Name: a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

Vi vil gerne takke Mads Radmer Jensen for sit praktiske og akademiske råd; Lau Lindqvist og Kaare Svejstrup for at yde teknisk ekspertise; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt og Solveig W. Harpøth for deres tekniske bistand; Personalet på Gentofte TB ambulatorium for deres uddannelse i PPD-administration; og alle frivillige til at deltage i undersøgelsen. Dette projekt er finansieret af Europa Kommissionens H2020 program [grant nummer TBVAC2020 643381], og vi vil gerne takke konsortiets partnere for de givtige drøftelser.

Alle metoder, der beskrives nedenfor, herunder brugen af menneskelige frivillige, er blevet godkendt af den danske Komité for sundhed Research etik (H-15002988) og Dansk Data Protection Agency (jr.nr. 2015-57-0102). PPD skal være et certificeret produkt godkendt til human brug og administreres inden for den korrekte dosis fra producenten. Enhver afvigelse i dosis eller administration kan kræve yderligere etiske godkendelser og frivillige skal give et informeret samtykke.
1. tuberkulin hudtest
<ol><li>Opnå mundtlig og skriftlig informeret samtykke fra frivilligt. Før injektion, sikre, at volontøren forstår og accepterer den procedure, herunder de mulige negative virkninger. Bemærk: Inklusionskriterierne specifikt for denne protokol er alder > 18 år og en dokumenteret BCG-vaccination. Inklusionskriterierne kan variere afhængigt af problemformulering (dvs.en yderligere integration kriterium kunne være tegn på positive TST).</li>
	<li>Bruge en færdiglavet løsning PPD til human brug [20 tuberkulin enheder (TU) /mL]. Desinficere gummihætte af et hætteglas med en spritserviet.</li>
	<li>Forberede injektionsstedet<ol>
<li>Find injektionsstedet på den ventrale side af volontørens underarmen.</li>
		<li>Placer arm palm-up på en overflade og vælg et område på den øverste tredjedel af underarmen, ca 5-10 cm fra albueleddet. Holde klar af ar, vener eller beskadiget hud.</li>
		<li>Desinficere området med en alkoholisk vatpind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede PPD-løsning<ol>
<li>Bruge en 1 mL steril sprøjte med en 27-30G/kort (f.eks., 12 mm) fast nål.</li>
		<li>Forsigtigt blandes og aspire 0,1 mL af PPD-løsning. Sørg for, at der er ingen synlige bobler.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intradermal PPD-injektion Bemærk: Dette trin beskriver, hvordan du udfører en enkelt PPD-aflejring, men flere depositionerne af PPD i den samme arm er muligt. Dette kan dog kræve bestemte etiske godkendelse.<ol>
<li>Strække huden og punkt nålen i en 5-15° vinkel til huden med facet vender opad.</li>
		<li>Indsæt spidsen af nålen i den dermale lag af huden og sørg for, at spidsen er næsten synlige gennem epidermis.</li>
		<li>Langsomt injicere 0,1 mL af PPD-løsning. Bemærk: Hvis administreres korrekt, en bleg papel 6-10 mm vises straks. Papel forsvinder efter ca 10 min.</li>
		<li>Når to eller flere depositionerne, stræbe efter en maksimal adskillelse (5-10 cm) af injektionssteder samtidig holde i god afstand fra området albue og håndled. Bemærk: Dette forhindrer en potentiel sammenløbet af hudtest svar og giver mulighed for uafbrudt positionering af to suge kamre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. evaluering af hudreaktion - dag 3
<ol><li>Efter 48-72 h, Bemærk størrelsen af hudreaktion. Måle induration (hævelse) og ikke erytem (rødme) af reaktionen.</li>
	<li>Palpere den hårde hævelse ved hjælp af fingre og derefter markere kanterne af induration ved hjælp af en kuglepen. Bruge en lineal til at måle induration diameter og Bemærk resultatet i mm. Bemærk: En læsning af induration størrelse kan guide valg af blænde diameter suge kammer.</li>
</ol>3. suge Blister induktion - dag 7
