gerichte chemische wijzigingen (zoals hydroxyleringen, fluorinations, methyleringen) van prolyl plooien beïnvloeden vaak kritisch de opvouwbare stabiliteit, stijfheid van de steiger en functies van vele biologische structuren22. Het is dus aannemelijk te verwachten dat de Pro→ proline analoge substituties ring B, de tweede ring van nisine, met roman en ongebruikelijke eigenschappen begiftigen zal.
Hier, een proline-auxotrofe E. coli stam werd gebruikt voor de productie van recombinante nisinee. Dit vereist de expressie van het prepeptide gene nisA , alsmede de wijziging enzym genen nisBC. Het genetisch gecodeerde peptide-product draagt een N-terminaal zijn-gelabeld leider voor zuivering via de chromatografie van de affiniteit. Voor bepaling van de activiteit, wordt L. lactis uitdrukken en afscheidende NisPT gebruikt voor het activeren van de recombinante nisine varianten van E. coli cel lysates of gezuiverde peptide monsters (Figuur 1). De volwassen AMP wordt vrijgegeven na de splitsing van de leider door NisP. Bij deze methode agar diffusie het AMP monster diffundeert in het medium van de solide groei en kan remmen de groei van de gram-positieve micro-organisme. Na incubatie, kan dit visueel door groei remming halo's worden nageleefd. Naast L. lactis als indicatie, bewerkt nisine varianten toonden een antimicrobiële activiteit tegen Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, en Lactobacillus johnsonii 21,23.
Er is een alternatieve en experimenteel verschillende methode op te nemen ncAAs in RiPPs stop codon onderdrukking (gcv)24. Hiervoor een orthogonale tRNA / aminoacyl-tRNA synthetase (jaarlijkse activiteitenverslagen) paar is vereist voor de bijbehorende ncAA. Idealiter zijn al deze drie componenten bioorthogonal, dat wil zeggen, zij geen interactie met de endogene tRNAs en aaRSs. De jaarlijkse activiteitenverslagen van een ncAA-specifieke kan worden gegenereerd door wijziging van het enzym actieve site en screening van genetische bibliotheken van mutant synthetases25. De invoering van een ncAA vereist bovendien een codon die opnieuw is toegewezen en die doet niet coderen voor de cAA. Meestal, is de amber stop codon gebruikte24,26.
Onlangs, SPI werd opgericht voor de opneming van α-chloroacetamide-bevattende en klik-chemie-compatibele ncAAs in NisA27. Bijvoorbeeld werd Nε- VERD-lysine ingelijfd bij de lasso peptide captistruin met site-specific (gcv) en residu-specifieke (SPI) opname methoden en vervolgens gewijzigd in vitro van ruthenium-gekatalyseerde Metathese28 . In vergelijking met SPI, de methode van SCS is ingewikkelder sinds een orthogonale tRNA / jaarlijkse activiteitenverslagen paar moet worden mede uitgedrukt. Tot op heden geweest o-paren voor proline inbouw ontwikkelde29, maar tot de beste van onze kennis, geen voorbeeld van proline analoge opname is gemeld.
