Name: a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

ברצוננו להודות מאדס ג'נסן Radmer על עצתו מעשיות ואקדמיות; לאו Lindqvist, Kaare Svejstrup על מתן מומחיות טכנית; הלין Bæk Juel, ג'ונתן Filskov, Signe טי שמידט, Harpøth וו סולוויג לסיוע טכני שלהם; הצוות במרפאה אשפוז גנטופטה TB להכשרתם במנהל PPD; כל המתנדבים על השתתפותכם במחקר. הפרויקט ממומן על-ידי התוכנית H2020 הנציבות האירופית [גרנט מספר TBVAC2020 643381], ברצוננו להודות קונסורציום שותפים לדיונים פורה.

כל השיטות המתוארות להלן, לרבות השימוש מתנדבים אנושיים, אושרו על ידי ועדת דנית אתיקה במחקר בריאות (H-15002988) הסוכנות להגנת נתונים דנית (jr.nr. 2015-57-0102). PPD חייב להיות מוצר מוסמך מאושר לשימוש האדם וערך בתוך המינון הנכון המסופקים על ידי היצרן. כל סטייה המינון או המינהל לדרוש אישורים אתיים נוספים, מתנדבים חייב לתת הסכמה מדעת.
1. טוברקולין העור מבחן
<ol><li>להשיג מדעת בעל פה ובכתב של המתנדב. לפני הזריקה, ודא כי המתנדב מבינה ומקבל את ההליך כולל ההשפעות השליליות האפשריות. הערה: הכללה קריטריונים ספציפיים פרוטוקול זה הם גיל > 18 שנים חיסון ה-BCG מתועדת. הכללה קריטריונים עשויים להשתנות בהתאם שאלת המחקר (כלומר, קריטריון הכללה נוספת יכולה להיות הוכחה הבטחה למחיר חיובי).</li>
	<li>השתמש פתרון מוכנות של PPD לשימוש בני אדם [טוברקולין 20 יחידות (טו) /mL]. לחטא את כיסוי הגומי של הבקבוקון באמצעות ספוגית אלכוהול.</li>
	<li>להכין ההזרקה<ol>
<li>אתר ההזרקה בצד הגחוני של האמה המתנדב.</li>
		<li>הנח את כף היד על משטח רגיל ולבחור אזור בשליש העליון של האמה, כ 5-10 ס מ מפרק המרפק. הישאר ברורה של צלקות, ורידים או עור פגוע.</li>
		<li>לחטא את האזור בעזרת ספוגית אלכוהול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין הפתרון PPD<ol>
<li>השתמש 1 מ"ל סטרילי מזרק עם 27-30G/קצר (למשל, 12 מ מ) קבוע המחט.</li>
		<li>בעדינות לערבב, aspire 0.1 מ"ל של הפתרון PPD. ודא כי ישנם אין בועות גלוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הזרקת PPD intradermal הערה: שלב זה מתאר כיצד לבצע תצהיר PPD יחיד, אך מספר תצהירים של PPD בזרוע באותו אפשרית. עם זאת, זה עשוי לדרוש אישור מוסרי ספציפי.<ol>
<li>למתוח את העור, הצבע המחט בזווית של 5-15 מעלות על העור עם שפוע כלפי מעלה.</li>
		<li>הכנס את קצה המחט לתוך שכבת הדרמיס של העור וודא כי הטיפ הוא כמעט גלוי דרך האפידרמיס.</li>
		<li>לאט לאט מזריקים 0.1 מ"ל של פתרון PPD. הערה: אם מנוהל כראוי, קשריר חיוור של 6-10 מ מ תופיע באופן מיידי. קשריר נעלם לאחר כ 10 דקות.</li>
		<li>בעת ביצוע התצהירים שניים או יותר, המטרה עבור מרבית הפרדה (5-10 ס מ) של האתרים הזרקה תוך שמירה על. מרחק מן האזור במרפק ובשרש כף יד. הערה: זה מונע זרימה פוטנציאלי של התגובה במבחן העור, ומאפשרת המיקום ללא הפרעה של שני תאים היניקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הערכת תגובת העור - יום 3
<ol><li>לאחר 48-72 שעות, שימו לב לגודל תגובת העור. למדוד את induration (נפיחות), לא אריתמה (אודם) התגובה.</li>
	<li>ימשש את קשה נפיחות באמצעות האצבעות ולאחר מכן לסמן את הקצוות של induration באמצעות עט כדורי. להשתמש בסרגל כדי למדוד את הקוטר induration ורשום את התוצאה במ מ. הערה: קריאה של גודל induration עשוי להדריך את הבחירה של דיזה קוטר תא היניקה.</li>
</ol>3. שאיבה שלפוחית אינדוקציה - יום 7