<ol><li>Samle sugeanordning enhed. Bemærk: Suge enhed enheder er vakuum pumper med vedlagte kamre til suge blister induktion. Enheden bruges i denne demonstration er custom lavet, men sugeanordning enheder er også kommercielt tilgængelige. Pumpen skal indstilles inden for intervallet af -20 til-40 kPa og giver en stabil og pålidelig undertryk. Regionale etiske godkendelse skal indhentes forud for gennemføre eksperimenter ved hjælp af denne metode.<ol>
<li>Først, forberede det suge kammer ved at samle blænde bundplade og vinduet plade med kammeret og forbinder slangen. Vedhæfte kammer-forbinder slangen stramt til vakuumpumpen. Bemærk: Afdelingerne bør omfatte en bundplade med et hul til blister induktion, som bør være egnet til kontakt med den menneskelige hud, og en øverste plade med et vindue, giver mulighed for den visuelle overvågning af blister.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestemme den optimale blænde diameter af blænde pladen i forhold til størrelsen af hudreaktion; jo større størrelse af blænde, jo større blister.</li>
	<li>Desinficere blænde plade og huden volontørens ved hjælp af alkohol svaberprøver.</li>
	<li>Fastgør de suge kammer på huden.<ol>
<li>Sørg for, at den frivillige arm hvilende komfortabelt.</li>
		<li>Sørg for, at hul i bundpladen af den suge kammer ligger over PPD-reaktion, så at hudreaktion ligger synlige.</li>
		<li>Sikre salen løst ved hjælp af stropper: når undertryk anvendes, salen vil overholde huden og bevare sin position.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tænd sugeenheden og Juster trykket til-20 kPa.</li>
	<li>Efter 30 min, øge den negative pres-25 kPa.</li>
	<li>Efter 60 min, yderligere at øge den negative pres-30 kPa.</li>
	<li>Holde trykket på-30 kPa, indtil en blister er fuldt dannet. Sikre, at det negative pres i denne protokol er specifikke for en tilpassede instrument. Det kan være nødvendigt at justere trykket lidt, når de anvender protokollen i andre indstillinger. Bemærk: Blister induktion fase spænder fra 60 til 180 min. (1-3 h) med faktiske blister dannelsen sker inden for de sidste 30 min. Blistering er ofte forbundet med en kløende fornemmelse. Blister kan forekomme som enkelt eller flere fusionerende vabler. Hvis blister ruptur eller blødning opstår, kan det anbefales at opsige blister induktion af langsomt frigive trykket.</li>
	<li>Efter blister er fuldt dannet, frigive trykket, og fjern forsigtigt de suge kammer fra huden uden brud blister.</li>
	<li>Anvende en blød forbinding på det omgivende hudområde og placere en hård hætte (f.eks.fra en 50 mL plastikrør) over blister.</li>
	<li>Sikre fælles landbrugspolitik med ikke-allergifremkaldende kirurgisk tape efterfulgt af en blød elastisk bandage.</li>
	<li>Instruere frivilligt til at undgå overdreven fysisk belastning på blister inden for de næste 12-24 timer.</li>
</ol>4. høst af Blister væske - dag 8
<ol><li>Den 8th dag, forsigtigt fjerne den beskyttende dressing og desinficere blister med huden desinficeres spray.</li>
	<li>Brug en 2 mL steril sprøjte med en 23G nål til at høste blister indhold. Indsætte nålen ind i top/laterale side af blister taget og langsomt Opsug væsken. Undgå at berøre gulvet i hulrummet, men sørg for at høste alle væske.</li>
	<li>Anvende en dressing på den kollapsede blister.</li>
	<li>Overføre blister væske til en steril tube. Bemærk volumen.</li>
	<li>Spin blister væske ned på 600 x g ved hjælp af en bordplade centrifuge i 4 min.</li>
	<li>Overføre supernatanten til et andet rør og resuspenderes celle i 500 µL af celle medium. Bemærk: Cellerne er nu klar til optælling og yderligere analyse. Supernatanter kan opbevares ved -20 til-80 ° C indtil brug.</li>
</ol>5. analyser af suge Blister celler og væsker
Bemærk: Giver anvisninger til analyse af celler og væske fra huden suge blærer er ikke omfattet af denne protokol. Men for at give repræsentative resultater for denne betænkning, intracellulære pletten flow flowcytometri og multiplex analyser blev udført. Metoden, der er beskrevet i korte træk nedenfor.
