Name: antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00
Duration: 11 min 56 s
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J.H.N., T.B. et M.B. reconnaissent le financement par le programme UE FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. et T.F. reconnaissent le financement par le ministère fédéral de l’éducation et la Science (BMBF programme « HSP 2020 », TU-WIMIplus projet SynTUBio) et la Fondation de recherche allemande (Cluster d’Excellence « Unifying concepts in Catalysis »).

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

En utilisant SPI pour l’insertion des analogues de la proline, les structures ciblées nisine peuvent être substantiellement modifiés, créant des variantes de nouveau peptide avec combinaisons de séquence unique et propriétés chimiques. De cette façon, la limite de base de la technologie génétique classique peut être contournée, qui est contraint des chimies de chaîne latérale des 20 cAAs. In vivo la diversification chimique de la nisine comme illustré ci-dessus illustre une approche générale pour compléter la SPTM naturelle et pour rehausser de façon spectaculaire l’espace chimique des RiPPs. Nous croyons qu’élargir le répertoire des acides aminés naturels très prometteur surtout pour amplis. Dans les protéines, un énorme éventail de fonctionnalités peut être réalisé grâce à un arrangement défini des 20 cAAs dans les structures tridimensionnelles. Avec seulement 7-100 aa en longueur3, moyens d’atteindre ces caractéristiques structurales que par le biais de cAAs serait limités pour les amplis. Il n’est donc pas surprenant que naturels ampères sous forme de RiPPs sont généralement largement sera mis à jour le4. De la même façon, ANAC comme blocs de construction alternatives est très prometteurs pour améliorer leurs paramètres pharmacodynamiques et pharmacocinétiques (voir Baumann et coll. 201735 et les références qui y sont).
La méthodologie SPI utilisée dans ce travail bénéficie d’un montage expérimental relativement facile, d’exécution simple et reproductibilité élevée. En raison de la substitution globale, multisite incorporation de ncAA de peptides de la cible est également réalisable. En revanche, la méthode peut ne pas convenir pour le remplacement des acides aminés qui se produisent fréquemment dans le produit du gène cible. En principe, postes non désirés peuvent être modifiés par mutagenèse dirigée, mais ces modifications supplémentaires pourraient également affecter plusieurs propriétés AMP, y compris la structure et la bioactivité. Une fois une souche auxotrophe pour la production disponible, plusieurs ANAC peut être testé sans nécessiter de modifications importantes sur le plan génétique. En outre, la méthode n’est pas limitée à auxotrophes e. coli souches, mais peuvent également être effectuées à l’aide de l’hôte de production naturelle. Par exemple, Zhou et coll. ont montré que SPI pour la production de nouveaux RiPPs travaille également le naturellement Trp-auxotrophe L. lactis: l’utilisation définie des médias, trois analogues de tryptophane ont été incorporées aux quatre positions dans la nisine50.
Étant donné que la méthode SPI conduit à un remplacement global de l’Elu cAA de la ncAA, il est généralement applicable à un large éventail de cibles peptides et protéines. Une gamme d’auxotrophes e. coli souches est disponible (voir étape 1), permettant plusieurs cAAs chaque à tester pour le remplacement de l’ANAC. A rencontré analogues incorporés à l’aide de metA-souches déficients (par exemple, B834(DE3)) sont plus couramment employées. Exemples d’isostructuraux Met analogues sont azidohomoalanine (Aha) et homopropargylglycine (Hpg), ANAC commercialement disponible qui peut être intégré de manière efficace. Les deux introduisent bioorthogonal poignées qui permettent la fixation des molécules transportant un alcyne compatible ou la fonctionnalité de l’azoture, respectivement. Par exemple, les colorants fluorescents ou moitiés de polyéthylène glycol (PEG) peuvent être attachées en cuivre (I)-catalysée de l’azoture alcyne cycloaddition (CuAAC)51.
Bien que les deux méthodes d’incorporation de ncAA recombinante (SPI et SCS) généralement obtenir des quantités suffisantes de cible, les rendements sont souvent réduits par rapport au type sauvage production des protéines et des peptides correspondants. Comme souvent, les puretés sont corrélés à l’efficacité de production, étapes de purification supplémentaire peuvent être nécessaires, surtout pour les espèces peu abondantes. Dans ce cas particulier de la production de la nisine recombinant, la séquence His-tag simplifie grandement la purification RiPP par enrichissement sélectif des lysats cellulaires. La purification montrée dans ce protocole améliore la pureté et la concentration de la nisine, mais ne donne pas souvent de puretés AMP suffisantes pour déterminer le rendement et l’activité spécifique. En plus de l’IMAC, méthodes de purification des AMP couramment utilisées incluent HPLC, chromatographie échangeuse d’ions (IEC) et les précipitations (par exemple. à l’aide d’acétone ou l’acide trichloracétique (TCA)) ou une combinaison - résultant en un système de purification multi-étapes52 . Il est à noter que leur communément polycationiques nature peut faciliter la purification de la CEI. Lyophilisation est fréquemment utilisée pour stocker des amplis purifiées.