<ol><li>להרכיב את יחידת שאיבה ההתקן. הערה: שאיבה ההתקן יחידות הינן משאבות ואקום עם לשכות המצורפת שלפוחית היניקה אינדוקציה. ההתקן המשמש בהפגנה זו מותאמות אישית שנעשו, אך יחידות שאיבה ההתקן הינם גם זמינים מסחרית. המשאבה צריכה להיות מתכווננת בטווח של-20 ל-40 kPa ולספק לחץ שלילי יציב ואמין. אישור מוסרי אזורית צריכה להתקבל לפני ביצוע ניסויים באמצעות שיטה זו.<ol>
<li>ראשית, הכינו תא היניקה על ידי הרכבת צלחת דיזה התחתון, את הצלחת חלון עם החדר, הצינור המחבר. לצרף את הצינור חיבור קאמרית בחוזקה משאבת ואקום. הערה: התאים צריך לכלול צלחת התחתון עם חור עבור אינדוקציה שלפוחית, אשר צריך להיות מתאים מגע עם העור האנושי, ואת צלחת העליון עם חלון, ומאפשר בקרה חזותי של הכוויה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע הקוטר דיזה אופטימלית של נחיר יחסית לגודל תגובת העור; ככל שגודל כגדולים, גדול יותר על הכוויה.</li>
	<li>לחטא את נחיר העור של המתנדב באמצעות מטליות אלכוהול.</li>
	<li>לצרף את התא שאיבה העור.<ol>
<li>ודא כי הזרוע המתנדב נח.</li>
		<li>ודא כי החור צלחת התחתון של התא היניקה ממוקם תגובת PPD כך שגלוי במרכז תגובת העור.</li>
		<li>לאבטח את החדר באופן רופף בעזרת רצועות: בעת לחץ שלילי, התא לדבוק לעור ולשמר את מעמדה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את ההתקן היניקה ולהתאים את הלחץ ל-20 kPa.</li>
	<li>לאחר 30 דקות, להגביר את הלחץ השלילי ל kPa--25.</li>
	<li>לאחר 60 דקות, להגביר עוד יותר את הלחץ השלילי ל-30 kPa.</li>
	<li>שמור את הלחץ ב-30 kPa עד שלפוחית גובשה במלואה. ודא הלחצים שלילי הניתנים פרוטוקול זה ספיציפית כלי מותאם אישית. יתכן צורך להתאים את הלחץ מעט כאשר מיישמים פרוטוקול הגדרות אחרות. הערה: שלב האינדוקציה שלפוחית נע בין 60 ל 180 דקות (1-3 h) עם היווצרות שלפוחית בפועל המתרחשים מינימלית 30 האחרון ש-blistering קשורה לעיתים קרובות עם תחושה מגרדת. השלפוחיות עלול להתרחש כמו שלפוחיות מיזוג בודדות או רבות. אם הקרע שלפוחית או דימום מתרחש, מומלץ לסיים את תנאי הגיוס שלפוחית על ידי לאט לשחרר את הלחץ.</li>
	<li>לאחר הכוויה גובשה במלואה, לשחרר את הלחץ, הסר בזהירות את התא שאיבה מן העור בלי לקרוע על הכוויה.</li>
	<li>החל ההלבשה רך על העור סביב האזור, למקם כובע קשה (למשל, של צינור פלסטיק 50 מל) מעל הכוויה.</li>
	<li>אבטח את הכובע עם הדבקה שאינם גורמים לאלרגיה, ואחריו תחבושת וגל רך.</li>
	<li>להורות המתנדב להימנע מאמץ פיזי מופרז על אזור שלפוחית עבור ה 12-24 הבא.</li>
</ol>4. הקציר של שלפוחית נוזל - יום 8
<ol><li>ביוםה 8, בעדינות להסיר את הרוטב מגן ולחטא את שלפוחית עם תרסיס חיטוי העור.</li>
	<li>השתמש מזרק סטרילי 2 מ"ל עם מחט 23 גרם לקצור את התוכן שלפוחית. את המחט לתוך הצד העליון/לרוחב של הגג שלפוחית, תשאף באיטיות את הנוזלים. להימנע מלגעת הרצפה של החלל אך הקפד לקצור את כל הנוזלים.</li>
	<li>החל ההלבשה על הכוויה התמוטט.</li>
	<li>להעביר את הנוזל שלפוחית צינור סטרילי. הערה את אמצעי האחסון.</li>
	<li>ספין שלפוחית נוזל למטה ב 600 g x באמצעות צנטריפוגה שולחן במשך 4 דקות.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור אחר, resuspend בגדר תא ב- 500 µL תא בינוני. הערה: התאים הם עכשיו מוכן לספור וניתוח נוסף. ניתן לאחסן supernatants ב-20 עד-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>5. ניתוח של שאיבה להמיס תאים ונוזלים
הערה: מתן הוראות לניתוח של תאים ונוזלים המתקבל שלפוחיות שאיבה העור אינו בתוך הטווח של פרוטוקול זה. עם זאת, על מנת לספק תוצאות נציג של דוח זה, הכתם תאיים לזרום cytometry, אולם קולנוע ניתוחים בוצעו. המתודולוגיה המתוארת בקצרה להלן.