<ol><li>Flowcytometri<ol>
<li>Stimulere suspensioner af 1 x 105 friske celler isoleret fra suge blærer fra 1 BCG-vaccinerede frivillige med 10 µg/mL PPD og inkuberes cellerne ved 37 ° C og 5% CO2. Omfatte unstimulated celler for en parallel inkubation.</li>
		<li>Stimulere suspensioner 1 x 106 PBMC fremstillet af 1 BCG-vaccinerede frivillige med 10 µg/mL PPD og inkuberes blanding ved 37 ° C og 5% CO2. Omfatte unstimulated celler for en parallel inkubation.</li>
		<li>Efter 2 h, behandle alle celler med Brefaldin A og monensin og inkuberes dem i 6 timer ved 37° C.</li>
		<li>Pletten celler med et panel af Live/Dead-pletten-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 og anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>Omfatte FMO kontrolelementer i panelet PBMC.</li>
		<li>Udfører en cytometric analyse med en flow forskellige og analysere resultaterne ved hjælp af relevante software.</li>
		<li>Gate på de cytokin-producerende CD3 + CD4 + CD8-delmængder ved hjælp af de følgende gating strategi: slåbrokker - > levedygtige CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + eller IL-2 +.</li>
		<li>Gate på effektor hukommelse cellepopulationer ved hjælp af de følgende gating strategi: slåbrokker - > levedygtige CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Beregne individuelle cytokin profiler ved hjælp af booleske gating.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytokin release demonstrationer<ol>
<li>For en demonstration af en cytokin frigivelse i vivo, bruge en multiplex analyser til at kvantificere niveauerne af IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10, og IL-13 i optøede suge blister væske fremstillet af 4 frivillige.</li>
		<li>For en demonstration af en cytokin frigivelse af celler udvundet suge blærer ex vivo, brug friske suge blister celler og PBMC fremstillet af 1 BCG-vaccinerede frivillige.</li>
		<li>Inficere PBMC og suge blister celler med 100 kolonidannende enheder (CFU) af Mtb H37Rv og inkuberes dem i 4 dage.</li>
		<li>Bruge en multiplex analyser til at kvantificere niveauerne af IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10, og IL-13 i alle kultur analysere.</li>
		<li>Juster målene ovenfor assay beregning range til den øverste beregning grænse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kiistala, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+blister+device+for+separation+of+viable+epidermis+from+dermis.">Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).</li><li>Akbar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+cutaneous+response+to+recall+antigen+in+humans+in+vivo.">Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).</li><li>Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blistering+time+as+a+parameter+for+the+strength+of+dermoepidermal+adhesion:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis.</a> British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).</li><li>Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suction+blister+model+reliably+assesses+skin+barrier+restoration+and+immune+response.">A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response.</a> Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).</li><li>Maranda, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+management+of+leukoderma+after+burn:+A+review.">Surgical management of leukoderma after burn: A review.</a> Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).</li><li>Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studiea.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Maini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Human+Neutrophils+Acquired+from+Four+Experimental+Models+of+Inflammation.">A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation.</a> PLoS ONE. 11 (10), (2016).</li><li>Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+blister+immunocytology.+A+new+method+to+quantify+cellular+kinetics+in+vivo.">Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo.</a> Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).</li><li>Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+suction+blistering+in+human+skin+using+optical+coherence+tomography.">Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).</li><li>Belson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+clinical+and+activated+T+cell+response+to+repeat+delayed-type+hypersensitivity+skin+challenges+in+human+subjects,+with+KLH+and+PPD,+as+a+potential+model+to+test+T+cell-targeted+therapies.">Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies.</a> Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans.">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li><li>Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+markers+and+correlates+of+protection+for+vaccine+induced+immune+responses.">Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses.</a> Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , (2018).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella+Zoster-Specific+CD4+Foxp3++T+Cells+Accumulate+after+Cutaneous+Antigen+Challenge+in+Humans.">Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans.</a> The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).</li><li>Reed, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+erosion+in+memory+T+cells+induced+by+telomerase+inhibition+at+the+site+of+antigenic+challenge+in+vivo.">Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).</li><li>Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-Needle+Aspiration+Biopsy+of+the+Lymph+Node:+A+Novel+Tool+for+the+Monitoring+of+Immune+Responses+after+Skin+Antigen+Delivery.">Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery.</a> The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).</li><li>Bond, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+infiltrate+the+skin+in+positive+tuberculin+skin+test+indurations.">Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).</li><li>Bell, L. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Molecular+Dissection+of+the+Effects+of+HIV-1+in+Active+Tuberculosis.">In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469 (2016).</li><li>Tomlinson, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+innate+and+adaptive+human+immune+responses+to+mycobacteria+in+the+tuberculin+skin+test.">Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test.</a> European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).</li><li>Nayak, S., Acharjya, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+test+and+its+interpretation.">Mantoux test and its interpretation.</a> Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans.">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li><li>Menzies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+Repeated+Tuberculin+Tests.">Interpretation of Repeated Tuberculin Tests.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).</li><li>Pitzalis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+migration+of+the+human+helper-inducer+memory+T+cell+subset:+confirmation+by+in+vivo+cellular+kinetic+studies.">Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies.</a> European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).</li><li>Kool, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+blister+fluid+as+potential+body+fluid+for+biomarker+proteins.">Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins.</a> Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).</li><li>Flynn, J. L., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+tuberculosis.">Immunology of tuberculosis.</a> Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).