Opgemerkt moet worden dat niet alle ncAAs kunnen worden opgenomen in de hand van de SPI-methodologie. Ten eerste, de opname van ncAAs in het cytoplasma wordt geregeld door een veelheid van vervoer eiwitten die zijn ingesloten in de cytoplasmatische membraan, dat de binnenste membraan voor gramnegatieve bacteriën zoals E. coli is. Normaal gesproken is E. coli is geschikt voor het vervoer van een breed scala van aminozuur-analogen in de cel met de zijketens structureel en chemisch vergelijkbaar met canonieke aminozuren. Tweede, veel chemisch reactieve of instabiele ncAAs zou kunnen fungeren als een inhibitor van de omwenteling naar cellulaire groei, zoals ze giftig zijn voor het metabolisme en fysiologie van de ontvangende cel30. Dus, de opname en de toxiciteit van de ncAA voor de productie-host moeten worden getest vooraf. Om te voorkomen dat de inactivering van de PTM machine als een bijwerking, een strikt gecontroleerde expressie setup van de verantwoordelijke genen kan worden gebruikt om het natuurlijke aminozuur integreren de wijziging enzymen (bijvoorbeeld nisBC) en de ncAA in het target-gen ( bijvoorbeeld, nisA). Dit kan worden bereikt met behulp van twee verschillende initiatiefnemers en inductie van doel genexpressie, zoals aangetoond in speciaal ontworpen SPI protocollen31. Zoals hierboven beschreven, berust de SPI-methode op de specificiteit van de ontspannen substraat van de jaarlijkse activiteitenverslagen, waarmee voor activering van de ncAA en cognaat tRNA opladen. Vervolgens wordt het tRNA geleverd aan het ribosoom gevolgd door amide binding vorming en vouwen van de doelgroep (poly) peptide. In deze processen, kunnen proeflezen en bewerken van mechanismen worden relevante32. Om deze redenen is het van groot belang voor het hebben van een doel ncAA dat structureel en chemisch lijkt op de cAA. Andere belangrijke punten zijn voldoende stabiliteit (zowel in de media van de groei en blootgesteld aan het cellulaire metabolisme) en oplosbaarheid van de ncAA. Bovendien moet het commercieel beschikbaar of gemakkelijk te chemisch gesynthetiseerd worden.
Hier beschrijven we een protocol voor SPI, waardoor residu-specifieke opneming van ncAAs in recombinante RiPPs. Met name, verschillende proline-analogen worden opgenomen in het antimicrobiële peptide nisine A met behulp van E. coli als ontvangende organisme. Massaspectrometrie wordt gebruikt om te controleren of aminozuur vervanging en peptide producten worden geanalyseerd op topicale met behulp van groei remming testen en fluorescentie microscopie met behulp van de indicator van de microbiële stammen.
De basisvoorwaarde voor succesvol recombinante nisine expressie met gedefinieerde ncAAs vereist een geschikt proline auxotrofe stam E. coli . Voor dit auxotrophy, proA moet disfunctionele, bijvoorbeeld bereikt door genomic knock-out. Cellen volledig verstoken van intracellulaire Pro biosynthese (dat wil zeggen, de verwijdering van proABC) zonder mogelijkheid om terugkeer zijn stabiele auxotrophs. Gebruikte gene knockout methoden zijn faag transductie of single-gen knockout volgens Datsenko & Wanner33. Bovendien kunnen proA knockout stammen worden verkregen uit openbare repositories zoals Addgene, CGSC of de Keio-collectie. Aangezien de expressie van de recombinante nisABC hier worden weergegeven, is afhankelijk van het gebruik van T7 initiatiefnemers, heeft de expressie host stam daartoe een afleidbare gen voor T7 RNA-polymerase. Dit kan worden bereikt door invoering van de λDE3 prophage in het genoom van de gastheer, bijvoorbeeld met behulp van de commerciële kit. Stammen zoals BL21(DE3) kunnen u auxotrofe zoals hierboven beschreven gemaakt worden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">P029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guanidine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0035.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dipotassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P749.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3904.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P030.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-alanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-arginine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3144.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-asparagine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>HN23.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T202.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3467.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3772.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3774.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glycine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3187.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-histidine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3852.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-isoleucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3922.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-leucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-methionine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>9359.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-phenylalanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4491.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-proline</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-serine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4682.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-threonine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T206.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tryptophan</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4858.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tyrosine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-valine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4879.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3746.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">magnesium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">D-glucose</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>6780</td>
			<td style="width:167px;">prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>PN93.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iron(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>372870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">biotin</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3822.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>102792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manganese(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">zinc chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>108816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">immonium orthomolybdate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>7533.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K029.5</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 100 &#181;g/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T832.2</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 50 &#181;g/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3886.1</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 5 &#181;g/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4R)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">(4R)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">(4S)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">(4R)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P074.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ethanol</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>20825.324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;">M17-broth</td>