Idéalement, ANAC pour incorporation dans ampères devrait être disponible dans le commerce à des prix abordables ou facilement produites par les protocoles de synthèse chimique simple et reproductible. Une condition tout aussi importante pour la méthode SPI est que la ncAA est reconnu, activé et pratiqués sur l’ARNt apparenté par les RAA endogènes ou conjointement exprimées. Cela peut être testé in vitro par acide aminé activation ou ARNt aminoacylation dosage53. Comme une alternative simple, expressions de test SPI de protéines de modèle comme la protéine fluorescente verte (GFP) menée tous les deux en présence et en absence de supplémentation en ncAA peuvent être réalisées. En outre, solubilité dans la perméabilité moyenne et cellules de croissance ainsi que stabilité chimique constituent des facteurs importants.
Dans cet exemple, une activité antimicrobienne a été projetée à l’aide d’une souche de bactéries Gram-positives indicatrice. Comme il exprime la peptidase chef NisP, l’étape finale de la maturation de la nisine est catalysée. Suppression de la séquence de tête (son marqués à des fins de purification) peut également être réalisée in vitro par traitement avec purifiée NisP50 ou la trypsine54. Au-delà de la portée de ce travail, des organismes pathogènes et des souches multirésistantes peuvent ensuite être testés pour l’inhibition bactériostatique ou bactéricide par SAP en utilisant une méthodologie similaire. Espèces cibles cliniquement pertinents comprennent la SARM, MDR, Mycobacterium tuberculosis, ERV, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. Outre la diffusion de plaques de gélose test présenté ici, croissance inhibition peut également être effectuée à l’aide des milieux liquides appropriés inoculés avec l’espèce bactérienne et additionné de AMP. À l’aide de méthodes de dilution en bouillon, la concentration minimale inhibitrice (CMI) peut être déterminée à l’aide de peptides pure55. Le dosage de l’activité présenté ici permet également d’estimer la bioactivité et la puissance des solutions contenant de l’AMP par rapport aux composés de référence, la nisine par exemple disponible dans le commerce.
Production par recombinaison génétique de RiPPs est souvent faisable39, qui comprend généralement la co-expression de gènes PTM. Dès que la souche de production est transférée dans un milieu minimal chimiquement défini ou synthétique contenant une ncAA adapté, le remplacement de résidus spécifiques de la cAA correspondant a lieu. Ainsi, autres RiPPs peuvent être produites par la même méthode, pourvu que leur production recombinante est réalisable et conditions se retrouvent lorsque l’incorporation de la ncAA et PTM rendement une quantité suffisante de produit cible. Notez qu’outre le protéome de cellule hôte, la machinerie PTM peptide peut aussi devenir ncAA modifiés au cours de SPI. En conséquence, le moment de l’induction d’expression cible et de la durée de la période d’incubation suivant peuvent exiger optimisation. Étant donné que l’incorporation de ncAA dans les enzymes PTM peut affecter leur stabilité et leur activité, la production de la RiPP transformé peut en principe être affectée. Suffisante efficacité enzymatique PTM est indiquée par la formation de prépeptide transformé, tel que détecté par MS et bioactivité des essais. Tel que présenté ci-dessus, différents promoteurs inductibles pourraient être employées pour produire le PTM gènes tout d’abord (en l’absence de la ncAA) suivie de l’induction du gène peptide précurseur en présence de la ncAA. En général, la production du peptide cible cAA-contenant doit être supprimée avant l’addition de la ncAA, c’est pourquoi la répression serrée du gène précurseur est requise. Dans ce protocole, ceci est réalisé par la répression catabolique par l’addition de glucose dans le milieu de croissance. Surtout depuis que les enzymes PTM requises pour le traitement prepeptide proviennent habituellement d’un hôte génétiquement éloigné, utilisation de température et codon d’expression des gènes correspondants peut nécessiter l’optimisation si production recombinante n’a pas encore été mis en place. En principe, la présence de l’ANAC dans le prépeptide peut interférer avec la reconnaissance et le traitement des enzymes PTM, dans le cas de la nisine, NisBC et NisP. Pour l’incorporation de ncAA dans SAP, il est donc recommandé d’effectuer des expériences à petite échelle expression tout d’abord pour identifier les conditions de l’expression appropriée et la fiabilité du test de l’activité de l’AMP.

