Name: antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids at JoVE.com

J.H.N., T.B. och M.B. godkänner finansieringen av programmet EU FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. och T.F. godkänner finansieringen av det federala ministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF Program ”HSP 2020”, TU-WIMIplus projekt SynTUBio) och den tyska forskningsfondens (Cluster of Excellence ”Unifying begrepp i katalys”).

1. kloning av uttrycket vektorer och omvandling av en auxotrophic produktion stam
Häri, har gener för nisin biosyntes, nämligen nisABC, tagits från L. lactis och överförts till T7-baserade plasmid uttryck vektorer. Fullständiga DNA-sekvenser av nisABC kan hittas i GenBank inträde X6830734. Genen för föregångare peptiden (nisA) har placerats på en pET-3a vektor som ger ampicillin-resistens. Gener för dehydratase (nisB) och guanylatcyklas (nisC) har placerats på vektor pRSFDuet-1, som rapporterade tidigare35, som ger kanamycin resistens.
Obs: För nisA, var codons av de sista fyra aminosyrorna (ASPR) av sekvensen ledare muterat för att koda VSLR36 att återge proline återstoden i core peptiden unika och säkerställa korrekt prepeptide bearbetning av NisP. Vid N-terminalen lades en hexa-histidin tagg flankerad av linker rester av rening (se figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig1.jpg"> Figur 1 . Schematisk framställning av biosyntes och PTM av NisA i E. coli samt ledare klyvning av L. lactis indikator stammen i en efterföljande aktivitet assay. I det första steget, den inaktiva linjär prenisin (bestående av en ledare och en core peptid region som innehåller en unik prolin (rosa) på position 9) kodas av nisA syntetiseras ribosomally. Nästa, prenisin posttranslationally modifieras genom dehydratisering av serine och treonin rester till dehydroalanine (Dha) och dehydrobutyrine (Dhb) som katalyseras av NisB. Cyclase NisC bildar den thioether broar via Michael tillägg av cystein sulfhydryl grupper med Dha eller Dhb. Den inaktiva modifierade prenisin renas från E. coli och testade för antimikrobiell aktivitet. Här, transporteras det in i cellen av grampositiva L. lactis indikator stammen. Ledare är klyvs av proteashämmare NisP (vilket anges av en pilspets) för att släppa fullt aktiv nisin. Det kan också vara borttagna i vitro genom behandling med trypsin (*). <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<ol><li>Använd standard heat-shock protokoll37 eller elektroporation38 för att omvandla prolin auxotrophic E. coli -stam (se ovan) med plasmider pET-3a nisA(VSLR) och pRSFDuet-1 nisBC.</li>
	<li>Pipettera 25-100 µL av omvandlade cellsuspension på agarplattor som innehåller ampicillin, kanamycin och 1% (w/v) glukos. Använd en tallrik spridare eller glaspärlor för att sprida lösningen jämnt på plattorna.</li>
	<li>Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.</li>
	<li>Följande eftermiddagen, använda en enda koloni för att Inokulera 10 mL LB medium innehållande ampicillin, kanamycin och 1% (w/v) glukos i en 50 mL mätkolv.</li>
	<li>Skaka kultur över natten (12-16 h) vid 37 ° C och 200 rpm.</li>
	<li>Ta 250 µL sterilt 80% glycerol och 550 µL kultur, blanda väl i en 2 mL tub och lagra som frysta cell lager vid 80 ° C.</li>
</ol>2. nya minimalmedium (NMM) förberedelse
Obs: Detta protokoll använder NMM20 som kemiskt definierade flytande bakterietillväxt medium. Också, det rekommenderas att följa ordningen för beredning strängt. Annars kan nederbörd inträffa. Aminosyra former skiljer sig från de som anges i tabellen material (t.ex. hydrochlorides), kontrollera löslighet. NMM19 innehåller 19 aminosyror utom Luftfartsverket bytas (här, prolin) av ncAA analog. Se tabell 1 för slutliga ingrediens koncentrationer. Beroende på den bakteriestam som används för produktion, kan biotin och tiamin vara frivillig.
<ol><li>Beredning av aminosyra blandningen<ol>
<li>Lös 0,5 g Phe, Trp och Tyr i 100 mL ddH2O med tillägg av några droppar koncentrerad HCl tills upplösning.</li>
		<li>Väg upp 0,5 g var och en av de återstående 16 aminosyrorna. Blanda med 22 mL 1 M KH2PO4 och 48 mL 1 M K2HPO4. Lägga till ddH2O ~ 800 mL. Rör tills lösningen blir klar.</li>
		<li>Tillsätt upplöst Phe, Trp och Tyr och justera volymen av lösningen till 1 L med ddH2O.</li>
		<li>Sterilisera aminosyra blandningen av dammsugarfilter med en flaska topp filterenhet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stamlösningar för NMM19<ol>
<li>Först förbereda 1 M stamlösningar av följande komponenter: (NH4)2så4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 och en 5 M stamlösning av NaCl. Sterilisera i autoklav.</li>
		<li>Förbereda 50 mL bestånden av D-glukos (1 M), CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), tiamin (10 g/L), biotin (10 g/L) och spårelement (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4, 1 mg/L ). Sterilisera varje genom filtrering med spruta filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NMM19 beredning<ol>
<li>Blanda alla lager lösningar för att få en slutlig koncentration av 7.5 mM (NH4)2SO4, 1,7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 och 20 mM D-glukos, 50 mg/L aminosyra blanda, 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L tiamin, 10 mg/L biotin och 0.01 µg/mL spårämnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. uttryck för rekombinant Nisin med inkorporeringen av prolin analoger av SPI
I detta avsnitt, rekombinant uttryck för prepeptide (här: nisA) och PTM gener (här: nisBC) utförs. Det första odlas celler i närvaro av alla cAAs, eftersom LB komplexa medium används. Glukos tillförs förtränga det mål genuttrycket på bakgrundsnivån, vilket annars kan leda till produktion av vildtyp peptid (här: nisin) på grund av leakiness av initiativtagarna. Endast efter målet cAA (här: prolin) är utarmat, ncAA läggs och målet genuttryck induceras i kemiskt definierade medium. Inkubering av flytande kulturer bör utföras i lämplig kolvar med luftning (t.ex. 500 mL i en 2 L Erlenmeyerkolv på 200 rpm).
<ol><li>Med hjälp av en steril pipettspetsen, starta en färsk övernattning kultur från frysta cell lager eller färsk koloni (se steg 1). Använda 25 mL LB medium innehållande ampicillin, kanamycin och 1% (w/v) glukos och inkubera över natten (12-16 h) vid 37 ° C och 200 rpm.</li>
	<li>Inokulera 1 L av sterila färskt medium med 10 mL övernattning kultur (1% v/v) och inkubera vid 37 ° C och 200 rpm till OD600 = 0,5.</li>
	<li>Centrifugera vid 4 ° C under 15 minuter vid 4 500 x g.</li>
	<li>Häll av supernatanten och återsuspendera pelleten med 20 mL NMM19 (bereddes i steg 2,3) innehållande antibiotika och 1% (w/v) glukos. Centrifugera vid 4 ° C under 10 minuter vid 4 500 x g.</li>
	<li>Återsuspendera cellpelleten i 500 mL av samma medium och inkubera vid 30 ° C och 200 rpm för 1 h. Observera: I detta steg, cAA utarmning (här, prolin) sker.</li>
	<li>Dela in kulturen i lika delar (en för varje ncAA). Inducera varje kultur med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) och leverera 1 mM proline analoger (4S/R- fluoroproline, 4S/R- hydroxiprolin eller 4S/R- methanoproline). Obs: Som kontroll, en kultur kan levereras med 1 mM proline, vilket resulterar i vildtyp peptid produktion.</li>
	<li>Inkubera över natten (12-16 h) vid 28 ° C och 200 rpm.</li>
	<li>Centrifugera cellen kulturer i 50 mL rör vid 4 ° C i 20 min på 5 000 x g. Häll av supernatanten och lagra pellets vid-80 ° C tills rening.</li>
</ol>4. isolering och rening av hans-taggade Nisin analoger
Peptider renas under denatureringen villkor med guanidin hydroklorid (GuHCl)39, en stark denatureringsmedel.
Varning: GuHCl är skadligt vid förtäring eller inandning och orsakar hud och allvarlig ögonirritation. Använd skyddsglasögon och skyddshandskar.
<ol><li>Bereda 250 mL bindande buffert (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4), tvättbuffert (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM Imidazol, pH 7,4) och eluering buffert (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM Imidazol, pH 7,4). För dessa, överför fasta ämnen till en 250 mL-flaska och fylla upp till 200 mL med ddH2O. Mix väl och justera pH till 7,4 med 1 M NaOH eller HCl. Fyll sedan upp till 250 mL med ddH2O. Filter alla buffertlösningar med hjälp av en flaska topp filterenhet.</li>