</li><li>Kagina, B. M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+T+cell+frequency+and+cytokine+expression+profile+do+not+correlate+with+protection+against+tuberculosis+after+bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+vaccination+of+newborns.">Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination of newborns.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).</li><li>Garc&#237;a-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+tuberculosis+vaccine+trials+under+financial+constraints.">Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).</li><li>Luabeya, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-human+trial+of+the+post-exposure+tuberculosis+vaccine+H56:IC31+in+Mycobacterium+tuberculosis+infected+and+non-infected+healthy+adults.">First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults.</a> Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).</li><li>Tameris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+TB+vaccine,+MVA85A,+induces+highly+durable+Th1+responses.">The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses.</a> PloS One. 9 (2), e87340 (2014).</li><li>Woodworth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+vaccine+H56/CAF01+induces+a+population+of+circulating+CD4+T+cells+that+traffic+into+the+Mycobacterium+tuberculosis-infected+lung.">Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung.</a> Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).</li><li>Gideon, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+tuberculosis+granuloma+T+cell+responses+exists,+but+a+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+is+associated+with+sterilization.">Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization.</a> PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).</li><li>Ruhwald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+the+C-Tb+skin+test+to+diagnose+Mycobacterium+tuberculosis+infection,+compared+with+an+interferon+&#947;+release+assay+and+the+tuberculin+skin+test:+a+phase+3,+double-blind,+randomised,+controlled+trial.">Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon &#947; release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+Isolation+from+Human+Skin+for+Phenotypic+Analysis+and+Ex+Vivo+Cell+Culture.">Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Koskela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blister+fluid+and+serum+cytokine+levels+in+severe+sepsis+in+humans+reflect+skin+dysfunction.">Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).</li><li>Wada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+skin+blister+fluids+from+children+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease.">Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease.</a> The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).</li><li>Andersson, C., Rajala, T., S&#228;rkk&#228;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+models+for+epidermal+nerve+fiber+data.">Hierarchical models for epidermal nerve fiber data.</a> Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).</li><li>Ramshanker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Prednisolone+on+Serum+and+Tissue+Fluid+IGF-I+Receptor+Activation+and+Post-Receptor+Signaling+in+Humans.">Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).</li><li>Bouma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL20+neutralization+by+a+monoclonal+antibody+in+healthy+subjects+selectively+inhibits+recruitment+of+CCR6++cells+in+an+experimental+suction+blister.">CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Dette manuskript beskriver en praktisk procedure for undersøgelse af human immun hukommelse svar i vivo, ved hjælp af kutane antigen hjemkalde og celle høst af suge blister induktion. TST blev brugt som et eksempel på intradermale antigen deposition og tilbagekaldelse af BCG-vaccine. Endelig, et eksempel på SB modellen karakterisering af cytometric og multiplex cytokin analyse var forudsat demonstrerer, at omtrent en tredjedel af SB celler blev antigen-specifikke Polyfunktionelle T-celler af effektor hukommelse fænotype.
Kritiske trin i denne protokol omfatter intradermal injektionsteknik, suge blister induktion og blister punktering. For det første kræver en korrekt intradermal deposition uddannet personale. En forkert deposition kan føre til suboptimale resultater. PPD er generelt en velkendt og sikker kutane antigen, men dens sammensætning kan variere mellem producenter, begrænser sammenligneligheden13,20. Denne rapport indeholder instruktioner for en enkelt intradermal aflejring af 2 TU, og eventuelt to parallelle depositioner (2 x 2 TU), som kan kræve yderligere etisk godkendelse. Men, andre undersøgelser har brugt 10 TU, som øger sandsynligheden for en stærk hud reaktion10,21. Under trinnet SB induktion vil små trinvis stigninger i undertryk reducere risikoen for blødning og blister brud. Risikoen for kontaminering med røde blodlegemer eller leukocytter fra blodbanen er generelt lav2. Aseptisk punktering teknik forhindrer mikrobiel kontaminering og at undgå kontakt mellem punktering nålen og dermal blister gulvet reducerer urenheder af snavs eller bosiddende hudceller. Men nogle forskere foretrækker at høste SB væske ved at anvende en rullende pres punkteret blister10. Det kan være nødvendigt at punktere septa i blister. SB-teknikken selv er minimalt invasiv; skjulte SBs helbrede uden ardannelse og infektioner er meget sjældne. 2 dog en vis grad af hypo-pigmentering kan forekomme og SB induktion bør formentlig undgås hos personer med en historie af kolloid ardannelse.
Tekniske begrænsninger omfatter lave samlede celle udbytter og dermed begrænsede muligheder for langtidsopbevaring. Relationer mellem leukocyt-udbyttet, kliniske TST svar, blister størrelse og erytrocyt forurening er blevet grundigt beskrevet andetsteds2,10. I BCG-hjemkalde eksperimenter præsenteres her (figur 1) var det mediane samlede udbytte fra hver blister 50.000, hvilket indebærer en mindre eksperimentel opsætning ved hjælp af disse celler, især hvis SBC'er er studerede alene15. Dog den specifikke T-celle population SB prøve, for det meste overstiger hvad der er fundet i PBMC prøver i både relative og absolutte celletal. I eksemplet præsenteres i figur 2, blev antallet af triple-positive PPD-specifikke T-celler i en stikprøve af 100.000 SB celler mere end 2 x større end det antal findes i 1 x 106 PBMC fra den samme donor (data ikke vist). En visuel scoring af TST reaktion er den mest almindelige kliniske metode til vurdering af M. tuberkulose hukommelse. Af note højdepunkt den underliggende adaptive immunologiske reaktion ikke på samme tid som klinisk hud reaktion2,21. Ikke alle BCG-vaccineret eller Mtb-udsatte personer vil udvikle stærk TST reaktioner og strategier for klassificering og en håndtering af prøver fra TST ikke-responders, samt en forudbestående mykobakterielle sensibilisering i befolkningens undersøgelse skal overvejes før indlede en tilbagekaldelse retssag ved hjælp af denne metode. Også, i både SB prøveudtagning og visuel scoring, der er et potentiale for en teoretisk skævhed i personer med reduceret hud svar på grund af globale eller hud-relaterede nedsat immunitet som set, eksempelvis i HIV-infektion og visse aldersgrupper2, 13,18,20. En immunologisk opreklamering af TST reaktion med gentagne afprøvning er derudover velkendt20,22. Men SB celle fænotyper stadig temmelig konstant, når TSTs er gentagne10. Denne observation understøtter rollen som SB tilbagekaldelse i longitudinelle studier af cellulære immunrespons.