La découverte des antibiotiques dans le XXe siècle et le développement parallèle de nouveaux composés antimicrobiens contre les microorganismes pathogènes activées ciblée traitements des infections bactériennes. Cependant, en raison de l’émergence de pathogènes multirésistants comme résistant à la méthicilline Staphylococcusaureus (SARM), les entérocoques résistant à la vancomycine (ERV), MDR (pharmaco-résistante) Salmonella typhimurium phage type 10 (DT10 ), et Klebsiella pneumoniae, il est urgent générer de nouveaux agents antimicrobiens1. Peptides antimicrobiens (ampères) sont des composés polyvalents, souvent très spécifiques qui sont prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments grâce à leurs propriétés physico-chimiques, flexibilité, taille, hydrophobie et mode d’action2. Ampères sont de petits peptides se compose habituellement d’acides aminés 7-100. Souvent, ils ont une structure cationique riche en résidus chargés positivement d’arginine et la lysine, qui interagissent avec la membrane cellulaire microbienne ciblée, qui est chargée de façon opposée3. Un sous-groupe particulier des amplis sont des peptides ribosomally synthétisés et après modification (RiPPs)4. Elles sont produites par nombreux organismes du Royaume des champignons et du domaine des bactéries. L’un des plus connus et largement utilisés RiPPs est la nisine, naturellement produite par la bactérie lactique acide Lactococcus lactis (L. lactis). Active contre un groupe de bactéries à Gram positif, la nisine a été utilisée comme un biopreservative dans l’industrie alimentaire depuis plus de 50 ans en raison de ses propriétés antimicrobiennes et l’absence de résistance évoluée dans les souches microbiennes ciblées5. Études ont montré que la nisine déstabilise et génère des pores dans les membranes cellulaires bactériennes, conduisant à une activité antimicrobienne contre les deux agents pathogènes Gram-positifs et Gram-négatives6. En se liant au lipide II, synthèse de la paroi cellulaire bactérienne est inhibé7. La nisine est codée par CSRN comme un peptide précurseur linéaire, qui est composé d’un chef de file et une région de peptide de base (Figure 1). Après la synthèse ribosomique, prenisin modifie tout d’abord le déshydratase NisB. Ici, les résidus sérine et thréonine dans la région de noyau prepeptide sont déshydratés à dehydroalanine (Dha) et dehydrobutyrine (Dhb)8. Par la suite, les résidus déshydratés sont couplés avec la cystéine à anneaux lanthionine forme (d'où le nom « lantibiotique » pour lanthionine anneau contenant antibiotiques) par une addition de Michael catalysées par les enzymes. Cette modification post-traductionnelle (PTM) est catalysée par l’adénylcyclase NisC. Chez L. lactis, le mis à jour le prenisin est ensuite transporté hors de la cellule par transporteur NisT et peptide leader est clivé par la protéinase NisP pour libérer la nisine mature et active forme9. La peptidase de dirigeant responsable NisP a une spécificité de substrat élevé, puisqu’il uniquement les processus modifiés nisine efficacement10.
En général, RiPPs actives résultent de l’action des enzymes PTM (par exemple NisBC), qui augmentent considérablement l’espace chimique des peptides courts, par exemple, par acétylation, glycosylation, méthylation ou phosphorylation. Ce niveau de complexité peut être étoffé par l’incorporation directe de l’ANAC. Alors que souvent c’est possible, la synthèse chimique des amplis est un défi pour une production à grande échelle en raison de leur complexité structurelle. Par exemple, la synthèse chimique totale de la lactosin lantibiotique S dans 71 étapes réactionnelles a été atteint avec un rendement final de 10 % et celui de la nisine avec un rendement brut de seulement 0,003 %11,12. Par conséquent, la production biologique offre une alternative viable, en raison de la génération de stéréocentres correcte et de la concentration élevée du produit.
Jusqu'à aujourd'hui, plus de 150 ANAC, par exemple, avoir des groupes fonctionnels contenant du fluor ou azotures, ont été incorporés dans les protéines recombinantes, et plusieurs exemples des amplis ncAA modifiés ont été déclarés13,14, 15,16. Avec l’introduction de l’ANAC, nouvelles propriétés physico-chimiques peuvent être générées par rapport à la mutagenèse classique. La diversité des peptides existants peut être augmentée, pouvant conduire à nouveaux antibiotiques.