			<td style="width:123px;">Sigmal-Aldrich, Germany</td>
			<td>56156</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, see Terzaghi BE &#38; Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">agar-agar</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>5210.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nisin from Lactococcus lactis&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">N5764</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, can be used as reference for bioactivity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">imidazole</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3899.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL autosampler vial for LC-MS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formic acid</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">29-0486-31</td>
			<td style="width:167px;">different manufacturers and resins available for IMAC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">0.45 &#181;m bottle top filter unit</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>10040-470</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">0.45 &#181;m syringe filter PVDF membrane</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">CCY1.1</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">luer-lock syringe, PP, 50 ml</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T552.2</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">30120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">TA19</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Nile red</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">72485</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli &#916;proA strain</td>
			<td style="width:123px;">CGSC, Keio collection</td>
			<td style="width:344px;">JW0233-2</td>
			<td style="width:167px;">proline-auxotrophic E. coli K-12 strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli B834(DE3)</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td>69041</td>
			<td style="width:167px;">methionine-auxotrophic E. coli B strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#955;DE3 Lysogenization Kit</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td style="width:344px;">69734-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">bacterial indicator strain, see Khusainov R &#38; Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">5427 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peristaltic pump</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">P1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FPLC system</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">&#196;kta Purifier 10 or the like</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">inverted microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:344px;">TI Eclipse wide-field fluorescence microscope&#160; with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">electron multiplying CCD (EMCCD) camera</td>
			<td style="width:123px;">Andor Technologies, UK</td>
			<td style="width:344px;">Andor Luca&#160;</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fluorescence excitation filter</td>
			<td style="width:123px;">Thorlabs, USA</td>
			<td style="width:344px;">Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC)</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">fluorescence emission filter</td>
			<td style="width:123px;">AHF Analysentechnik, Germany</td>
			<td style="width:344px;">T 560 LPXR</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cover slip 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">LH26.1</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Immersion Oil</td>
			<td style="width:123px;">Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>Immersol 518 F</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">probe sonicator</td>
			<td style="width:123px;">Bandelin, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72</td>
			<td style="width:167px;">200 W maximum HF output</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 &#181;m particle size)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">567227-U</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ESI-TOF coupled to HPLC system</td>
			<td style="width:123px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:344px;">Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids

De natuur heeft een scala aan mogelijkheden nieuwe om eiwitfuncties te maken door het wijzigen van de volgorde van de bouwstenen voor de individuele aminozuur. Alle variaties zijn echter gebaseerd op de 20 canonieke aminozuren (burgerluchtvaartautoriteiten). Als een manier om aanvullende fysisch-chemische eigenschappen in polypeptiden, wordt de opneming van de niet-canonieke aminozuren (ncAAs) steeds meer gebruikt in Eiwittechnologie. Als gevolg van de relatief korte lengte is de wijziging van ribosoom gesynthetiseerde en post-translationally gewijzigde peptiden door ncAAs bijzonder aantrekkelijk. Nieuwe functionaliteiten en chemische handgrepen kunnen worden gegenereerd door specifieke wijzigingen van individuele residuen. De selectieve druk opneming (SPI) methode maakt gebruik van auxotrofe host stammen die zijn beroofd van een essentieel aminozuur in chemisch welbepaalde groei media. Verschillende structureel en chemisch soortgelijke aminozuur-analogen kunnen dan geactiveerd worden door de overeenkomstige aminoacyl-tRNA synthetase en bieden residu-specifieke cAA(s) → ncAA(s) vervangingen in het doel peptide of eiwit sequentie. Hoewel, in het kader van de SPI-methode, ncAAs zijn ook opgenomen in de host Proteoom tijdens de fase van recombinante genexpressie, worden de meerderheid van de cel van de middelen toegewezen aan de expressie van het target-gen. Hierdoor efficiënt residu-specifieke opneming van ncAAs vaak gepaard met hoge bedragen van gemodificeerde doel. Het gepresenteerde werk beschrijft de opneming in vivo van zes proline-analogen in de antimicrobiële peptide nisine, een natuurlijk geproduceerd door Lactococcus lactislantibioticum. Antimicrobiële eigenschappen van nisine kunnen worden veranderd en verder uitgebreid tijdens de gisting en expressie in de auxotrofe Escherichia coli stammen in gedefinieerde groei media. Daarmee kunnen de effecten van residu-specifieke vervanging van burgerluchtvaartautoriteiten met ncAAs wijzigingen leveren in antibacteriële activiteit en specificiteit. Antimicrobiële activiteit testen en fluorescentie microscopie worden gebruikt voor het testen van de nieuwe varianten van nisine voor groeiremming van een gram-positieve Lactococcus lactis indicator stam. Massaspectrometrie wordt gebruikt voor het bevestigen van de ncAA opneming in bioactieve nisine varianten.