<ol><li>Cytometry זרימה<ol>
<li>לעורר את המתלים של עונה 1 פרק 105 תאים טריים מבודד מן שלפוחיות שאיבה מן 1 חיסון ה-BCG מתנדבים עם 10 µg/mL של PPD, דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2- כוללים תאים unstimulated דגירה מקבילים.</li>
		<li>לעורר את המתלים עונה 1 פרק 106 PBMCs המתקבל 1 חיסון ה-BCG מתנדבים עם 10 µg/mL של PPD, דגירה התערובת-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2- כוללים תאים unstimulated דגירה מקבילים.</li>
		<li>לאחר 2 h, לטיפול כל התאים עם Brefaldin A ו- monensin, דגירה אותם עבור 6-אייץ '-37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>כתם התאים עם פאנל של חי/מת-כתם-BV510, אנטי-CD4-AF780, אנטי-CD3-BV421, אנטי-CD8-PerCP-Cy5.5, אנטי-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, אנטי-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 ו anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>לכלול FMO פקדים בחלונית ' PBMC '.</li>
		<li>ביצוע ניתוח cytometric זרימה עם cytometer זרימה ולנתח את התוצאות תוך שימוש בתוכנות הרלוונטיות.</li>
		<li>שער המייצרים ציטוקינים CD3 + CD4 + CD8-ערכות המשנה באמצעות האסטרטגיה המגביל הבאים: ללבישה - > CD3 קיימא + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + או -il-2 +.</li>
		<li>שער על אפקטור אוכלוסיות של תא זיכרון באמצעות האסטרטגיה המגביל הבאים: ללבישה - > CD3 קיימא + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>לחשב ציטוקין בודדים פרופילי משתמש gating בוליאני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפגנות שחרור ציטוקינים<ol>
<li>להדגמה של ציטוקינים שחרור ויוו, השתמש ניתוח מולטיפלקס לכמת את הרמות של il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 ו- IL-13 בנוזל שלפוחית היניקה המופשרים המתקבל 4 מתנדבים.</li>
		<li>עבור הפגנה של שחרור ציטוקינים על ידי תאים המתקבל שאיבה שלפוחיות vivo לשעבר, תאים שלפוחית היניקה טריים לשימוש, PBMCs המתקבל 1 מתנדבים חיסון ה-BCG.</li>
		<li>להדביק את PBMC יניקה תאים שלפוחית עם 100 המושבה יוצרי יחידות (CFU) של שחרור מהיר למוט אוכף H37Rv, דגירה אותם ארבעה ימים.</li>
		<li>השתמש ניתוח מולטיפלקס לכמת את הרמות של il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 ו- IL-יג כל תרבות supernatants.</li>
		<li>התאם את המידות מעל הטווח חישוב assay להגביל את חישוב העליון.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kiistala, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+blister+device+for+separation+of+viable+epidermis+from+dermis.">Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).</li><li>Akbar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+cutaneous+response+to+recall+antigen+in+humans+in+vivo.">Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).</li><li>Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blistering+time+as+a+parameter+for+the+strength+of+dermoepidermal+adhesion:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis.</a> British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).</li><li>Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suction+blister+model+reliably+assesses+skin+barrier+restoration+and+immune+response.">A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response.</a> Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).</li><li>Maranda, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+management+of+leukoderma+after+burn:+A+review.">Surgical management of leukoderma after burn: A review.</a> Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).</li><li>Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studiea.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Maini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Human+Neutrophils+Acquired+from+Four+Experimental+Models+of+Inflammation.">A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation.</a> PLoS ONE. 11 (10), (2016).</li><li>Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+blister+immunocytology.+A+new+method+to+quantify+cellular+kinetics+in+vivo.">Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo.</a> Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).</li><li>Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+suction+blistering+in+human+skin+using+optical+coherence+tomography.">Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).</li><li>Belson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+clinical+and+activated+T+cell+response+to+repeat+delayed-type+hypersensitivity+skin+challenges+in+human+subjects,+with+KLH+and+PPD,+as+a+potential+model+to+test+T+cell-targeted+therapies.">Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies.</a> Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans.">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li><li>Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+markers+and+correlates+of+protection+for+vaccine+induced+immune+responses.">Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses.</a> Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , (2018).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella+Zoster-Specific+CD4+Foxp3++T+Cells+Accumulate+after+Cutaneous+Antigen+Challenge+in+Humans.">Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans.</a> The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).</li><li>Reed, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+erosion+in+memory+T+cells+induced+by+telomerase+inhibition+at+the+site+of+antigenic+challenge+in+vivo.">Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).</li><li>Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-Needle+Aspiration+Biopsy+of+the+Lymph+Node:+A+Novel+Tool+for+the+Monitoring+of+Immune+Responses+after+Skin+Antigen+Delivery.">Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery.</a> The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).</li><li>Bond, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+infiltrate+the+skin+in+positive+tuberculin+skin+test+indurations.">Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).