Une méthode pour l’incorporation de l’ANAC recombinants peptides est incorporation de pression sélective (SPI) fondée sur l’utilisation de souches de bactéries auxotrophes17. Ces souches ne sont pas capables de synthétiser l’analogique cAA correspondant de la ncAA. La méthode utilise la spécificité de substrat détendue fréquemment observées, une caractéristique de nombreux naturel aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs)18. En dehors de leurs substrats naturels de la cAA, ces enzymes sont souvent capables de reconnaître et d’activer la ncAA désiré et de le charger sur leurs tRNA(s) apparentés. Cela conduit à ribosomique incorporation de la ncAA dans le produit du gène cible de façon spécifique de résidus (c.-à-d., cAA → ncAA substitution). C’est bien sûr possible seulement lorsque la ncAA désirée est structurellement et chimiquement similaire à l’acide aminé canonique et toléré par la physiologie cellulaire, de la machinerie de traduction et de la séquence cible de peptides ou de protéines. Dans un montage expérimental particulier, les cellules auxotrophes hôtes sont cultivées en milieu défini fourni avec une concentration limite de l’acide aminé natif soit substitué. La croissance cellulaire ou l’échange par un milieu sans cAA entraîne une déplétion intracellulaire de la cAA. Dans l’étape suivante, la ncAA est ajouté et l’expression du gène cible est induite. Inévitablement, ANAC est maintenant également incorporées dans plusieurs autres protéines dans la cellule hôte au cours de cette phase d’expression du gène cible. Néanmoins, la toxicité de l’installation SPI est maintenue à un niveau faible, puisque la souche d' Escherichia coli (e. coli) est transformée avec un plasmide porteur du gène cible sous contrôle d’un promoteur fort (généralement très compétitif T7 promoteur / Système de RNA polymérase)19. Immédiatement après l’induction (généralement lorsque la cAA est épuisé), l’hôte les cellules cessent de se développer et leurs mécanismes enzymatiques cytoplasmiques sont utilisés principalement pour l’expression du gène cible axée sur le plasmide. Mutagenèse dirigée peut être utilisé pour définir l’ou les lieux de l’installation de ncAA de résidus spécifiques du gène de cible20.
Comme un peptide de modèle pour l’incorporation de l’ANAC, la nisine de AMP pentacyclique A a été choisie. C’est 34 acides aminés et a seulement un résidu proline unique dans la séquence peptidique de base (Figure 1). Comme dans la subtilisine, ericin A et S et utilise aussi bien comme dans la nisine Z et la nisine Q, la proline conservée semble être essentielle pour l’activité9,21. La proline cAA joue un rôle particulièrement important dans la rotation amide peptidyl-prolyl et stabilisation de la structure secondaire. Sa chaîne latérale bague conformations (exo / endo fronce) sont responsables d’une stabilisation thermodynamique de la liaison amide. Modifications chimiques ciblées (par exemple hydroxylations, fluorinations, méthylations) de prolyl fronces influencent souvent critique stabilité, rigidité de l’échafaudage et de fonctions de nombreuses structures biologiques22pliant. Ainsi, il est plausible d’attendre que les substitutions analogiques de proline Pro→ vont doter l’anneau B, le deuxième cercle de nisine, avec roman et propriétés inhabituelles.
Ici, une proline-auxotrophes souche e. coli a été utilisée pour la production de la nisine recombinant. Cela nécessite l’expression de la prepeptide gène CSRN ainsi que la modification de gènes enzyme nisBC. Le produit de peptide codé génétiquement transporte un leader en position N-terminale His-tag pour purification par chromatographie d’affinité sur. Pour la détermination de l’activité, L. lactis exprimant et sécrétant des NisPT est utilisé pour activer les variantes de la nisine recombinante de lysats de cellules d’Escherichia coli ou des échantillons de peptide purifié (Figure 1). L’AMP mature est sorti après clivage du leader NisP. Dans cette méthode de diffusion en gélose, l’échantillon de AMP diffuse dans le milieu de croissance solide et peut inhiber la croissance des microorganismes Gram positif. Après incubation, cela peut être observée visuellement par les halos de l’inhibition de la croissance. En plus de L. lactis comme indicateur, modifié la nisine variantes ont montré une activité antimicrobienne contre Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus et Lactobacillus johnsonii 21,,23.
Une méthode alternative et expérimentalement différente d’incorporer l’ANAC dans RiPPs est stop codon suppression (SCS)24. Pour ce faire, un ARNt orthogonale / paire d’aminoacyl-tRNA synthétase (RAA) est nécessaire pour la ncAA correspondante. Idéalement, tous ces trois composantes sont bioorthogonal, c'est-à-dire qu’ils n’interagissent pas avec le tRNA endogènes et les aaRSs. Un RAA ncAA spécifiques peut être généré par la modification du site actif de l’enzyme et de criblage des bibliothèques génétiques mutantes synthétases25. En outre, l’introduction d’une ncAA exige un codon qui est réassigné et qui n’encode pas le CAA. Le codon ambre est généralement utilisé24,26.
Récemment, SPI a été créé pour l’incorporation de l’ANAC contenant du α-chloroacétamide et clic-chimie-compatible NisA27. Par exemple, Nε- alloc-lysine a été incorporé dans le captistruin de peptide de lasso avec in situ (SCS) et méthodes d’incorporation de résidus spécifiques (SPI) et par la suite modifié in vitro par métathèse de ruthénium catalyse28 . En comparaison avec SPI, la méthode SCS est plus compliquée depuis un ARNt orthogonale / aaRS paire doit être exprimée conjointement. A ce jour, o-paires pour l’incorporation de la proline ont été développés29, mais au mieux de notre connaissance, aucun exemple d’incorporation analogiques de la proline n’a été signalée.