	<li>Cellys Här används en någon sonikator (med 200 W maximal högfrekventa (HF) uteffekt); Observera att power inställningar behövs för cell störningar kan variera för andra instrument. Alla åtgärder utförs på is. Alternativt, kemiska cellys, en flytande Homogenisatorer eller en fransk press kan användas.<ol>
<li>Lägga till 12 mL bindande buffert i varje centrifugrör (från steg 3.8) och resuspendera av vortexa.</li>
		<li>Doppa spetsen av någon sonikator sonden in cellsuspension. Ange någon sonikator på 40% amplitud med puls 1 s på / 5 s off för 15 min. Obs: Ren någon sonikator spetsen mellan prover att undvika överföring. Torka den någon sonikator sonden med 70% etanol.</li>
		<li>Centrifugera lyserat cellsuspension vid 4 ° C i 40 min vid 15 000 x g till pellet cellfragment. Överföra supernatanterna till en ny reaktionsröret.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Affinitetskromatografi För immobiliserade metall Jon affinitet kromatografi (IMAC)40, kan en Peristaltisk pump eller FPLC system användas med en 1 mL patron (här fylld med Ni-NTA harts). För beredning av buffertar, se steg 4.1. Obs: IMAC rening är genomförbart eftersom den producerade rekombinanta peptiden bär en N-terminalt hans-taggade ledare, som tas bort i steg 6 av leader-hämmare NisP, släppa mogen nisin. Utföra rening i rumstemperatur eller vid 4 ° C. Använda en flödeshastighet av 1 mL per minut om tillämpligt för IMAC patronen.<ol>
<li>Först tvätta patronen med 5 kolumn volymer (cv) av ddH2O ta bort lagring buffert.</li>
		<li>Jämvikta med 10 cv bindande buffert.</li>
		<li>Processen cell lysate (steg 4,2) använda en spruta filtrera för att ta bort partiklar, applicera sedan i patronen.</li>
		<li>Tvätta med 15 cv av tvättlösning för att ta bort ospecifik och obundna material.</li>
		<li>Eluera med 10 cv eluering buffert och samla 1 mL fraktioner i 1,5 mL rör. Lagra fraktionerna vid 4 ° C på kort sikt (upp till 3 dagar) eller vid-20 ° C för längre löptider.</li>
		<li>Förvaring, Tvätta patronen med 10 cv ddH2O följt av 5 cv 20% etanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. LC-ESI-TOF massa spektrometriska analys av Nisin analoger
Obs: Se material tabell exempelvis instrumentering för vätskekromatografi tillsammans med elektrospray jonisering time-of-flight masspektrometri (LC-ESI-TOF-MS).
<ol><li>Utför HPLC separation av 15-20 µL peptid lösning (beredd enligt steg 4,3) på en C5 kolumn med en mobil fas av vatten (A) och acetonitril (B) båda kompletteras med 0,1% myrsyra och en gradient från 5-80% B över 20 min. För masspektrometri (MS), använda eluering efter 5 min. Obs: Beroende på peptid innehåll och affinitet till i HPLC-kolonnen, provvolymer och separation kan behöva optimering.</li>
	<li>Använd lämplig programvara för att deconvolute de uppmätta masspektra och beräkna olika peptid avgiften anges41. Jämföra observerade peptid arter massan till beräknade vildtyp massan förändras av cAA → ncAA substitution. Beakta att den linjära prepeptide posttranslationally modifierats av åtta uttorkningar (-8 H2O) och fem cyclizations (se figur 1). Obs: Natrium-innehållande buffertar, MS analys i positivt läge kan visa natrium addukter. Dessa blir synlig som ytterligare toppar med högre deconvoluted massa (för varje natrium addukt, observerade deconvoluted massan är 22.99 Da högre). För att ta bort dessa addukter, HPLC rening42 eller omfattande dialys43 kan utföras.</li>
</ol>6. Antimikrobiella aktivitet Test
<ol><li>Beredning av GM17-agar plattor under sterila förhållanden<ol>
<li>Förbereda en övernattning kultur av indikator stam L. lactis NZ9000 transporterar plasmid pNG nisPT44 vid 30 ° C i M17 buljong45 med 1% (w/v) glukos (= GM17) och 5 µg/mL kloramfenikol.</li>
		<li>Mäta OD600, Inokulera färskt medium till OD600 = 0,1 och inkubera tills OD600 = 0,4-0,6. Sedan placera kolven på is. Obs: Varje OD600 mätning kommer att konsumera kultur volym. Tänk på att för varje analys agarplatta, 1 mL bakterieodling kommer att behövas. Om så krävs, skala upp flytande kultur volymen med detta.</li>
		<li>För 1,5% agar, väga ut 4,5 g agar i en glasflaska för media. Lägg till 300 mL ddH2O, mix och autoklav.</li>
		<li>Förbered 2 x M17 buljong (dubbelt koncentrerad) i 300 mL ddH2O och autoklav.</li>
		<li>Blanda 25 mL 2 x M17 buljong som innehåller 10 µg/mL kloramfenikol och 2% glukos med 1 mL L. lactis preculture (4% v/v).</li>
		<li>Tillsätt 25 mL smält 1,5% agar (nymalen autoklaveras eller uppvärmd i en mikrovågsugn). Obs: Före detta, låt flaskan svalna vid beröring (cirka 50 ° C). Detta är nödvändigt eftersom L. lactis är en innehåll organism känsliga för höga temperaturer.</li>
		<li>Häll lösningen i en stor petriskål. Torra plattor för 10-15 min.</li>
		<li>Sterilisera ändarna av ett glas Pasteur-pipett i lågan. Vänta tills den svalnat och sedan använda den breda änden för att skapa hål i den stelnade GM17-agar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Provberedning<ol>
<li>Ta 1 mL av E. coli uttryck kulturerna (skapade i steg 3,7) i en märkt 1,5 mL rör och Centrifugera under 3 minuter vid 7000 x g. Aspirera återstående medlet och återsuspendera cellpelleten i 500 µL Na-P (50 mM natriumfosfat buffert pH 7,4 tillverkad av 0,5 M natriumdivätefosfat och 0,5 M dinatriumvätefosfat).</li>
		<li>Sonikera proverna på is (jämför steg 4.2.2). Doppa spetsen av någon sonikator sonden in cellsuspension. Ange någon sonikator på 30% amplitud med puls 1 s på och 5 s off för 3 min.</li>
		<li>Centrifugera cellen lysate för 10 min vid 13 000 x g till pellet cellfragment. Överför supernatanten till en ny reaktionsröret på is.</li>
		<li>Späd och normalisera cell extrakt supernatanterna till 1 mL OD600 = 0,6, i förhållande till skördade cell densiteten, med Na-P.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aktivitetstestet<ol>
<li>Tillsätt 40 µL av varje normaliserade prov i ett hål av indikator agarplattan (figur 3). Använd kloramfenikol på 400 µg/mL som antibakteriella kontroll förening. Använda eluering buffert som en negativ kontroll. Vänta tills alla prover sprids till ägarn. Inkubera plattan över natten vid 30 ° C.</li>
		<li>Ta bilder av de agarplattor använder en flatbäddsskanner eller digital kamera. Tillväxt hämning halo storlekar kan vara uppmätta för hand eller med ImageJ46.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. fluorescensmikroskopi
För att observera effekten av ampere på bakterieceller, kan ljus och fluorescence mikroskopi användas. Observera att nisin verkningsmekanismen är beroende av en destabilisering och bildandet av porer i bakteriell membran6. Här används Nile rött färga bakteriell cellmembranet, som blir utspridda och aggregerade vid cellys.
Obs: Se material tabell exempelvis instrumentering. Mängder av extra AMP lösning kan justeras beroende på peptid koncentration och bioaktivitet.
<ol><li>Cell förberedelse<ol>
<li>Förbereda 10 mM Nile röd stamlösning i dimetyl sulfoxid (DMSO).</li>
		<li>Växa L. lactis indikator stam till OD600 = 1.0 som i steg 6.1.1-6.1.2.</li>
		<li>Centrifugera 1 mL kultur under 3 minuter vid 4 ° C och 5 000 x g.</li>
		<li>Kassera supernatanten, Återsuspendera i 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS)47.</li>
		<li>Centrifugera och resuspendera igen.</li>
		<li>Lägg 1 µL Nile röd stamlösning, blanda försiktigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskopisk bild förvärv<ol>
<li>Tillsätt 30 µL av cell förberedelse på en cover bild medan spännande på 520 nm.</li>
		<li>Ställ in förvärv tid 0,2 s, kinetic-serien 0,1 Hz, serie längd 200 bilder.</li>
		<li>Lägga till 0,3 - 1,5 µL cell lysate eller IMAC prov (från steg 6.2.4 eller 4.3.5, respektive). För IMAC prover, kan eluering bufferten användas som en negativ kontroll.</li>
		<li>Övervaka och registrera fluorescens utsläpp vid λ ≥ 560 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analys av data<ol>