</li><li>Bell, L. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Molecular+Dissection+of+the+Effects+of+HIV-1+in+Active+Tuberculosis.">In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469 (2016).</li><li>Tomlinson, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+innate+and+adaptive+human+immune+responses+to+mycobacteria+in+the+tuberculin+skin+test.">Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test.</a> European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).</li><li>Nayak, S., Acharjya, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+test+and+its+interpretation.">Mantoux test and its interpretation.</a> Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans.">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li><li>Menzies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+Repeated+Tuberculin+Tests.">Interpretation of Repeated Tuberculin Tests.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).</li><li>Pitzalis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+migration+of+the+human+helper-inducer+memory+T+cell+subset:+confirmation+by+in+vivo+cellular+kinetic+studies.">Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies.</a> European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).</li><li>Kool, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+blister+fluid+as+potential+body+fluid+for+biomarker+proteins.">Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins.</a> Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).</li><li>Flynn, J. L., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+tuberculosis.">Immunology of tuberculosis.</a> Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).</li><li>Kagina, B. M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+T+cell+frequency+and+cytokine+expression+profile+do+not+correlate+with+protection+against+tuberculosis+after+bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+vaccination+of+newborns.">Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination of newborns.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).</li><li>Garc&#237;a-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+tuberculosis+vaccine+trials+under+financial+constraints.">Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).</li><li>Luabeya, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-human+trial+of+the+post-exposure+tuberculosis+vaccine+H56:IC31+in+Mycobacterium+tuberculosis+infected+and+non-infected+healthy+adults.">First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults.</a> Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).</li><li>Tameris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+TB+vaccine,+MVA85A,+induces+highly+durable+Th1+responses.">The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses.</a> PloS One. 9 (2), e87340 (2014).</li><li>Woodworth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+vaccine+H56/CAF01+induces+a+population+of+circulating+CD4+T+cells+that+traffic+into+the+Mycobacterium+tuberculosis-infected+lung.">Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung.</a> Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).</li><li>Gideon, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+tuberculosis+granuloma+T+cell+responses+exists,+but+a+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+is+associated+with+sterilization.">Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization.</a> PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).</li><li>Ruhwald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+the+C-Tb+skin+test+to+diagnose+Mycobacterium+tuberculosis+infection,+compared+with+an+interferon+&#947;+release+assay+and+the+tuberculin+skin+test:+a+phase+3,+double-blind,+randomised,+controlled+trial.">Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon &#947; release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+Isolation+from+Human+Skin+for+Phenotypic+Analysis+and+Ex+Vivo+Cell+Culture.">Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Koskela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blister+fluid+and+serum+cytokine+levels+in+severe+sepsis+in+humans+reflect+skin+dysfunction.">Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).</li><li>Wada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+skin+blister+fluids+from+children+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease.">Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease.</a> The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).</li><li>Andersson, C., Rajala, T., S&#228;rkk&#228;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+models+for+epidermal+nerve+fiber+data.">Hierarchical models for epidermal nerve fiber data.</a> Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).</li><li>Ramshanker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Prednisolone+on+Serum+and+Tissue+Fluid+IGF-I+Receptor+Activation+and+Post-Receptor+Signaling+in+Humans.">Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).</li><li>Bouma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL20+neutralization+by+a+monoclonal+antibody+in+healthy+subjects+selectively+inhibits+recruitment+of+CCR6++cells+in+an+experimental+suction+blister.">CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כתב יד זה מתאר הליך מעשית לצורך המחקר של זיכרון המערכת החיסונית האדם תגובות ויוו, באמצעות קציר האחזור של תאים אנטיגן עורית על ידי שאיבה שלפוחית אינדוקציה. הבטחה למחיר שימש דוגמה של אנטיגן intradermal התצהיר ואת האחזור חיסון ה-BCG. לבסוף, דוגמה של SB אפיון הדגימה על-ידי cytometric זרימה וניתוח ציטוקין מולטיפלקס היה בתנאי, הוכחת זה בערך שליש התאים SB היו אנטיגן ספציפי polyfunctional תאי-T של פנוטיפ זיכרון אפקטור.