Il est à noter que pas tous ANAC peut être incorporé en utilisant la méthodologie SPI. Tout d’abord, l’absorption de l’ANAC dans le cytoplasme est régie par une multitude de protéines de transport qui sont incorporées dans la membrane cytoplasmique, qui est la membrane interne des bactéries à Gram négatif comme Escherichia coli. Normalement, les e. coli est capable de transporter une large gamme d’analogues d’acides aminés dans la cellule avec des chaînes latérales structurellement et chimiquement similaire à canonique des acides aminés. Deuxième, nombreux ANAC chimiquement réactives ou instable pourrait agir comme un inhibiteur de la croissance cellulaire, car ils sont toxiques pour le métabolisme et la physiologie de l’hôte cellule30. Ainsi, l’absorption et la toxicité de la ncAA pour l’hôte de production doivent être testés au préalable. Pour éviter l’inactivation de la machinerie PTM comme un effet secondaire, une installation d’expression strictement contrôlée des gènes responsables peut être utilisée pour intégrer les enzymes de modification (par exemple, nisBC) de l’acide aminé naturel et la ncAA dans le gène cible ( par exemple, nisA). Ceci peut être accompli à l’aide de deux promoteurs différents et l’induction de l’expression du gène cible, comme le montre spécialement conçu de protocoles SPI31. Comme indiqué ci-dessus, la méthode SPI s’appuie sur la spécificité de substrat détendue de l’aaRS, qui permet pour l’activation de la ncAA et apparentés tRNA de charge. Par la suite, l’ARNt est distribué dans le ribosome, suivie de la formation de la liaison amide et pliage du peptide cible (poly). Dans ce processus, correction d’épreuves et de mécanismes d’édition peuvent devenir pertinente32. Pour ces raisons, il est très important d’avoir une cible en ncAA structurellement et chimiquement semblable à la cAA. Autres points cruciaux sont une stabilité suffisante (tant dans les milieux de culture et exposés au métabolisme cellulaire) et la solubilité de la ncAA. En outre, il devrait être soit disponible commercialement ou facile à être synthétisé chimiquement.
Nous décrivons ici un protocole pour SPI, permettant l’incorporation de résidus spécifiques d’ANAC dans RiPPs recombinant. En particulier, analogues de différents proline sont incorporés dans la nisine peptide antimicrobien A comme organisme hôte à l’aide d’e. coli . Spectrométrie de masse est utilisée pour vérifier le remplacement de l’acide aminé et produits peptidiques sont analysées à l’aide de tests d’inhibition de la croissance et la microscopie de fluorescence à l’aide de souches microbiennes indicatrices de bioactivité.
L’exigence fondamentale d’expression nisine recombinant réussie avec une définition ANAC nécessite une proline adapté auxotrophe souche e. coli . Pour cela auxotrophie, proA doit être dysfonctionnelle, par exemple obtenus par knock-out génomique. Cellules entièrement privé de biosynthèse de Pro intracellulaire (c'est-à-dire la suppression des proABC) sans possibilité de réversion sont stables auxotrophes. Gène couramment knockout méthodes sont monogéniques opercule selon Datsenko & Wanner33ou transduction du phage. En outre, souches de proA knockout peuvent provenir de dépôts publics tels que Addgene, CGSC ou la collection de Keio. Puisque l’expression recombinante nisABC montrée ici repose sur l’utilisation de promoteurs T7, l’expression hôte possède transporter un gène inductible de l’ARN polymérase T7. Ceci peut être accompli par introduction dans le génome de l’hôte, par exemple à l’aide de la trousse commerciale du prophage λDE3. Alternativement, des souches comme BL21 (DE3) peuvent être faits auxotrophes comme décrit ci-dessus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">P029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guanidine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0035.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dipotassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P749.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3904.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P030.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-alanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-arginine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3144.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-asparagine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>HN23.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T202.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3467.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3772.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3774.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glycine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3187.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-histidine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3852.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-isoleucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3922.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-leucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-methionine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>9359.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-phenylalanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4491.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-proline</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-serine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4682.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-threonine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T206.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tryptophan</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4858.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tyrosine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-valine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4879.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3746.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">magnesium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">D-glucose</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>6780</td>
			<td style="width:167px;">prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>PN93.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iron(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>372870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">biotin</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3822.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>102792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manganese(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">zinc chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>108816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">immonium orthomolybdate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>7533.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K029.5</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 100 &#181;g/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T832.2</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 50 &#181;g/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3886.1</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 5 &#181;g/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4R)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">(4R)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">(4S)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">(4R)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P074.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ethanol</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>20825.324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;">M17-broth</td>