Dit protocol is ontworpen om de vervaardiging van nisine ncAA gemodificeerde varianten met residu-specifieke opneming van proline-analogen door de SPI-methode. Eerder, de haalbaarheid en de opbrengsten van 24 mg/L voor recombinante productie van volledig gemodificeerde wild-type nisine39werden gemeld. Met behulp van de methode van de SPI, doel peptide/eiwit opbrengsten zijn vaak goed en hoeveelheden dicht bij wild-type productie48kunnen bereiken. Als eerste experimenten, moet recombinante wild-type RiPP productie worden beproefd in de gekozen auxotrofe host. Hier, de proline-auxotrofe E. coli MG1655 ΔproBA:: frt ΔproC:: frt (DE3) werd gebruikt als host stam. Voor de opneming van ncAAs, teelt en inductie kunnen timing, alsmede middelgrote samenstelling en temperatuur worden geoptimaliseerd naar maximale peptide opbrengst.
Antimicrobiële activiteit assay Wild-type recombinante nisine productie en zuivering werden uitgevoerd volgens de bovenstaande protocol. In dit geval werd proline gebruikt in plaats van afgeleiden ncAA bij stap 3.6. Een antimicrobiële activiteit assay werd gebruikt en vergelijk de antimicrobiële activiteit vóór en na de zuivering te controleren RiPP productie. Voor de activiteit assay, werden elutie breuken en IMAC doorstroming gebruikt direct en getoetst aan de gram-positieve L. lactis indicator stam (Figuur 2). Als deze spanning spreekt NisP, het nisine varianten opgenomen in E. coli cel lysates of peptide monsters, respectievelijk, gezuiverd worden geactiveerd door Proteolytische splitsing van de leider-peptide. Blijkbaar, de doorstroom toonden een groei-inhiberende activiteit. Dit kan worden verklaard door bioactieve materiaal niet binden aan de IMAC-kolom. De geteste elutie van alle fracties toonde verhoogde activiteit t.o.v. het ongezuiverde monster, die een concentratie van de peptide zijn-gelabeld door IMAC aangeeft. Merk op dat de elutie buffer (als negatieve controle) heeft geen invloed op de groei van L. lactis in deze test.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> Figuur 2 . Antimicrobiële activiteit testen nadat IMAC zuivering van recombinantly wild-type nisine geproduceerd. Elutie breuken 5 tot en met 15 en de stroom door middel van IMAC zuivering werden getest in vergelijking met de ongezuiverde cel lysate (verdund voor OD600 normalisatie) tegen de stam van L. lactis indicator. De grootte van groei remming halo's geeft antimicrobiële activiteit. Chlooramfenicol bij een concentratie van 400 µg/mL werd gebruikt als positieve controle en de IMAC elutie buffer als negatieve controle. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Geproduceerd nisine varianten met zes verschillende proline-analogen, een activiteit assay werd uitgevoerd om te testen de remming van de stam van L. lactis indicator om te bewijzen dat de antibacteriële activiteit van recombinantly. Figuur 3 toont groeiremming voor vijf van de zes steekproeven geproduceerd met behulp van proline-analogen. De beste resultaten (zoals beoordeeld vanuit halo maten) werden waargenomen voor de experimenten van de opneming van analoge (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroxyproline en 4S-methanoproline. Vergelijken van halo grootte van de remming van de groei tot het wild-type nisine geproduceerd en getest in parallel, alle drie nisine varianten toonde soortgelijke remming kracht. Echter, de halo grootte alleen kan niet worden gebruikt om ezels een specifieke activiteit, aangezien de concentratie van AMP was niet bepaald. Daarom dienen de tests te kwalitatief testen of de antibacteriële activiteit van de resulterende nisine varianten wordt bewaard of verloren. Om te bepalen van de specifieke activiteit, moet de concentratie van de nisine varianten gekwantificeerde (zie discussie).