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים את טכניקת ההזרקה intradermal, אינדוקציה שלפוחית היניקה את הניקוב שלפוחית. ראשית, תצהיר intradermal נכונה דורשת צוות מיומן. התצהיר שגוי יכול להוביל לתוצאות שיוצרת. PPD בדרך כלל אנטיגן עורית ידועה ובטוחה, אך הקומפוזיציה שלה עשויים להשתנות בין היצרנים, הגבלת comparability13,20. דוח זה מספק הנחיות תצהיר intradermal יחיד של 2 TU, ואת התצהירים במקביל שני אופציונלי (TU 2 x 2), אשר עשויים לחייב אישור אתיים נוספים. עם זאת, מחקרים אחרים השתמשו 10 TU, אשר מגבירים את הסבירות של העור חזק תגובה10,21. במהלך השלב אינדוקציה SB, העלאות stepwise קטן הלחץ השלילי תפחית את הסיכון של דימום, שלפוחית קרע. הסיכויים של זיהום עם כדוריות דם אדומות או leucocytes מזרם הדם הם בדרך כלל נמוך2. הטכניקה aseptic לנקב מניעת זיהום מיקרוביאלי, נמנע מקשר בין המחט לנקב את הרצפה שלפוחית עורי ומפחיתה זיהומים של פסולת או תאי העור תושב. עם זאת, יש חוקרים מעדיפים הקציר SB נוזל על-ידי החלת שלפוחית מנוקבת10לחץ מתגלגל. יתכן צורך לנקב את septa בתוך הכוויה. הטכניקה SB עצמה היא פולשנית; SBs התמוטט לרפא ללא צלקות, זיהומים הם נדירים מאוד. 2 . אולם, מידה מסוימת של היפו פיגמנטציה עלולה להתרחש, SB אינדוקציה להימנע ככל הנראה אצל אנשים עם היסטוריה של הצטלקות קולואיד.
מגבלות טכניות התשואות בתא סכום נמוך וכוללים אפשרויות מוגבלות כתוצאה מכך לאחסון לטווח ארוך. קשרי הגומלין בין התשואה leucocyte, הבטחה למחיר לתגובות הקליניות, שלפוחית בגודל כדוריות דם אדומות זיהום כבר תיארה היטב במקום אחר2,10. בניסויים BCG-החזרה המובאת כאן (איור 1), התשואה הכולל החציוני של כל שלפוחית היה 50,000, רומז מלכודת הניסוי בקנה מידה קטן באמצעות תאים אלה, במיוחד אם SBCs למד לבד15. עם זאת, האוכלוסייה תא T ספציפי דוגמה SB חורג בעיקר מה נמצא בדגימות PBMC ב נחשב תא יחסיים ומוחלטים. בדוגמה המוצג באיור2, מספר התאים טריפל-חיוביות PPD ספציפיים T-דגימה של תאים SB 100,000 היו יותר מ 2 x גדול מקו מספר שנמצא ב 1 x 106 PBMCs אותו התורם (נתונים לא מוצג). הבקיע חזותי של התגובה הבטחה למחיר הוא השיטה הנפוצה ביותר קליני על ההערכה של זיכרון מ. שחפת . ראוי לציין, התגובה חיסונית אדפטיבית הבסיסית לא לשיא באותו זמן כמו עור קליני תגובה2,21. לא כל ה-BCG-חוסנו או שחרור מהיר למוט אוכף-הנדבקים יפתחו תגובות הבטחה למחיר וחזק אסטרטגיות עבור סיווג וטיפול דגימות ללא הבטחה למחיר המגיבים, כמו גם רגישות עולה mycobacterial שישנו באוכלוסיית המחקר, צריך לקחת בחשבון לפני ביצוע ניסוי האחזור בשיטה זו. בנוסף, SB דגימה והן הבקיע חזותי, יש פוטנציאל דעה קדומה תיאורטי אצל אנשים עם תגובות העור מופחת עקב הכללית או הקשורות העור חסינות כפי שניתן לראות, למשל, הידבקות ב- HIV ו בקבוצות גיל מסוימות2, 13,18,20. בנוסף, לחיזוק אימונולוגי התגובה הבטחה למחיר עם בדיקות חוזרות ונשנות הוא ידוע20,22. עם זאת, הפנוטיפים תא SB להישאר קבוע למדי כאשר TSTs הם חוזרים ונשנים10. התבוננות זו תומכת את התפקיד של SB להיזכר במחקרים האורך של תגובות חיסוניות הסלולר.