For T-celle immunologists tillader SB hjemkalde høst af høj fraktioner af antigen-specifikke celler. Men timingen af SB for et udsnit fra en PPD-deposition er kritisk, da både den cellulære sammensætning og cytokin mikromiljø ændrer sig over tid. I denne protokol, vabler var induceret 7-dages post udfordring og de isolerede celler var primært effektor memory CD4 + T-celler herunder høj brøkdele af celler med et fælles udtryk af IFN-γ, TNF-α og IL-2. Disse konstateringer er i tråd med tidligere undersøgelser beskriver hvordan T-celle aktivering, spredning og differentiering sker i PPD-pulverlak huden2,15,21. Kinetic SB undersøgelser i PPD-sensibiliseret individer tyder på, at den meget tidlige hud reaktion er uspecifik; men allerede inden for de første dage efter PPD-udfordring, svaret bliver domineret af CD4 + T-celler (begge centrale hukommelse og effektor hukommelse fænotyper er blevet beskrevet) og, efter 3 dage, svaret er domineret af høje fraktioner af PPD-specifikke cytokin produktion af CD4 + T-celler2,8,10,15,21. Denne adaptive cytokin respons fortsat kan spores mere end 2 uger2,8,10,23. Dag 7 indlæg-TST synes at være den mest optimale tidspunkt for indsamling af cytokin produktion memory CD4 + T-celler2. Dog kan andre tidspunkter naturligvis være relevante afhængigt af antigen og svar af interesse. Bemærk, i en undersøgelse, er den adaptive PPD-svar blevet rapporteret at toppe lidt tidligere med et fald i pro-inflammatorisk cytokin sekretionen allerede på 5 dage post-TST10.
SB væske indeholder høje niveauer af både pro-inflammatoriske cytokiner og andre proteiner, vist sig at være repræsentant for hud mikromiljø15,24. Kinetik undersøgelser har vist, at TNF-α og IFN-γ niveauer i SB væske peak efter 3 dage, mens IL-2 niveauer peak efter 7 dage2,10, sandsynligvis afspejler dominans af adaptive responser på dette senere tidspunkt. Fordi SB celler har været aktiveret i vivo, udviser de en høj spontan cytokin frigivelse samt et potentiale for en bestemt overgang ved restimulering (figur 3 og 4).
Denne rapport fokuserer på CD4 + T-celle immunitet. Som vist i figur 2, faktisk var fleste af de isolerede T-celler CD4 +, mens der var næsten ingen CD8 + T-celler i suge blister væske. Dette er i overensstemmelse med andre SB PPD-hjemkalde undersøgelser rapportering lav proportioner og en ringere vandrende kapacitet af CD8 + T-celler i forhold til CD4 + T celler2,8,10,23. En yderligere karakterisering af CD8 + bidrag ville være at foretrække; Dette er dog uden for rammerne af denne betænkning.
T-celler betragtes som væsentlige til immun kontrol af Mtb; Det har imidlertid været svært at identificere en pålidelig korrelat beskyttelsens afspejles i den adaptive immunrespons fra blod25,26. Denne vejspærring hindrer alvorligt udviklingen af nye TB vaccine, som i øjeblikket er der ikke noget alternativ til store og meget kostbare effektivitet forsøg27. TB vaccine udviklere bestemme vaccine immunogenicitet ved vurderingen af små og forbigående ændringer i vaccine-specifikke T-celle populationer i blod28,29. Det er dog tvivlsomt, om den lille brøkdel af cirkulerende antigen-specifikke T-celler i blodet er relevant (dvs., i stand til at migrere til stedet af en infektion og repræsentant for T-celle-rige mikromiljø kontrollerende Mtb) 27 , 30 , 31 .
Baseret på tidligere undersøgelser og data præsenteres heri, repræsenterer SB kutane hjemkalde model et uudnyttet potentiale for studier af vaccine-specifikke T-celler. Ikke alene giver modellen en tilbagekaldelse af en vaccine respons genereret årtier siden, det giver også en evaluering af den sande hukommelse potentiale i et væv-specifikke kontekst15,18,19,21. Roman, specifikke hudprøver, som omfatter antigener også består af kandidat subunit TB vacciner, foreslå nye muligheder for vaccine evaluering ved hjælp af denne model28,32. Desuden transkriptom analyser tyder på, at en celle - mediated immunrespons genereret i PPD-udfordret hud er magen til svar findes i Mtb-smittede lunge18.