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> Figuur 3 . Antimicrobiële activiteit assay van cel lysates met nisine varianten geproduceerd via SPI met proline analogen. Vergelijking van nisine varianten met recombinant wild-achtige monsters. Alle monsters werden OD600-genormaliseerd na lysis van de cel ten opzichte van de geoogste celdichtheid cultuur. Halo's geven topicale in vorm van indicator stam groeiremming. Eerste rij van links naar rechts: (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroxyproline, (4R) - methanoproline en chlooramfenicol (400 µg/mL; antimicrobiële positieve controle). Tweede rij: (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroxyproline, (4S) - methanoproline en proline (wild-type controle). Opmerking de chemische nomenclatuur; bijvoorbeeld, (4R) - fluoroproline wordt ook aangeduid als trans-4 - fluoroproline. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De Spectrometrie van de massa van de LC-ESI-TOF Na de zuivering van de IMAC, was de integratie van de ncAAs in nisine geanalyseerd door de Spectrometrie van de massa van de LC-ESI-TOF. Figuur 4 toont de deconvoluted massaspectra van een variant van de nisine met (4R)-fluoroproline. Deze variant werd IMAC gezuiverd zoals hierboven beschreven en daarna geanalyseerd door LC-ESI-TOF massa spectrometrie, zodat het nog steeds de leider gedragen. De belangrijkste piek in Figuur 4A komt overeen met het gewijzigde nisine met (4R)-fluoroproline met een deconvoluted massa van 6883.18 Da (berekende massa 6882.05 Da, berekend massa van de overeenkomstige wild-type peptide met proline op positie 9 is 6864.06 Da). De twee bergtoppen met lagere overvloed en grotere massa correspondeert met natrium adducten zoals aangegeven. Figuur 4 B toont anders opgeladen soorten de belangrijkste samengestelde als gevonden door de deconvolutie algoritme. Bijvoorbeeld, de piek op 1148.11 m/z komt overeen met de six-fold geladen soorten ([M + 6H]6 +).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> Figuur 4 . LC-ESI-TOF massa spectrometrie van recombinante nisine IMAC-gezuiverd varianten met (4R)-fluoroproline. (A) Deconvoluted massaspectrometrie chromatografische (uitgezoomd in de inzet) voor de variant van de nisine (nog steeds de leider uitvoering) met (4R)-fluoroproline (verwacht massa (Da): [M + H]+ 6882.05, [M + nb]+ = 6904.03, = [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) samengestelde spectra voor soorten [M + H]+. Verwacht van de massa's (Da): [M + 5H]5 + = 1377.41, [M + 6 H]6 + = 1148.01, [M + 7 H]7 + = 984.15, [M + 8 H]8 + = 861.26, [M + 9 H]9 + = 765.67, [M + 10 H]10 + 689.21, = [M + 11 H]11 + = 626.64, [M + 12 H] 12 + = 574.50. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Fluorescentie microscopie Antimicrobiële activiteit van recombinante nisine en ncAA-bevattende varianten kan ook worden weergegeven door directe observatie van de L. lactis indicator stam via fluorescentie microscopie. Nile rood, een zeer hydrofobe fluorescente kleurstof, werd gebruikt om de bacteriële cel membraan vlek. Figuur 5 toont de kwalitatieve verandering van de aggregatie-staat van de cultuur van de cel en eencellige morfologie. Cellen werden gekleurd met Nile rood en gestort op een dia microscopie dekking. De bovenste rij toont de cellen direct bij het begin wanneer de buffer, recombinante wild-type nisine, die geheel of nisine (4R)-fluoroproline, of lid 4R-hydroxyproline werden toegevoegd. Het onderste deelvenster toont de bijbehorende beelden na 20 minuten van incubatie.