עבור immunologists T-cell, SB האחזור מאפשר היבול של שברים גבוהה של תאים אנטיגן ספציפי. אולם, העיתוי של SB עבור דגימה מן תצהיר PPD חיוני כמו הרכב הסלולר והן את microenvironment ציטוקין להשתנות עם הזמן. ב פרוטוקול זה, שלפוחיות היו המושרה 7 ימים שלאחר אתגר והתאים מבודד היו בעיקר CD4 + אפקטור זיכרון תאי T-כולל שברים גבוהה של תאים עם ביטוי משותף של IFN-γ, TNF-α ו- il-2. תצפיות אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים המתארת כיצד הפעלת T-cell, התפשטות, בידול מתרחש העור PPD-איפה זה מונח2,15,21. קינטי SB אצל אנשים רגיש-PPD שסיקור זה התגובה העור מוקדם מאוד לא ספציפי; עם זאת, כבר בתוך הימים הראשונים שלאחר PPD-האתגר, התגובה הופך להיות נשלט על ידי CD4 + T תאים (שני פנוטיפים הזיכרון המרכזי של זיכרון ו אפקטור שהיית המתוארת), לאחר 3 ימים, התגובה נשלטת על ידי שברים גבוה של ציטוקין PPD ספציפיים בייצור תאי CD4 + T2,8,10,15,21. תגובה זו ציטוקין מסתגלת נשאר גלוי, לגלוי עבור יותר מ 2 שבועות2,8,10,23. יום 7 פוסט-הבטחה למחיר נראה נקודת הזמן האופטימלי ביותר של האוסף של ציטוקין לייצר תאי-T זיכרון CD4 +2. עם זאת, נקודות זמן אחרות, כמובן, ייתכן הרלוונטי בהתאם אנטיגן התגובה של עניין. ראוי לציין, במחקר אחד, התגובה PPD מסתגלת דווח שיאי קצת יותר מוקדם עם ירידה הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים כבר בגיל 5 ימים פוסט-הבטחה למחיר10.
SB נוזל מכיל רמות גבוהות של ציטוקינים פרו-דלקתיים והן לחלבונים אחרים הוכח להיות נציג של העור microenvironment15,24. קינטיקה מחקרים הראו כי TNF-α ו- IFN-γ רמות שיא נוזלים SB לאחר 3 ימים בזמן il-2 רמות שיא לאחר 7 ימים2,10, כנראה המשקף את הדומיננטיות של תגובות מסתגלת בשלב מאוחר יותר. כי תאים SB היה מופעל ויוו, שהם מייצגים את שחרור ציטוקינים ספונטנית גבוהה, כמו גם אפשרות של שחרור מסוים על לרסטימולציה (איור 3 ו- 4).
דו ח זה מתמקד CD4 + T-cell חסינות. כפי שהוכח באיור2, הרוב המכריע של תאי-T מבודד היו אכן CD4 +, אף שלא היו כמעט אין CD8 + תאי-T בהיניקה שיהיו שלפוחיות נוזל. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים SB PPD-החזרה דיווח על הפרופורציות נמוך קיבולת נודדות נחות של CD8 + T תאים בהשוואה CD4 + T תאים2,8,10,23. אפיון נוסף של התרומה CD8 + עדיף; עם זאת, זה מעבר להיקף של דו ח זה.
תאי-T נחשבים חיוניים עבור הפקד המערכת החיסונית של Mtb; עם זאת, מתקשים לזהות לתאם אמין של ההגנה משתקפת תגובה חיסונית אדפטיבית מ25,דם26. המחסום הזה קשות מעכבת את התפתחות חיסונים טרה-בתים חדשים, כמו שיש כיום אין אלטרנטיבה גדולות ויקרות מאוד יעילות בניסויים27. מפתחים חיסון נגד שחפת לקבוע immunogenicity חיסון על ידי הערכת שינויים קטנים וחולף על האוכלוסיות T-cell חיסון ספציפיים28,הדם29. אולם, זה בספק אם השבר קטן של מחזורי T אנטיגן ספציפי-נמצאו בדם תאים רלוונטי (כלומר, יכולת המעבר לאתר של זיהום ושל נציג השליטה microenvironment T-תא-עשיר שחרור מהיר למוט אוכף) 27 , 30 , 31 .
בהתבסס על מחקרים קודמים, הנתונים המוצגים במסמך זה, המודל האחזור עורית SB מייצג פוטנציאל לא ממומש לחקר תאי-T החיסון הספציפי. לא רק הדגם מאפשרת החזרה של החיסון התגובה שנוצר לפני עשרות שנים, הוא גם מאפשר את ההערכה של הזיכרון האמיתי פוטנציאלית רקמות ספציפיות בהקשר15,18,19,21. הרומן, בדיקות עור ספציפי, אשר כוללים אנטיגנים גם מורכבת של המועמד חיסונים טרה-בתים, מציע הזדמנויות חדשות להערכת החיסון באמצעות28,זה דגם32. יתר על כן, ניתוח transcriptomic מציע כי התא – mediated החיסון לתגובה שנוצר בעור תיגר PPD דומה על התגובה שנמצאו על שחרור מהיר למוט אוכף-נגוע ריאות18.
בזמן ביופסיות ניקוב העור גם לאפשר לקציר תא מן העור ולספק מידע מרחבי, לעומת דגימה SB, השיטה הוא פולשניים יותר ודורש עיבוד אנזימטי או מכונאי להכין תא בודד המתלים33. מדידות של ציטוקינים והתא סמנים דומים בין שתי שיטות ה-2,10.