Mens huden punch biopsier også give mulighed for en celle høst fra huden og give geografisk information, sammenlignet med SB prøvetagning, metoden er mere invasive og kræver enzymatiske eller mekanisk forarbejdning at forberede encellede suspensioner33. Målinger af cytokiner og celle markører kan sammenlignes mellem to metoder2,10.
Metoden suge blister er allerede blevet anvendt i mange områder af medicinsk forskning udover dermatologi, enten alene eller i kombination med en systemiske eller lokale hud udfordring. Eksempler er studier af sepsis, Epstein - Barr virus-associerede Lymfoproliferative sygdom, diabetisk neuropati, glukokortikoid indtag effekter og humane forsøg test terapeutiske antistoffer eller modeller for T-celle-målrettede behandlinger10 ,34,35,36,37,38.
Fra et terapeutisk synspunkt SB kutane hjemkalde metode giver enestående fordele for at studere den centrale T-celle hukommelse potentielle og -fra både biologiske og teknisk synspunkt-huden synes at give en relevant prøveudtagning rum2, 15,18,19,21. Især i forhold til traditionelle, passive prøveudtagning af cirkulerende PBMC, SB kutane hjemkalde metode giver mulighed for undersøgelse af T-celler, der har vist evnen til at migrere fra lymfeknude som svar på deres relevante antigen, og komplet lokalt udvidelse og differentiering i et væv-specifikke i vivo sammenhæng15,18,19,21.
Afslutningsvis viste model her kunne være relevant for forskere inden for menneskelige adaptive immunitet og T-celle målretning agenter (dvs., i smitsomme sygdomme vaccinologi eller kræft forskning). TST model anvendt i denne protokol er naturligvis af særlig relevans inden for TB vaccinologi. Men det grundlæggende koncept i denne model er stærkt gældende i andre områder inden for forskning.

En hud SB er et kunstigt induceret blister, der giver mulighed for høsten af celler og væske direkte fra huden. Teknik til at øge SBs af vakuum er et velkendt værktøj inden for dermatologi anvendes til undersøgelse af hud Immunologi i sundhed og sygdom1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. denne betænkning viser, hvordan den SB teknik kombineret med kutane antigene tilbagekaldelse (SB kutane hjemkalde metode) kan give direkte indsigt i adaptive immunrespons in vivo.
Princippet bag SB induktion er enkel: et lys vakuum er anvendt på et lille område af huden. Undertryk vil i sidste ende tvinge overhuden til at adskille fra dermis, at skabe en lokal blister fyldt med væske og celler1,2,9. Blister væske kan høstes ved en fin nål aspiration og indholdet kan bruges til yderligere undersøgelse i vitro.
I de seneste år har der været en stigende interesse i SB metode til undersøgelse af i vivo immunrespons end sygdomme begrænset til hud10,11. Undersøgelse af en adaptive immunitet hos mennesker er begrænset af det faktum, at celler og cytokiner af interesse er samplet fra perifert blod, fordi en invasiv prøvetagning af lymfeknude eller mave slimhinden væv kan være uacceptabelt og uetisk. Et eksempel er studiet af langlivede menneskelige memory T-celle svar efter vaccination12. I sådanne forsøg, prøveudtagning af relevante T-celler kan være en stor udfordring, fordi de relevante befolkning af celler, der mægle immunitet er bosat i den lymfoide væv, og kun et meget begrænset antal specifikke T-celler cirkulerer i det perifere blod.
SB teknik tilbyder en unik mulighed for at studere memory T-celler og andre specifikke cellepopulationer. Efter den kutane podning af antigen, T-celler specifikke til antigenet rekrutteres fra deres lymfoide hideaways på huden og kan nemt udtages fra SB. Programmerne metode og forskning af denne kutane hjemkalde model blev beskrevet af Akbar et al. i 20132. Et almindeligt anvendte antigen til huden tilbagekaldelse er kommercielt tilgængelige oprenset protein derivat (PPD) af mykobakterier bruges til at udføre en tuberkulin hudtest (TST)13, hvor PPD sprøjtes ind i de dermale lag af huden. Hos personer med en eksisterende immunologisk hukommelse mod PPD [fx, personer med en Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infektion eller en forudgående Bacillus Calmette Guérin (BCG) vaccination], antigen deposition resulterer i en husker svar med migration til huden og en i vivo klonal ekspansion af PPD-specifikke CD4 + T-celler2,11,14,15. Som et resultat, høj brøkdele af PPD-specifikke Polyfunktionelle CD4 + T-celler ophobes i huden klar til SB prøveudtagning. T-celler indsamlet af denne metode har vist sig for at være robust og er tilstrækkeligt rigelige til være kendetegnet ved en række immunassays og en langsigtet i vitro kultur15. Således, den kutane hjemkalde model og SB induktion kan bevise en værdifuld metode til at studere i vivo T-celle svar af ex vivo analyser, og øget viden om denne fremgangsmåde kan gavne forskere med interesser i cellulære immunologi og vaccinologi.