<li>Mikroskopi bildsekvenser lagras som filmfiler (.avi). Enstaka bilder analyseras med ImageJ46.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Genom att använda SPI för införande av prolin analoger, kan riktade nisin strukturer väsentligen ändras, skapa nya peptid varianter med unik teckensekvens kombinationer och kemiska egenskaper. På detta sätt kan grundläggande gränsen av klassiskt gentekniken kringgås, som begränsas till de side chain kemiska sammansättningar av de 20 cAAs. In vivo kemiska diversifiering av nisin som exemplifieras ovan visar en allmän riktlinje att komplettera naturliga PTMs och dramatiskt förbättra det kemiska utrymmet av RiPPs. Vi tror att utöka repertoaren av de naturliga aminosyrorna innehar stort löfte särskilt för ampere. I proteiner, kan ett enormt utbud av funktioner realiseras genom en definierad arrangemang av de 20 cAAs i tredimensionella strukturer. Med bara 7-100 aa i längd3, skulle sätt att uppnå sådana strukturella funktioner endast genom cAAs begränsas för ampere. Det är således inte förvånande att naturliga förstärkare i form av RiPPs är vanligen i stor utsträckning post-translationally modifierade4. På samma sätt håller ncAAs som alternativa byggstenar stort löfte att förbättra deras farmakodynamiska och farmakokinetiska parametrar (se Baumann et al. 201735 och referenser däri).
Den SPI-metod som använts i detta arbete fördelarna från en relativt lätt experiment, okomplicerad utförande och hög reproducerbarhet. På grund av globala substitution är multisite ncAA införlivande i målet peptider också möjligt. Däremot, kan metoden inte vara tillräcklig för byte av aminosyror som ofta uppstår i mål genen produkten. I princip, oönskad positioner kan ändras av webbplats riktad mutagenes, men dessa ytterligare ändringar kan också påverka flera AMP egenskaper inklusive struktur och bioaktivitet. När en auxotrophic stam för produktion är tillgänglig, kan flera ncAAs testas utan att kräva omfattande förändringar på genetisk nivå. Metoden är inte heller begränsad till auxotrophic E. coli stammar, men kan även utföras med naturliga produktion värden. Zhou et al. visade till exempel att SPI för produktion av romanen RiPPs fungerar även den naturligt Trp-auxotroph L. lactis: med hjälp av fastställda media, tre tryptofan analoger införlivades på fyra positioner i nisin50.
Eftersom metoden SPI leder till globala ersättare valda cAA av ncAA, det gäller generellt för ett brett spektrum av mål peptider och proteiner. Ett utbud av auxotrophic E. coli stammar är tillgängliga (se steg 1), vilket gör att flera cAAs varje testas för byte av ncAAs. Träffade analoger införlivas med metA-bristfällig stammar (t.ex. B834(DE3)) är oftast anställda. Exempel på isostructural Met analoger är azidohomoalanine (Aha) och homopropargylglycine (Hpg), kommersiellt tillgängliga ncAAs som effektivt kan införlivas. Både införa bioorthogonal handtag som tillåter fastsättning av molekyler som bär kompatibel alkynen eller natriumazid funktionalitet, respektive. Till exempel fluorescerande färgämnen eller polyetylenglykol (PEG) delarna kan fästas av koppar (I)-katalyseras natriumazid alkynen cykloadditionen (CuAAC)51.
Även om båda rekombinant ncAA inkorporering metoder (SPI och SCS) brukar uppnå tillräckliga mål mängder, avkastningen är ofta reduceras i förhållande till vildtyp produktionen av motsvarande peptider och proteiner. Som föroreningar ofta korrelerar med produktionseffektivitet, kan ytterligare reningssteg krävas, särskilt för låg-rikliga arter. I detta fall av rekombinant nisin produktion förenklar hans-taggade ledare sekvensen RiPP rening av selektiv anrikning från den cell lysates. Den rening som visas i detta protokoll förbättrar renhet och koncentration av nisin, men ofta ger inte AMP med tillräcklig för att fastställa avkastningen och specifik aktivitet. Vanligen används AMP reningsmetoder ingår förutom IMAC, HPLC, jonbyteskromatografi (IEC) och nederbörd (e.g.. med aceton eller triklorättiksyra (TCA)) eller kombinationer av dessa - vilket resulterar i ett utgångsämnet rening system52 . Det bör noteras att deras vanligen polycationic natur kan underlätta IEC rening. Frystorkning är ofta används för att lagra renat ampere.
Helst ncAAs för iblandning i ampere ska vara kommersiellt tillgänglig till överkomliga priser eller produceras enkelt av enkla och reproducerbara kemisk syntes protokoll. En lika viktig förutsättning för SPI-metoden är att ncAA är erkända, aktiveras och debiteras på den cognate tRNAen av de årliga verksamhetsrapporterna endogen eller samtidig uttryckt. Detta kan vara testade i vitro av aminosyra som aktivering eller tRNA aminoacylation assay53. Som ett lätt alternativ, SPI test uttryck av modell proteiner såsom grönt fluorescerande protein (GFP) bedrivs både i närvaro och i frånvaro av ncAA tillskott kan utföras. Dessutom löslighet i den tillväxt medium och cell permeabilitet samt kemisk stabilitet utgör viktiga faktorer.
I det här exemplet visades antimikrobiell aktivitet använder en grampositiva indikator stam. Som det uttrycker den leader-hämmare NisP, catalyzeds det sista steget av nisin mognad. Borttagning av sekvensen ledare (hans-märkta för rening ändamål) kan också vara utförda i vitro genom behandling med renat NisP50 eller trypsin54. Utanför ramen för detta arbete, patogena organismer och multiläkemedels resistenta stammar kan sedan testas för bakteriostatiska eller bakteriedödande hämning av AMPs använder en liknande metod. Kliniskt relevanta målarter inkluderar MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa och Klebsiella pneumoniae. Förutom agar plattan diffusion assay presenteras här, tillväxt hämning kan också utföras med lämpliga flytande media inokuleras med bakteriearter och kompletteras med AMP. Med buljong utspädning metoder, kan den minsta hämmande koncentrationen (MIC) bestämmas med pure peptider55. Aktivitet analysen presenteras här kan också användas för att uppskatta bioaktivitet och styrkan av AMP-innehållande lösningar i förhållande till referens föreningar, till exempel kommersiellt tillgängliga nisin.
Rekombinant produktionen av RiPPs är ofta genomförbart39, som vanligen omfattar samtidig uttryck av PTM gener. Så snart produktionen stammen övergår i ett kemiskt definierade eller syntetiska minimal medium innehållande ett passande ncAA, sker rester-specifika byte av motsvarande Luftfartsverket. Således kan andra RiPPs produceras av samma metod, förutsatt att deras rekombinanta produktion är genomförbart och villkor kan hittas där ncAA införlivandet och PTM ge tillräckliga mängder målet produkt. Observera att förutom det mottagande cellen proteomet, peptid PTM maskiner kan också bli ncAA-modifierade under SPI. Tidpunkten för målet uttryck induktion och längden på följande inkubationstiden kan följaktligen kräver optimering. Eftersom ncAA införlivande PTM enzymer kan påverka deras stabilitet och verksamhet, kan produktion av den bearbetade RiPP i princip påverkas. Tillräcklig PTM enzym effekt indikeras av bildandet av bearbetade prepeptide, som upptäckts av MS och bioaktivitet analyser. Som infördes ovan, olika inducerbara initiativtagare kan användas för att producera PTM gener först (i frånvaro av ncAA) följt av induktion av föregångare peptid genen i närvaro av ncAA. I allmänhet måste produktionen av cAA-innehållande mål peptid undertryckas före tillsats av ncAA, varför snäva förtryck av föregångare genen är nödvändiga. Inom detta protokoll uppnås detta genom katabola förtryck genom tillsats av glukos till odlingsmedium. Särskilt eftersom de PTM enzymer som krävs för prepeptide bearbetning härstammar oftast från en genetiskt avlägsen värd, kan uttryck temperatur och kodon användning av motsvarande gener kräva optimering om rekombinant produktion har ännu inte etablerade. I princip, kan förekomsten av ncAAs i prepeptide störa erkännande och bearbetning av PTM enzymer, när det gäller nisin NisBC och NisP. För ncAA iblandning i ampere rekommenderas det således att utföra småskaliga uttryck experiment först för att identifiera lämpliga uttryck villkor och tillförlitlighet av AMP verksamhet analysen.