שיטת השאיבה שלפוחית כבר הוחל בתחומים רבים של מחקר רפואי חוץ דרמטולוגיה, לבד או בשילוב עם אתגר עור מערכתית או מקומיים. דוגמאות כוללות לימודי של אלח דם, lymphoproliferative וירוס אפשטיין בר-הקשורים למחלה, נוירופתיה סוכרתית, אפקטים צריכת glucocorticoid בניסויים בבני אדם, בדיקות נוגדנים טיפולית או מודלים עבור טיפולים T-תא-ממוקד10 ,34,35,36,37,38.
מנקודת מבט טיפולית, השיטה האחזור עורית SB מציע יתרונות ייחודיים ללמוד את הזיכרון T-cell מרכזי פוטנציאלי ומ שני ביולוגית וטכני מנקודת מבט-לעור נראה לספק תא הדגימה רלוונטי2, 15,18,19,21. בפרט, לעומת דגימה מסורתי, פסיבי של מחזורי PBMCs, שיטת האחזור עורית SB מאפשרת לחקר תאי-T אשר הוכיחו את היכולת להעביר מן הצומת לימפה בתגובה אנטיגן הרלוונטיות שלהם, ולהשלים המקומי הרחבת ובידול רקמות ספציפיות ויוו ההקשר15,18,19,21.
לסיכום, המודל הפגינו כאן יכול להיות רלוונטי עבור חוקרים בתחום האנושי חסינות מסתגלת וסוכנים T-cell מיקוד (קרי, במחקר vaccinology או סרטן מחלות זיהומיות). המודל הבטחה למחיר יושמו פרוטוקול זה הוא, כמובן, רלוונטי בתחום של vaccinology טרה-בתים. אולם, התפיסה הבסיסית של מודל זה הוא מאוד רלוונטי בתחומים אחרים של מחקר.

SB העור היא שלפוחית המושרה באופן מלאכותי, המאפשר היבול של תאים ונוזלים ישירות מן העור. הטכניקה של העלאת SBs על ידי ואקום הוא כלי ידוע בתחום רפואת עור משמש לחקר העור אימונולוגיה מחלה ובריאות1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. דו ח זה מדגים איך הטכניקה SB בשילוב עם החזרה antigenic עורית (שיטת האחזור עורית SB) יכול לספק תובנות ישירה תגובות מערכת החיסון מסתגלת vivo בתוך.
העיקרון מאחורי אינדוקציה SB הוא פשוט: שואב אור מוחל על שטח קטן של העור. בסופו של דבר, הלחץ השלילי יהיה כוח האפידרמיס להפריד הדרמיס, יצירת שלפוחית מקומי מלא נוזל ותאים1,2,9. ניתן לקצור את הנוזלים שלפוחית על ידי דיקור בסדר, התוכן יכול לשמש עבור נוסף במחקר במבחנה.
בשנים האחרונות חלה עניין גדל והולך בשיטת SB לחקר ויוו תגובות חיסוניות מלבד מחלות מוגבל ל-10,העור11. המחקר של החסינות מסתגלת בבני אדם מוגבל על ידי העובדה כי התאים ואת ציטוקינים עניין הם שנדגמו מדם היקפי מכיוון הדגימה פולשנית של הצומת לימפה או רקמות mucosal במערכת העיכול עלולים להיות לא מקובל ולא מוסרי. דוגמה לכך היא המחקר של הזיכרון האנושי מאריכים T-cell תגובות אחרי חיסון12. בניסויים כאלה, הדוגמאות של תאי-T רלוונטי יכול להיות אתגר גדול, כי האוכלוסייה הרלוונטית של תאים המתווכות את חסינות שוכן רקמת הלימפה, רק מספר מצומצם מאוד של תאי-T ספציפי במחזור הדם ההיקפיים.