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> Figuur 5 . Fluorescentie microscopie van recombinante nisine effecten op gram-positieve cellen. Microscopische beelden van 30 µL L. lactis indicator stam (OD600 = 1) gemarkeerd met Nile rood werden genomen voordat (bovenste deelvenster) en na (lagere paneel) 20 min incubatie met 1 µL buffer (A), 0,3 µL recombinante wild-type nisine (B) en 0.6 µL nisine varianten met (4R)-fluoroproline (C) en (4R)-hydroxyproline (D). Blauwe cirkels markeren gebieden met de geaggregeerde of misvormde cellen, blauwe pijlen punt aan regio's waar de verspreiding van fluorescerende membraan fragmenten kan worden waargenomen. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Figuur 5 A toont dat het algemene uiterlijk van de cellen niet binnen 20 minuten van waarneming veranderde. Alleen het aantal cellen dat tijdens de tijd roos gestort en dus een grotere hoeveelheid cellen is zichtbaar binnen de 80 µm x 80 µm van de waargenomen regio. Figuur 5 B toont dat de gram-positieve cellen geaggregeerde verscheen en wazig (gemarkeerd met blauwe cirkels) na 20 minuten van de blootstelling aan wild-type nisine, werden zelfs bij lage bedragen (hier, 0,3 µL IMAC elutie) toegevoegd. Daarnaast licht materiaal verspreid van de cellen in de buffer, die aangeeft dat de membraan fragmenten gemarkeerd met Nile rode waren gemobiliseerd tijdens de termijn (aangegeven door blauwe pijlen). Deze bevindingen wijzen erop lysis van de cel, het was dan ook optreden bij behandeling met nisine6,49zoals. Soortgelijke effecten werden waargenomen na incubatie met de nisine variant bevat (4R) - fluoroproline (Figuur 5C) en (4R) met nisine - hydroxyproline (Figuur 5D) beide tonen grote hoeveelheden vervormd en geaggregeerde cellen na 20 minuten, in schril contrast met de controlemonster (Figuur 5A).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Component</td>
			<td>Concentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4) 2 ZO4 </td>
			<td>7.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>8,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alle canonieke aminozuren (met uitzondering van degene die te vervangen)</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sporenelementen (Cu2 +Zn2 +Mn2 +, Yaoundé2 +)</td>
			<td>0,01 µg Mo/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thiamine</td>
			<td>10 µg Mo/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotine</td>
			<td>10 µg Mo/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Samenstelling van NMM19 chemisch welbepaalde bacteriegroei medium na bereiding volgens stap 2.

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids at JoVE.com

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Het protocol stelt de Escherichia coli-selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in het lactococcal antimicrobiële peptide nisine gebaseerd. De eigenschappen kunnen worden gewijzigd tijdens de recombinante expressie via substitutie met de gewenste ncAAs in de gedefinieerde groei media. Resulterende mutaties in de topicale worden toegewezen door groei remming testen en fluorescentie microscopie.

Antimicrobiële peptiden geproduceerd door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Synthese van ammoniak bij lage druk

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Microdissection van primaire renale weefsel segmenten en integratie met nieuwe steiger-vrije constructie technologie

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

Antimicrobiële karakterisering van geavanceerde materialen voor Bioengineering toepassingen

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...