Denne rapport indeholder den første trinvis vejledning i at fremkalde menneskelige hud suge blærer i PPD-indsprøjtning hud. Kutane antigen hjemkalde model er påvist ved hjælp af TST i BCG-vaccinerede frivillige. Endelig, den relevante ex vivo analyse af celler og cytokiner isoleret af SB er eksemplificeret. Phenotypical og funktionelle egenskaber for PPD-specifikke T-celler fremstillet ved metoden SB er grundigt beskrevet andetsteds2,10,11,16,17, 18 , 19. Formålet med denne betænkning at diskutere de praktiske og immunologiske aspekter af metoden til at lette anvendelsen af denne teknik med andre forskergrupper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

Kutane antigen-hjemkalde modeller mulighed for undersøgelser af menneskelige hukommelse svar in vivo. Når det kombineres med hud suge blister (SB) induktion, tilbyder denne model tilgængelighed til sjældne populationer af antigen-specifikke T-celler repræsentant for den cellulære hukommelse svar samt cytokin mikromiljø i situ.
Denne rapport beskriver den praktiske procedure en kutan tilbagekaldelse, en SB induktion og en høst af antigen-specifikke T-celler. For at eksemplificere metoden, tuberkulin hudtest bruges til antigene tilbagekaldelse i personer, der forud for denne undersøgelse, undergik en Bacillus Calmette-Guérin vaccination mod en infektion med Mycobacterium tuberculosis. Endelig, eksempler på multiplex og flow cytometric analyser af SB prøver er angivet, illustrerer høj brøkdele af antigen-specifikke Polyfunktionelle CD4 + T-celler tilgængelige af denne prøveudtagningsmetode, sammenlignet med celler isoleret fra blodet.
Metoden beskrevet her er sikker og minimalt invasiv, giver en enestående mulighed for at studere både medfødte og adaptive immunrespons i vivo, og kan være til gavn for et bredt fællesskab af forskere, der arbejder med celle-medieret immunitet og menneskelige hukommelse svar, i forbindelse med vaccine udvikling.

Otte raske voksne frivillige (median alder: 30 år, spænder: 26-43 år) med en dokumenteret tidligere BCG vaccination (median tid fra BCG-vaccination: 5,5 år, rækkevidde: 1-30 år) indgik. Deltagerne blev udfordret intradermalt med 2 TU PPD efterfulgt af en TST evaluering på dag 3. SBs blev induceret på dag 7 og høstet på dag 8, og alle vabler var rejst ved hjælp af suge blister kamre med 10 mm blænde diameter. Syv personer blev givet 2 separate PPD-vaccinationer samtidigt i den samme arm, efterfulgt af 2 parallelle SB induktioner (der henvises til note om flere PPD-depositioner under trin 1.4 i protokollen). Perifert blod blev trukket på dag 7 i plasma og en PBMC isolation af tæthed gradient centrifugering. Plasma og væske analysere fra SBs opbevares ved-20 ° C. Frisk SB celler (SBCs) blev talt ved hjælp af nigrosine pletten og mikroskopi.
Kliniske TST svar og SBC udbytte er præsenteret i figur 1. Median størrelsen af TST indurations var 10.25 mm (interval: 0 - 20 mm) og median celle nummer pr. blister var 50.000 (range: 15.000-210.000 celler, antallet af vabler: 15). To af frivillige havde ingen klinisk respons i nogen af de 2 TSTs og en tilsvarende lav samlede celle udbytte af 15.000 celler/blister. Celle udbyttet var forbundet med den gennemsnitlige klinisk respons af TST (Spearmans r = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Figur 1 : Suge blister celle udbytte. (en) dette panel viser en repræsentant mikroskopi af nigrosine-farvede celler isoleret fra SBs rejst 7 dage post-TST. (b) dette panel viser forholdet mellem den gennemsnitlige TST induration (mm) og gennemsnitlig celle udbytte (n/blister) i 8 BCG-vaccinerede frivillige (antallet af blærer = 15). Prikkerne repræsenterer individuelle gennemsnitlige målinger. Bemærk venligst at 2 prikker er overlappende som 2 frivillige begge havde en TST induration 0 mm og en celle udbytte af 15.000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For at demonstrere flow cytometric SB karakterisering, SBCs blev indhentet fra en 43-årig frivillig, som havde været BCG-vaccineret 30 år tidligere og havde ingen kendt eksponering for Mtb. The SBCs blev isoleret efter induktion af en enkelt blister ( induration: 1,4 mm/100.000 SBCs). Figur 2 viser repræsentative parceller af intracellulære cytokin farvning af SBCs versus PBMC.