Upptäckten av antibiotika i det tjugonde århundradet och den parallella utvecklingen av nya antimikrobiella föreningar mot patogena mikroorganismer aktiverat riktade behandlingar av bakteriella infektioner. Dock på grund av uppkomsten av multiresistenta patogener såsom meticillinresistenta Staphylococcusaureus (MRSA), vankomycinresistenta enterokocker (VRE), MDR (multiresistenta) Salmonella typhimurium phage Skriv 10 (DT10 ), och Klebsiella pneumoniae, det är absolut nödvändigt att generera nya antimikrobiella medel1. Antimikrobiella peptider (ampere) är mångsidig, ofta mycket specifika substanser som är lovande kandidater för utveckling av nya läkemedel tack vare sina fysikalisk-kemiska egenskaper, flexibilitet, storlek, vattenavvisande egenskaper och läge för åtgärd2. Ampere är små peptider vanligtvis bestående av 7-100 aminosyror. Ofta har de en katjoniska struktur som är rik på positivt laddade arginin och lysin rester, som interagerar med riktade mikrobiell cellmembranet, som debiteras oppositely3. En särskild undergrupp av ampere är ribosomally syntetiserade och posttranslationally modifierade peptider (RiPPs)4. Dessa tillverkas av många olika organismer från riket svampar och domänen för bakterier. En av de mest kända och mest använda RiPPs är nisin, produceras naturligt av mjölksyra bakterien Lactococcus lactis (L. lactis). Aktiv mot en panel av grampositiva bakterier, nisin har använts som en biopreservative inom livsmedelsindustrin för mer än 50 år på grund av dess antimikrobiella egenskaper och avsaknad av utvecklade resistens i riktade mikrobiell stammar5. Studier har visat att nisin destabiliserar och genererar porer i bakteriell cellmembran, leder till antimikrobiell aktivitet mot både grampositiva och gramnegativa patogener6. Genom bindning till lipid II är bakteriella cellväggen syntesen hämmad7. Nisin är kodad av nisA som en linjär föregångare peptid, som består av en ledare och en core peptid region (figur 1). Efter ribosomal proteinsyntes ändras först prenisin genom dehydratase NisB. Här, är serin och treonin rester i regionen prepeptide kärna uttorkade till dehydroalanine (Dha) och dehydrobutyrine (Dhb)8. Därefter torkade rester är tillsammans med cystein till formuläret lantionin ringar (därav namnet ”lantibiotic” för lantionin ring-innehållande antibiotika) av en enzymkatalyserade Michael tillägg. Denna posttranslationell modifiering (PTM) är katalyseras av cyclase NisC. I L. lactis, den modifierade prenisin sedan transporteras ut ur cellen av transportören NisT och ledare peptiden är klyvs av proteinas NisP att släppa den mogna och aktiva nisin form9. De ansvariga ledare-hämmare NisP har en hög substrat specificitet, eftersom det endast processer modifierade nisin effektivt10.
I allmänhet resulterar aktiva RiPPs från handlingen av PTM enzymer (exempelvis NisBC), vilket drastiskt öka kemiska loppet av kort peptider, t.ex. via acetylering, glycosylation, metylering eller fosforylering. Denna nivå av komplexitet kan ytterligare utökas genom direkta införlivandet av ncAAs. Medan ofta genomförbart, är kemisk syntes ampere en utmaning för storskalig produktion på grund av deras strukturella komplexitet. Till exempel uppnåddes totala kemiska syntesen av den lantibiotic lactosin S i 71 reaktionen kliver med en slutlig avkastning på 10% och det av nisin med en rå kapacitet på endast 0,003%11,12. Därför, biologisk produktion erbjuder ett lönsamt alternativ, på grund av generationen av rätt stereocenters och hög koncentration.
Fram till idag, mer än 150 ncAAs, exempelvis att ha funktionella grupper som innehåller fluor eller azider, har införlivats i rekombinanta proteiner, och flera exempel på ncAA-modifierade ampere har varit rapporterade13,14, 15,16. Med införandet av ncAAs, kan det skapas nya fysikalisk-kemiska egenskaper jämfört med konventionella mutagenes. Mångfalden av befintliga peptider kan ökas, möjligen kan leda till nya antibiotika.
En metod för införlivandet av ncAAs i rekombinanta peptider är selektionstryck inkorporering (SPI) baserat på användning av auxotrophic bakteriestammar17. Dessa stammar är inte kan syntetisera motsvarande cAA analog av ncAA. Metoden används frekvent observerade avslappnad substrat specificitet, en funktion i många naturliga aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Bortsett från deras naturliga cAA-substrat klarar dessa enzymer ofta att erkänna och aktivera önskad ncAA och ladda det på deras besläktat tRNA(s). Detta leder till ribosomal införlivandet av ncAA i mål genen produkten på ett sätt som rester-specifika (dvs. Luftfartsverket → ncAA substitution). Detta är naturligtvis bara möjligt när önskad ncAA är strukturellt och kemiskt liknar den kanoniska aminosyran och tolereras av cellfysiologi, översättning maskiner och målet peptid eller protein sekvensen. I en viss experimentell setup odlas de auxotrophic värdcellerna i definierade medium medföljer en begränsande koncentration av infödda aminosyran ska ersättas. Den cellulära tillväxt eller utbyte av cAA-fri medium leder till intracellulär utarmning av Luftfartsverket. I nästa steg, ncAA läggs och målet genuttrycket induceras. Oundvikligen, ncAAs nu också ingår i många andra proteiner i värdcellen under denna fas av målet genuttryck. Dock toxiciteten av SPI setup hålls på en låg nivå eftersom Escherichia coli (E. coli) stammen förvandlas med en plasmid som transporterar målgenen under kontroll av en stark tillskyndare (vanligen mycket konkurrenskraftiga T7 promotorn / RNA-polymeras system)19. Omedelbart efter induktion (vanligtvis när Luftfartsverket är slut), värd celler upphöra att växa och deras cytoplasmiska enzymatisk maskinerier används främst för uttryck av plasmid-baserade målgenen. Webbplats riktad mutagenes kan användas för att definiera industriområden av rester-specifika ncAA installation i målet gen20.
Som en modell peptid för införlivandet av ncAAs valdes den gemensamma AMP nisin A. Det är 34 aminosyror lång och har bara en enda proline rester i sekvensen core peptid (figur 1). Liksom i subtilisin, ericin A och S, och epidermin såväl som i nisin Z och nisin Q verkar den bevarade prolin vara avgörande för aktivitet9,21. Den cAA prolin spelar en särskilt viktig roll i peptidyl-prolyl amide rotation och sekundärt strukturera stabilisering. Dess sidokedjan ring konformationer (exo / endo puckers) ansvarar för en termodynamisk stabilisering av Amid obligationen. Riktade kemiska modifieringar (till exempel hydroxylations, fluorinations, methylations) av prolyl puckers påverkar ofta kritiskt fällbara stabilitet, byggnadsställning styvhet och funktioner av många biologiska strukturer22. Därför är det rimligt att förvänta sig att Pro→ proline analoga substitutioner kommer förse ring B, den andra ringen av nisin, med romanen och ovanliga egenskaper.
Här, en proline-auxotrophic E. coli stam användes för rekombinant nisin produktion. Detta kräver ett uttryck för prepeptide gen nisA samt den modifiering enzym gener nisBC. Genetiskt kodade peptid produkten bär en N-terminalt hans-taggade ledare för rening via affinitetskromatografi. Aktivitet beslutsamhet, används L. lactis uttrycka och utsöndrar NisPT för att aktivera rekombinant nisin varianter från E. coli cell lysates eller renat peptid prover (figur 1). Den mogna AMP frigörs efter klyvning av ledare genom NisP. I denna agar diffusion metod, AMP provet diffunderar in i solid odlingsmedium och kan hämma tillväxten av grampositiva mikroorganism. Efter inkubation, kan detta observeras visuellt av tillväxt hämning glorior. Utöver L. lactis som indikator, modified nisin varianter visade antimikrobiell aktivitet mot Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus , Bacillus cereusoch Lactobacillus johnsonii 21,23.
En alternativ och experimentellt olika metod att införliva ncAAs i RiPPs är stop kodon suppression (SCS)24. För detta, en ortogonal tRNA / aminoacyl-tRNA Synthetasen (aaRS) par krävs för motsvarande ncAA. Helst är alla dessa tre komponenter bioorthogonal, dvs de inte interagerar med den endogena tRNAs och aaRSs. En ncAA-specifika aaRS kan genereras genom ändring av den enzym aktiva platsen och screening av genetiska bibliotek av muterade synthetases25. Införandet av en ncAA kräver dessutom en codon som tilldelas och som inte koda för Luftfartsverket. Vanligen, är den gula stop kodon används24,26.
Nyligen inrättades SPI för införlivandet av α-chloroacetamide-innehållande och klick-kemi-kompatibla ncAAs i NisA27. Till exempel införlivades Nε- alloc-lysin den lasso peptid captistruin med platsspecifika (SCS) och rester-specifika (SPI) införlivandet metoder och därefter ändrade in vitro genom rutenium-katalyseras metates28 . I jämförelse med SPI, metoden SCS är mer komplicerat eftersom en ortogonal tRNA / aaRS par måste vara co uttryckt. O-par för proline införlivandet har hittills varit utvecklade29, men till bäst av vår kunskap, inget exempel proline analoga stiftelseurkunden har rapporterats.
Det bör noteras att inte alla ncAAs kan införlivas med metoden som SPI. Först, upptaget av ncAAs in i cytoplasman är reglerad av en mängd transportproteiner som är inbäddade i cytoplasmic membranet, vilket är det inre membranet för gramnegativa bakterier som E. coli. Normalt är E. coli kan transportera ett brett utbud av aminosyra analoger in i cellen med sida kedjor strukturellt och kemiskt liknar kanoniska aminosyror. Andra, många Kemiskt reaktiva eller instabil ncAAs kan fungera som en hämmare mot cellulära tillväxt, eftersom de är giftiga för metabolism och fysiologi i mottagande cellen30. Således bör det upptag och toxicitet av ncAA för produktion värden testas i förväg. För att undvika inaktivering av PTM maskinen som en bieffekt, en strängt kontrollerade uttryck inställning av de ansvariga generna kan användas för att införliva den naturliga aminosyran i ändring enzymer (t.ex. nisBC) och ncAA i målgenen ( t.ex. nisA). Detta kan åstadkommas med två olika initiativtagare och induktion av målet genuttryck, vilket framgår i specialdesignade SPI protokoll31. Enligt ovan, bygger metoden SPI på avslappnad substrat specificiteten av de årliga verksamhetsrapporterna, vilket möjliggör ncAA aktivering och cognate tRNA laddning. Därefter levereras tRNAen till Ribosomen följt av Amid bond bildandet och vikning av mål (poly) peptiden. I denna processer, kan korrekturläsning och redigering mekanismer bli relevanta32. Av dessa skäl är det av stor vikt att ha ett mål ncAA som strukturellt och kemiskt liknar Luftfartsverket. Andra viktiga punkter är tillräcklig stabilitet (både i tillväxt medier och utsätts för cellulära metabolismen) och löslighet i ncAA. Dessutom bör man antingen kommersiellt tillgänglig eller lätt att syntetiseras kemiskt.