			<td style="width:123px;">Sigmal-Aldrich, Germany</td>
			<td>56156</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, see Terzaghi BE &#38; Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">agar-agar</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>5210.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nisin from Lactococcus lactis&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">N5764</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, can be used as reference for bioactivity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">imidazole</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3899.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL autosampler vial for LC-MS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formic acid</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">29-0486-31</td>
			<td style="width:167px;">different manufacturers and resins available for IMAC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">0.45 &#181;m bottle top filter unit</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>10040-470</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">0.45 &#181;m syringe filter PVDF membrane</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">CCY1.1</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">luer-lock syringe, PP, 50 ml</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T552.2</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">30120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">TA19</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Nile red</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">72485</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli &#916;proA strain</td>
			<td style="width:123px;">CGSC, Keio collection</td>
			<td style="width:344px;">JW0233-2</td>
			<td style="width:167px;">proline-auxotrophic E. coli K-12 strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli B834(DE3)</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td>69041</td>
			<td style="width:167px;">methionine-auxotrophic E. coli B strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#955;DE3 Lysogenization Kit</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td style="width:344px;">69734-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">bacterial indicator strain, see Khusainov R &#38; Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">5427 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peristaltic pump</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">P1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FPLC system</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">&#196;kta Purifier 10 or the like</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">inverted microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:344px;">TI Eclipse wide-field fluorescence microscope&#160; with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">electron multiplying CCD (EMCCD) camera</td>
			<td style="width:123px;">Andor Technologies, UK</td>
			<td style="width:344px;">Andor Luca&#160;</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fluorescence excitation filter</td>
			<td style="width:123px;">Thorlabs, USA</td>
			<td style="width:344px;">Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC)</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">fluorescence emission filter</td>
			<td style="width:123px;">AHF Analysentechnik, Germany</td>
			<td style="width:344px;">T 560 LPXR</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cover slip 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">LH26.1</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Immersion Oil</td>
			<td style="width:123px;">Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>Immersol 518 F</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">probe sonicator</td>
			<td style="width:123px;">Bandelin, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72</td>
			<td style="width:167px;">200 W maximum HF output</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 &#181;m particle size)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">567227-U</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ESI-TOF coupled to HPLC system</td>
			<td style="width:123px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:344px;">Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids

La nature a une variété de possibilités pour créer de nouvelles fonctions de la protéine en modifiant la séquence des éléments constitutifs des acides aminés individuels. Cependant, toutes les variantes sont basées sur les 20 acides aminés canoniques (cAAs). Comme un moyen d’introduire davantage de propriétés physico-chimiques des polypeptides, l’incorporation des acides aminés non canoniques (ANAC) est plus utilisée dans l’ingénierie des protéines. En raison de leur longueur relativement courte, la modification des peptides synthétisés ribosomally et modifiées post-traductionnellement par ANAC est particulièrement intéressante. Nouvelles fonctionnalités et poignées chimiques peuvent être générées par des modifications spécifiques des résidus individuels. La méthode d’incorporation (SPI) de pression sélective utilise des souches auxotrophes hôte qui sont privés d’un acide aminé essentiel dans les milieux de culture définis chimiquement. Plusieurs analogues d’acides aminés structurellement et chimiquement similaires puis peuvent être activées par le correspondant aminoacyl-ARNt synthétase et fournissent des résidus spécifiques cAA(s) substitutions ncAA(s) → dans la séquence cible de peptides ou de protéines. Bien que, dans le cadre de la méthode SPI, ANAC est également incorporées dans le protéome hôte pendant la phase d’expression du gène recombinant, la majorité des ressources de la cellule est assignée à l’expression du gène cible. Cette mesure efficace axée sur les résidus incorporation d’ANAC souvent accompagnées de fortes quantités de cible modifiée. Le travail présenté décrit l’incorporation in vivo des six analogues de proline dans la peptide antimicrobien nisine, un lantibiotique naturellement produite par Lactococcus lactis. Propriétés antimicrobiennes de la nisine peuvent être changées et étoffées au cours de sa fermentation et d’expression en auxotrophes Escherichia coli souches dans les milieux de culture définis. Ainsi, les effets des résidus spécifiques remplacement du cAAs avec ANAC peuvent livrer des changements dans la spécificité et l’activité antimicrobienne. Tests d’activité antimicrobienne et microscopie de fluorescence sont utilisés pour tester les nouvelles variantes de nisine pour l’inhibition de la croissance d’une souche témoin de Gram positif Lactococcus lactis . Spectroscopie de masse sert à confirmer l’incorporation de la ncAA en variantes de nisine bioactifs.