I denne frivillige brøkdel af CD3 + CD4 + CD8-SBCs steget fra 67% i unstimulated celler til > 90% ved en PPD in vitro- restimulering, mens brøkdel af CD3 + CD4 + CD8-PBMC forblev konstant (~ 51%, figur 2). Over 92% af in vitro- PPD-, såvel som de unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBC'er, var af typen effektor hukommelse (CCR7 - CD45RA-, data ikke vist). De samlede brøkdele af særlig CD3 + CD4 + CD8-celler induceret af PPD-stimulation var højere i SBC'er i forhold til PBMC (33.1 vs. 0,2%, unstimulated prøver trækkes fra). I PBMC var fraktioner af Polyfunktionelle PPD-specifikke CD3 + CD4 + CD8-celler alle < 0,05%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Figur 2 : Repræsentant flow flowcytometri parceller af SBCs versus PBMC. Paneler en og b viser repræsentative tæthed parceller af CD8 + og CD4 + populationer i (et) unstimulated vs. PPD-stimuleret PBMC og (c) SBCs. paneler b og d slow observationsområder af intracellulære cytokin farvning i PPD-stimuleret CD3 + CD4 + CD8-celler (b) PBMC og (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Som forventet, var CD3 + CD4 + CD8-SBCs aktiveret i vivo, illustreret ved en høj andel af cellerne farvning for upregulated cytokiner (12%), med den fremherskende cytokiner TNF-α og IFN-γ. Men efter PPD-stimulation, cytokin hemmelig celler flyttet mod en triple - eller dobbelt-positive IFN-γ + TNF-α + IL-2 + (17%) og IFN-γ + TNF-α + (15%) profil (figur 3b, PBMC profiler fra den samme donor er medtaget til sammenligning i Figur 3a). Cytokin udtryk profiler for PPD-stimuleret effektor memory CD4 + T-celle subsets (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) var sammenlignelig med CD3 + CD4 + CD8-befolkningen præsenteret i figur 2 og 3 (data ikke vist).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Figur 3: cytokin profiler til CD4 + PPD-stimuleret og unstimulated SBCs versus PBMC.  Disse paneler viser individuelle profiler for cytokin produktion (en) CD3 + CD4 + CD8-PBMC celler og (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Barer repræsenterer brøkdele af antigen-specifikke cytokin profiler i unstimulated celler (hvide barer) og ved en in vitro- stimulation med PPD (farvede bjælker).
For at udforske SB væske som en kilde til oplysninger om cytokin mikromiljø i stedet for den hudtest, blev cytokin niveauer målt i væske høstet fra SBs induceret 7 dage post-TST (figur 4a). De mediane niveauer af IFN-γ, TNF-α og IL-2 blev 339 pg/mL, 19 pg/mL og 1 pg/mL, henholdsvis (n = 6). Plasmaniveauer var generelt meget lavt. Celler isoleret fra SBs fremstillet høje niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner ex vivo (figur 4b). Titreringer af SBCs fra 1 frivillige var kulturperler i 4 dage i nærværelse af virulente M. tuberkulose ± autolog PBMC. IFN-γ var > 30-fold højere i kulturer der indeholder SBC'er, uanset forekomsten af PBMC.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Figur 4 : Cytokin niveauer i SB væske, plasma, og MTB -inficeret kultur supernatanter. (en) dette panel viser cytokin niveauer i SB væske analysere og plasma fra 6 BCG-vaccinerede frivillige. Søjlerne repræsenterer de mediane cytokin niveauer; fejllinjer udgør området. (b) dette panel viser cytokin niveauer i supernatanter fra 4 parallelle 600 µl ex vivo 4-dages kulturer af 1 x 106 PBMC (sorte bjælker), 1,75 x 105 SBC'er (hvid barer) og 1 x 106 PBMC tilsat enten 0,5 eller 1,75 x 10 5 SBC'er (grå søjler) inficeret med Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Her give vi en demonstration af suge blister kutane hjemkalde model. Modellen giver mulighed for en let adgang til at studere menneskets i vivo adaptive immunrespons, for eksempel i forbindelse med vaccine udvikling.

En suge Blister protokol at studere Human T-celle hjemkalde svar In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion af graft-versus-host sygdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell Monitoring Brug en MHC-matchet murin model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Anvendelse af fluorescerende Skud Arrays for Vurdering af T-celle respons<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation af Tail Hud til Study Allogen CD4 T-celle respons i mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluering af Zika Virus-specifikke T-celle respons i Immunoprivileged organer af inficerede Ifnar1- / - mus

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Optimeret Interferon-gamma ELISpot Assay til foranstaltning T-celle respons i Guinea Gris Model efter vaccinationen

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Brug af enkelt kæde MHC teknologi at undersøge Co-agonisme i menneskelige CD8 + T-celle aktivering

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...