Här beskriver vi ett protokoll för SPI, så att rester-specifika införlivande av ncAAs i rekombinant RiPPs. Särskilt olika proline analoger införlivas i den antimikrobiella peptid nisin A med E. coli som värdorganism. Masspektrometri används för att verifiera aminosyra ersättning och peptid produkter analyseras för bioaktivitet använder tillväxt hämning analyser och fluorescensmikroskopi använder mikrobiell indikator stammar.
Grundkravet för framgångsrika rekombinant nisin uttryck med definierade ncAAs kräver en lämplig proline auxotrophic E. coli -stam. För detta auxotrophy, proA måste vara dysfunktionella, exempelvis uppnås genom genomisk knockout. Celler helt berövas intracellulära Pro biosyntes (dvs borttagande av proABC) utan möjligheten för återgång är stabila auxotrophs. Utbredda gen knockout metoder är phage transduktion eller singel-gen knockout enligt Datsenko & Wanner33. ProA knockout stammar kan dessutom erhållas från offentliga databaser såsom Addgene, CGSC eller samlingen Keio. Eftersom uttrycket rekombinant nisABC som visas här är beroende av användningen av T7 initiativtagare, har uttryck värd stammen att bära en inducerbara genen för T7 RNA-polymeras. Detta kan uppnås genom införandet av den λDE3 profagen i värd genomet, till exempel hjälp av kommersiella kit. Alternativt, stammar såsom BL21(DE3) kan göras auxotrophic som beskrivs ovan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">P029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guanidine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0035.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dipotassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P749.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3904.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P030.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-alanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-arginine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3144.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-asparagine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>HN23.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T202.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3467.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3772.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamic acid</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3774.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glycine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3187.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-histidine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3852.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-isoleucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3922.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-leucine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine monohydrate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-methionine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>9359.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-phenylalanine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4491.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-proline</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-serine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4682.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-threonine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T206.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tryptophan</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4858.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-tyrosine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T207.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-valine</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>4879.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3746.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">magnesium sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>0261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">D-glucose</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>6780</td>
			<td style="width:167px;">prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>PN93.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iron(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>372870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">biotin</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3822.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>102792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manganese(II) chloride</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">zinc chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck, Germany</td>
			<td>108816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">immonium orthomolybdate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>7533.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>K029.5</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 100 &#181;g/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T832.2</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 50 &#181;g/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3886.1</td>
			<td style="width:167px;">working concentration 5 &#181;g/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4R)-fluoroproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-3975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">(4S)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">(4R)-hydroxyproline</td>
			<td style="width:123px;">Bachem, Switzerland</td>
			<td>F-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">(4S)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">(4R)-methanoproline</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td>chemically synthesized</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>P074.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ethanol</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>20825.324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;">M17-broth</td>
			<td style="width:123px;">Sigmal-Aldrich, Germany</td>
			<td>56156</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, see Terzaghi BE &#38; Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">agar-agar</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>5210.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nisin from Lactococcus lactis&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">N5764</td>
			<td style="width:167px;">commercial product, can be used as reference for bioactivity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">imidazole</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>3899.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL autosampler vial for LC-MS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formic acid</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td style="width:344px;">HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td style="width:167px;">LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">29-0486-31</td>
			<td style="width:167px;">different manufacturers and resins available for IMAC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">0.45 &#181;m bottle top filter unit</td>
			<td style="width:123px;">VWR, Germany</td>
			<td>10040-470</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">0.45 &#181;m syringe filter PVDF membrane</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">CCY1.1</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">luer-lock syringe, PP, 50 ml</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td>T552.2</td>
			<td style="width:167px;">sterile filtration of solutions&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">30120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">TA19</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Nile red</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">72485</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli &#916;proA strain</td>
			<td style="width:123px;">CGSC, Keio collection</td>
			<td style="width:344px;">JW0233-2</td>
			<td style="width:167px;">proline-auxotrophic E. coli K-12 strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">E. coli B834(DE3)</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td>69041</td>
			<td style="width:167px;">methionine-auxotrophic E. coli B strain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#955;DE3 Lysogenization Kit</td>
			<td style="width:123px;">Novagen (Merck), Germany</td>
			<td style="width:344px;">69734-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">bacterial indicator strain, see Khusainov R &#38; Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:344px;">5427 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peristaltic pump</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">P1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FPLC system</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:344px;">&#196;kta Purifier 10 or the like</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">inverted microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:344px;">TI Eclipse wide-field fluorescence microscope&#160; with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">electron multiplying CCD (EMCCD) camera</td>
			<td style="width:123px;">Andor Technologies, UK</td>
			<td style="width:344px;">Andor Luca&#160;</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fluorescence excitation filter</td>
			<td style="width:123px;">Thorlabs, USA</td>
			<td style="width:344px;">Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC)</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">fluorescence emission filter</td>
			<td style="width:123px;">AHF Analysentechnik, Germany</td>
			<td style="width:344px;">T 560 LPXR</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cover slip 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:123px;">Carl Roth, Germany</td>
			<td style="width:344px;">LH26.1</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Immersion Oil</td>
			<td style="width:123px;">Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>Immersol 518 F</td>
			<td style="width:167px;">example setup for fluorescence microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">probe sonicator</td>
			<td style="width:123px;">Bandelin, Germany</td>
			<td style="width:344px;">Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72</td>
			<td style="width:167px;">200 W maximum HF output</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 &#181;m particle size)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:344px;">567227-U</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ESI-TOF coupled to HPLC system</td>
			<td style="width:123px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:344px;">Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC</td>
			<td style="width:167px;">example setup for mass spectrometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids

Naturen har en mängd möjligheter att skapa nya protein funktioner genom att ändra sekvensen av enskilda aminosyror byggstenar. Men är alla varianter baserade på de 20 kanoniska aminosyrorna (cAAs). Som ett sätt att införa ytterligare fysikalisk-kemiska egenskaper i polypeptider, används införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) alltmer i proteinteknik. På grund av sin relativt korta längd och är ändring av ribosomally syntetiserade och post-translationally modifierade peptider av ncAAs särskilt attraktiva. Nya funktioner och kemiska handtag kan genereras av särskilda modifikationer av enskilda rester. Selektionstryck inkorporering (SPI) metoden utnyttjar auxotrophic värd stammar som berövas en essentiell aminosyra i kemiskt definierade tillväxt medier. Flera strukturellt och kemiskt liknande aminosyra analoger kan sedan aktiveras av den motsvarande aminoacyl-tRNA-syntetas och ge rester-specifika cAA(s) → ncAA(s) substitutioner i sekvensen mål peptid eller protein. Även om, i samband med metoden SPI, ncAAs också införlivas i det värd proteomet under fasen av rekombinant genuttryck, tilldelas majoriteten av cellens resurser uttrycket av målgenen. Detta möjliggör effektiv rester-specifika inkorporering av ncAAs ofta tillsammans med höga mängder av modifierade mål. Presenterade arbetet beskrivs i vivo införlivandet av sex proline analoger i den antimikrobiella peptid nisin, en lantibiotic som produceras naturligt av Lactococcus lactis. Antimikrobiella egenskaper av nisin kan ändras och byggas under jäsning och uttryck i auxotrophic Escherichia coli stammar i definierade tillväxt medier. Därmed kan effekterna av rester-specifika byte av cAAs med ncAAs leverera förändringar i antimikrobiell aktivitet och specificitet. Antimikrobiella aktivitet analyser och fluorescensmikroskopi används för att testa den nya nisin varianter för tillväxthämning av en grampositiva Lactococcus lactis indikator stam. Massa spektroskopi används för att bekräfta ncAA inkorporering bioaktiva nisin varianter.