Ce protocole est conçu pour permettre la production de variantes de nisine modifiés ncAA avec incorporation de résidus spécifiques des analogues de la proline par la méthode SPI. Auparavant, la faisabilité et les rendements de 24 mg/L ont été signalés pour la production recombinante d’entièrement mis à jour le sauvage nisine39. À l’aide de la méthode SPI, rendements de peptides/protéines cibles sont souvent bons et peuvent atteindre quantités près de type sauvage production48. Comme les premières expériences, production RiPP par recombinaison génétique sauvage doit être testée chez l’hôte auxotrophe choisie. Ici, la proline-auxotrophes Escherichia coli MG1655 ΔproBA:: frt ΔproC:: frt (DE3) a servi de souche hôte. Pour l’incorporation de l’ANAC, culture et induction température et composition calendrier comme moyenne peuvent être optimisés vers le rendement maximal de peptide.
Dosage de l’activité antimicrobienne Purification et production de nisine recombinant de type sauvage ont été réalisées selon le protocole ci-dessus. Dans ce cas, la proline a été utilisé au lieu de ses dérivés en ncAA à l’étape 3.6. Un dosage de l’activité antimicrobienne a été utilisé pour vérifier la production RiPP et de comparer l’activité antimicrobienne avant et après la purification. Pour le dosage de l’activité, élution fractions et accréditives IMAC ont été utilisés directement et testés contre la souche indicatrice de Gram positif L. lactis (Figure 2). Comme cette souche exprime NisP, les variantes de la nisine contenues dans les lysats de cellules d’Escherichia coli ou des échantillons de peptide purifié, deviennent respectivement, activées par clivage protéolytique du peptide leader. Evidemment, le cheminement a montré une activité inhibiteurs de croissance. Cela peut s’expliquer par matériau bioactif ne lie pas à la colonne de l’IMAC. Les fractions d’élution testé tous ont montré une activité accrue par rapport à l’échantillon non-purifié, ce qui indique une concentration du peptide His marqués par IMAC. Notez que la mémoire tampon d’élution (comme contrôle négatif) n’a pas influencé la croissance de L. lactis dans cet essai.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> Figure 2 . Activité antimicrobienne d’essai après que purification IMAC d’inoculation produit sauvage nisine. D’élution fractions 5 à 15 et le flux par le biais de la purification de l’IMAC ont été testés en comparaison avec le lysat cellulaire non-purifié (dilué à la normalisation de600 OD) contre la souche témoin de L. lactis . La taille des halos de l’inhibition de la croissance indique une activité antimicrobienne. Chloramphénicol à une concentration de 400 µg/mL a été utilisé comme témoin positif et de la mémoire tampon d’élution IMAC comme contrôle négatif. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Pour prouver l’activité antimicrobienne d’inoculation produit nisine variantes contenant six analogues de différents proline, un dosage de l’activité a été réalisé afin de tester l’inhibition de la souche témoin de L. lactis . La figure 3 montre l’inhibition de la croissance pour cinq des six échantillons produites à l’aide d’analogues de la proline. Les meilleurs résultats (en juger des tailles de halo) ont été observées pour les expériences d’incorporation de l’analogique (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroxyproline et (4S)-methanoproline. En comparant la taille de halo de l’inhibition de croissance à la nisine sauvage produit et testé en parallèle, toutes les trois variantes de la nisine a montré force semblable de l’inhibition. Toutefois, la taille de halo seule ne peut pas être utilisé pour évaluer une activité spécifique, étant donné que la concentration de l’AMP n’a pas été déterminée. Par conséquent, les essais servent uniquement à tester qualitativement si l’activité antimicrobienne des variantes nisine qui en résulte est conservée ou perdue. Pour déterminer l’activité spécifique, la concentration des nisine variantes doit être quantifié (voir Discussion).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> Figure 3 . Analyse de l’activité antimicrobienne des lysats de cellules contenant des variantes de la nisine produite via SPI avec les analogues de la proline. Comparaison des variantes de la nisine avec échantillons recombinants de type sauvage. Tous les échantillons étaient OD600-normalisée après la lyse cellulaire par rapport à la densité de culture de cellules récoltées. Halos indiquent bioactivité sous forme d’inhibition de croissance de la souche témoin. Première rangée, de gauche à droite : (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroxyproline, (4R) - methanoproline et le chloramphénicol (400 µg/mL ; antimicrobiens contrôle positif). Deuxième rangée : (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroxyproline, (4S) - methanoproline et la proline (contrôle de type sauvage). Remarque la nomenclature chimique ; par exemple, (4R) - fluoroproline est également dénommé trans-4 - fluoroproline. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