Detta protokoll syftar till att möjliggöra produktion av ncAA-modifierade nisin varianter med rester-specifika inkorporering av prolin analoger av metoden SPI. Tidigare rapporterades genomförbarheten och avkastningen på 24 mg/L för rekombinant framställning av fullt modifierade vildtyp nisin39. Använder metoden SPI mål peptid och protein avkastning är ofta bra och kan nå kvantiteter nära vildtyp produktion48. Som första experiment, bör rekombinant vildtyp RiPP produktion testas i den valda auxotrophic mottagande. Här, den proline-auxotrophic E. coli MG1655 ΔProbo:: frt ΔproC:: frt (DE3) användes som värd stam. För införlivandet av ncAAs, odling och induktion kan timing samt medelstora sammansättning och temperatur optimeras mot maximal peptid avkastning.
Antimikrobiella aktivitet assay Vildtyp rekombinant nisin produktion och rening utfördes efter protokollet ovan. I det här fallet användes proline istället för dess ncAA derivat vid steg 3.6. En antimikrobiell aktivitet assay användes att verifiera RiPP produktion och att jämföra antimikrobiella aktivitet före och efter rening. För aktivitet analysen, eluering fraktioner och IMAC genomflöde användes direkt och testats mot grampositiva L. lactis indikator stammen (figur 2). Som denna stam uttrycker NisP, varianter av nisin som ingår i E. coli cell lysates eller renat peptid prover, respektive aktiveras genom proteolytisk klyvning av ledare peptiden. Tydligen, genomströmmande visade tillväxt-hämmande aktivitet. Detta kan förklaras av bioaktiva material inte bindande till kolumnen IMAC. De testa eluering fraktionerna alla visade ökad aktivitet jämfört med orenat provet, vilket indikerar en koncentration av hans-taggade peptiden av IMAC. Observera att eluering bufferten (som negativ kontroll) inte påverkade tillväxten av L. lactis i denna analys.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> Figur 2 . Antimikrobiella aktivitet testa efter IMAC rening av recombinantly producerade vildtyp nisin. Eluering fraktioner 5 till 15 och flödet genom IMAC rening testades i jämförelse med den orenat cell lysate (utspädd för OD600 normalisering) mot L. lactis indikator stammen. Storleken på tillväxt hämning glorior anger antimikrobiell aktivitet. Kloramfenikol vid en koncentration på 400 µg/mL användes som en positiv kontroll och IMAC eluering bufferten som negativ kontroll. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
För att bevisa den antimikrobiella aktiviteten av recombinantly produceras nisin varianter som innehåller sex olika proline analoger, en aktivitet assay utfördes för att testa hämning av L. lactis indikator stammen. Figur 3 visar tillväxthämning för fem av de sex prover som produceras med hjälp av prolin analoger. De bästa resultaten (som bedöms från halo storlekar) observerades för inkorporeringen experiment av analog (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroxiprolin och 4S-methanoproline. Jämföra tillväxt hämning halo storleken till den vildtyp nisin tillverkas och testas parallellt, alla tre nisin varianter visade liknande hämning styrka. Halo storlek ensam kan emellertid inte används för att bedöma en specifik aktivitet, eftersom koncentrationen av AMP inte fastställdes. Därför tjäna analyserna bara för att testa kvalitativt om antimikrobiella aktivitet av de resulterande nisin varianterna är bevarade eller förlorat. För att bestämma den specifika aktiviteten, måste koncentrationen av varianter av nisin vara kvantifierade (se diskussion).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> Figur 3 . Antimikrobiella aktivitet haltbestämning av cell lysates innehållande nisin varianter produceras via SPI med proline analoger. Jämförelse av nisin varianter med rekombinant vildtyps-prover. Alla prover var OD600-normaliseras efter cell lysis i förhållande till den skördade celldensitet kultur. Glorior ange bioaktivitet i form av indikator stam tillväxthämning. Första raden från vänster till höger: (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroxiprolin, (4R) - methanoproline och kloramfenikol (400 µg/mL; antimikrobiella positiv kontroll). Andra raden: (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroxiprolin, (4S) - methanoproline och prolin (vildtyp kontroll). Observera den kemiska nomenklaturen. t.ex. (4R) - fluoroproline är också kallad trans-4 - fluoroproline. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
LC-ESI-TOF masspektrometri Efter IMAC rening analyserades införlivandet av ncAAs i nisin med LC-ESI-TOF masspektrometri. Figur 4 visar de deconvoluted masspektra av en nisin variant som innehåller (4R)-fluoroproline. Denna variant var IMAC renas enligt ovan och därefter analyseras av LC-ESI-TOF masspektrometri, så det bar fortfarande ledare. Den största toppen i figur 4A motsvarar den modifierade nisin som innehåller (4R)-fluoroproline med en deconvoluted massa 6883.18 Da (beräknade massan 6882.05 Da, beräknas massan av motsvarande vildtyp peptiden med proline på position 9 är 6864.06 Da). De två topparna med lägre överflöd och högre massa motsvarar natrium addukter som anges. Figur 4 B visar olikt laddade arter av huvudsakligt förening som finns av deconvolution algoritmen. Till exempel toppen vid 1148.11 m/z motsvarar sex gånger laddade arten ([M + 6H]6 +).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> Figur 4 . LC-ESI-TOF masspektrometri av IMAC-renat rekombinant nisin varianter innehållande (4R)-fluoroproline. (A) Deconvoluted masspektrometri kromatogrammet (utzoomad i infällt) för nisin varianten (fortfarande bär ledaren) med (4R)-fluoroproline (förväntat massorna (Da): [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) sammansatta spectra för arter [M + H]+. Förväntat massorna (Da): [M + 5H]5 + = 1377.41, [M + 6 H]6 + = 1148.01, [M + 7 H]7 + = 984.15, [M + 8 H]8 + = 861.26, [M + 9 H]9 + = 765.67, [M + 10 H]10 + = 689.21, [M + 11 H]11 + = 626.64, [M + 12 H] 12 + = 574.50. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Fluorescensmikroskopi Antimikrobiell aktivitet av rekombinant nisin och dess ncAA-innehållande varianter kan också visas genom direkt observation av de L. lactis indikator stam via fluorescensmikroskopi. Nile röd, ett starkt hydrofoba fluorescerande färgämne, användes för att färga bakteriell cellmembranet. Figur 5 visar den kvalitativa förändringen av tillståndet aggregering av cellodling och enda cellmorfologi. Cellerna var fläckade av Nile röd och deponeras på en mikroskopi cover bild. Den övre raden visar cellerna direkt i början när buffert, rekombinant vildtyp nisin eller nisin innehåller (4R)-fluoroproline, eller (4R)-hydroxiprolin lades till. Den nedre panelen visar motsvarande bilder efter 20 minuters inkubation.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> Figur 5 . Fluorescensmikroskopi av rekombinant nisin effekt på grampositiva celler. Mikroskopiska bilder av 30 µL L. lactis indikator stam (OD600 = 1) märkt med Nile röd togs innan (övre panelen) och efter (nedre panelen) 20 min inkubation med 1 µL buffert (A), 0,3 µL rekombinant vildtyp nisin (B) och 0.6 µL nisin varianter innehållande (4R)-fluoroproline (C) och (4R)-hydroxiprolin (D). Blå cirklar Markera regioner med aggregerade eller deformerade celler, blå pilarna pekar till regioner där diffusion av fluorescerande membran fragment kan observeras. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Figur 5 A visar att det allmänna utseendet på cellerna inte ändrade inom 20 minuter för observation. Endast antalet celler som sätts in under den tid Rosen och därmed en större mängd celler är synlig inom den 80 µm x 80 µm i regionen observerade. Figur 5 B visar att grampositiva cellerna medverkade aggregerade och suddiga (markerad med blå cirklar) efter 20 minuters exponering för vildtyp nisin, även när låga belopp (här, 0,3 µL IMAC eluering) lades till. Dessutom sprids lätt material från celler in i bufferten, vilket indikerar att membranet fragment markerade med Nile röd var mobiliserade under tidsramen (markerad med blå pilar). Dessa fynd tyder cellys som det visades att inträffa vid behandling med nisin6,49. Liknande effekter observerades efter inkubation med den nisin variant som innehåller (4R) - fluoroproline (bild 5C) och nisin som innehåller (4R) - hydroxiprolin (figur 5D) båda visar stora mängder av förvrängd och aggregerade celler efter 20 minuter, i bjärt kontrast till stickprov (figur 5A).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4) 2 SÅ4 </td>
			<td>7.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>8.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glukos</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alla kanoniska aminosyror (utom den att ersätta)</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FE2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spårämnen (Cu2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)</td>
			<td>0.01 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiamin</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Sammansättning av NMM19 kemiskt definierade bakterietillväxt medium efter beredning enligt steg 2.