LC-ESI-TOF spectrométrie de masse À la suite de purification de l’IMAC, l’incorporation de l’ANAC nisine a été analysée par spectrométrie de masse LC-ESI-TOF. La figure 4 montre les spectres de masse déconvoluées d’une variante de la nisine contenant (4R)-fluoroproline. Cette variante a été IMAC purifiée comme décrit ci-dessus et par la suite analysé par spectrométrie de masse LC-ESI-TOF, ainsi il a toujours porté le leader. Le pic principal dans la Figure 4A correspond à la nisine mis à jour le contenant (4R)-fluoroproline d’une masse déconvoluée de 6883.18 Da (masse calculée 6882.05 Da, calcule masse du peptide correspondant sauvage avec proline à la position 9 est Da 6864.06). Les deux sommets avec plus faible abondance et de la masse plus élevée correspondent à des adduits de sodium comme indiqué. Figure 4 B regroupe des espèces chargées différemment des principaux composés que l'on trouve par l’algorithme de déconvolution. Par exemple, le pic à m/z 1148.11 correspond à l’espèce chargée sextuplé ([M + 6H]6 +).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> Figure 4 . LC-ESI-TOF spectrométrie de masse des variantes de la nisine recombinant purifié IMAC contenant (4R)-fluoroproline. (A) déconvolutée chromatogramme de la spectrométrie de masse (zoomé arrière dans le médaillon) pour la variante de la nisine (portant encore le leader) avec (4R)-fluoroproline (attendue des masses (Da) : [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) composé des spectres pour les espèces [M + H]+. Attendus des masses (Da) : [5 M + H]+ 5 = 1377.41, [6 M + H]6 + = 1148.01, [7 M + H]+ 7 = 984.15, [8 M + H]+ 8 = 861.26, [9 M + H]+ 9 = 765.67, [10 M + H]+ 10 = 689.21, [11 M + H]+ 11 = 626.64, [12 M + H] 12 + = 574.50. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Microscopie en fluorescence Activité antimicrobienne de nisine recombinante et ses variantes contenant du ncAA peut également montrer par l’observation directe de la L. lactis indicateur souche par microscopie à fluorescence. Nil rouge, un colorant fluorescent fortement hydrophobe, a été utilisé pour colorer la membrane de la cellule bactérienne. La figure 5 illustre le changement qualitatif de l’état d’agrégation de la culture cellulaire et la morphologie de la cellule unique. Les cellules ont été colorées au rouge Nil et déposés sur une lame de microscope couverture. La rangée supérieure montre les cellules directement au début quand le buffer, nisine recombinante de type sauvage, ou contenant de la nisine (4R)-fluoroproline, ou 4R-hydroxyproline ont été ajoutés. Le panneau inférieur montre les images correspondantes au bout de 20 minutes d’incubation.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> Figure 5 . Microscopie de fluorescence de nisine recombinant effets sur les cellules grampositives. Des images microscopiques de souche d’indicatrice 30 µL L. lactis (OD600 = 1) marqué avec Nil rouge ont été prises avant (du haut) et après (panneau inférieur) 20 min d’incubation avec 1 µL de tampon (A), 0,3 µL recombinant sauvage nisine (B) et Variantes de la nisine µL 0,6 contenant (4R)-fluoroproline (C) et (4R)-hydroxyproline (D). Cercles bleus marquent les régions avec point de flèches de cellules agrégées ou déformées, bleu aux régions où la diffusion des fragments membranaires fluorescents peut être observée. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Figure 5 A montre que l’aspect général des cellules n’a pas changé en 20 minutes d’observation. Que le nombre de cellules qui déposés durant la rose du temps et, par conséquent, une plus grande quantité de cellules sont visibles dans le 80 µm x 80 µm de la région observée. Figure 5 B montre que les cellules Gram positifs apparaissent agrégées et floue (marqués par des cercles bleus) après 20 minutes d’exposition à la nisine sauvage, même en faibles quantités (ici, élution de IMAC 0,3 µL) ont été ajoutées. En outre, matériau léger diffus des cellules dans le tampon, ce qui indique que des fragments de membrane marqués avec Nil rouges ont été mobilisés au cours de la période (indiquée par les flèches bleues). Ces résultats indiquent la lyse cellulaire, comme il a été montré à survenir après traitement avec la nisine6,49. Des effets similaires ont été observés après l’incubation avec la nisine variant contenant (4R) - fluoroproline (Figure 5C) et la nisine contenant(4R)- hydroxyproline (Figure 5D) les deux grandes montrant nombres de cellules déformées et agrégées après 20 minutes, en contraste avec l’échantillon de contrôle (Figure 5A).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Composant</td>
			<td>Concentration de</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4) 2 OUI4 </td>
			<td>7,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>8. 5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tous les acides aminés canoniques (à l’exception de celui à remplacer)</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo-éléments (Cu2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)</td>
			<td>0,01 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thiamine</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotine</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Composition du milieu de croissance bactérienne chimiquement défini NMM19 après préparation selon l’étape 2.

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Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

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