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids at JoVE.com

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Presenteras i protokollet den Escherichia coli-baserat selektionstryck införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) i Lactococcus antimikrobiell peptid nisin. Dess egenskaper kan ändras under rekombinant uttryck via substitution med önskad ncAAs i definierade tillväxt medier. Förändringar i bioaktivitet mappas av tillväxt hämning analyser och fluorescensmikroskopi.

Antimikrobiella peptider produceras av selektionstryck införlivandet av icke-kanoniska aminosyror

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Leverans av proteiner, peptider eller cellimpermeabel Små molekyler i levande celler genom inkubation med Endosomolytic Reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Ammoniak syntes vid lågt tryck

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mönstring bioaktiva proteiner eller peptider på Hydrogel med fotokemi för biologiska tillämpningar

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Visuell identifiering av flera Nucleic syror i en kapillär matris

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Golden' fluorescens vid selektionstryck inkorporering av icke-kanoniska aminosyror och proteinanalys av masspektrometri och fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Lokalt av primära nedsatt vävnad segment och inkorporering med romanen byggnadsställning-fri konstruktion teknik

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Bedömningen av kollagen och Elastin Pressure-dependent Microarchitectures i Live, mänskliga motstånd artärer av etikett-fri fluorescensmikroskopi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

Antimikrobiella karakterisering av avancerade material för bioteknik applikationer

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...