הטכניקה SB מציע הזדמנות ייחודית ללימוד זיכרון תאי-T אחרים אוכלוסיות תאים מסוים. בעקבות חיסון עורית של אנטיגן, תאי-T ספציפי עבור אנטיגן הם גויסו מסתור הלימפה שלהם על העור, ניתן לטעום מן SB בקלות. היישומים מתודולוגיה ומחקר של מודל זה האחזור עורית שתוארו על-ידי אכבר. et al. 20132. אנטיגן נפוץ עבור העור זוכר היא הנגזרת חלבון מטוהרים זמינים מסחרית (PPD) של mycobacteria המשמש לביצוע בדיקת העור (הבטחה למחיר) טוברקולין13, איפה PPD מוזרק לתוך שכבת הדרמיס של העור. אצל אנשים עם זיכרון אימונולוגי הקיימת כלפי PPD [למשל, אנשים עם זיהום שחפת Mycobacterium (Mtb) או חיסון Bacillus Calmette-Guérin (BCG) מוקדמת], התצהיר אנטיגן תוצאות זוכר תגובה עם ההעברה לעור ואת ויוו המשובטים הרחבה של תאי CD4 + T-PPD ספציפיים2,11,14,15. כתוצאה מכך, שברים גבוה של polyfunctional ספציפיים PPD CD4 + T-תאים להצטבר בעור מוכן לדיגום SB. תאי-T שנאספו על ידי שיטה זו הוכיחו להיות חזקים, שופע מספיק כדי להיות מאופיין על ידי מגוון של immunoassays ועל ידי לטווח ארוך in vitro לקשרי תרבות15. לפיכך, המודל האחזור עורית ומעגל SB יוכיח שיטה יקר ללמוד ויוו T-cell תגובות על ידי ניתוחים ex-vivo , ידע מוגברת של גישה זו עשויים להפיק תועלת חוקרים עם אינטרסים אימונולוגיה תאית vaccinology.
דוח זה מספק המדריך stepwise הראשון על איך לגרום העור האנושי היניקה שלפוחיות בעור המוזרק PPD. המודל האחזור אנטיגן עורית הוכח באמצעות הבטחה למחיר של מתנדבים חיסון ה-BCG. לבסוף, הניתוח רלוונטי ex-vivo של תאים מבודדים מאת SB ציטוקינים היא ביטוי. מאפייני PPD ספציפי-תאי T מתקבל על ידי שיטת SB פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי הן ביסודיות תיאר במקום אחר2,10,11,16,17, 18 , 19. דו ח זה נועד לדון בהיבטים מעשיים אימונולוגי של המתודולוגיה כדי להקל על היישום של טכניקה זו על ידי קבוצות מחקר נוספות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

אנטיגן עורית-החזרה דגמים מאפשרים מחקרים של הזיכרון האנושי תגובות ב vivo. בשילוב עם העור היניקה שלפוחית (SB) אינדוקציה, מודל זה מציע נגישות לאוכלוסיות נדיר של נציג תאי-T אנטיגן ספציפי של התגובה התאית זיכרון וכן את ציטוקינים microenvironment בחיי עיר.
דו ח זה מתאר את התהליך המעשי של החזרה עורית, אינדוקציה של SB הקציר של תאי-T אנטיגן ספציפי. לצורך המחשה בשיטת, הבדיקה העור טוברקולין משמש האחזור antigenic אצל אנשים שעברו, טרם במחקר זה, חיסון Bacillus Calmette-Guérin נגד זיהום עם שחפת Mycobacterium. לבסוף, דוגמאות של ניתוחים cytometric מולטיפלקס וזרימה של SB דגימות הינם מסופקים, הממחישות שברים גבוה של אנטיגן ספציפי polyfunctional CD4 + T תאים זמינים על ידי שיטה זו הדגימה לעומת תאים מבודדים ממחזור הדם.
השיטה המתוארת כאן היא בטוחה ולא פולשנית, מספק הזדמנות ייחודית ללמוד שתי תגובות מערכת החיסון מולדים, מסתגלת ויוו, עשוי להיות מועיל קהילה רחבה של החוקרים עובדים עם חסינות תאית, אדם תגובות זיכרון, בהקשר של פיתוח החיסון.

שמונה מתנדבים מבוגרים בריאים (הגיל החציוני: 30 שנים, טווח: 26-43 שנים) עם חיסון BCG קודמת מתועדת (הזמן החציוני של חיסון BCG: 5.5 שנים, טווח: 1-30 שנים) לא היו כלולים. המשתתפים היו אתגר intradermally TU 2 של PPD ואחריו הערכה הבטחה למחיר ביום 3. SBs היו המושרה ביום 7 וקצרו ביום 8, שלפוחיות כל גדלו באמצעות יניקה שלפוחית צ'יימברס עם קטרים דיזה 10 מ מ. שבעה אנשים ניתנו 2 ההזרקות PPD נפרד בו זמנית ביד אותו ואחריו inductions 2 SB מקבילים (עיין הערה לגבי מספר תצהירים PPD מתחת צעד 1.4 פרוטוקול). דם היקפיים נמשך ביום 7 עבור פלזמה ובידוד PBMCs על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. Supernatants פלזמה ונוזלים תי אוחסנו ב-20 ° C. SB טריים תאים (SBCs) נספרו nigrosine הכתם באמצעות מיקרוסקופ.
הבטחה למחיר לתגובות הקליניות של SBC התשואה מוצגים באיור1. לגודל indurations הבטחה למחיר החציוני היה 10.25 מ מ (טווח: 0 - 20 מ מ) והיה מספר התא החציוני לכל שלפוחית 50,000 (טווח: 15,000-210,000 תאים, מספר יבלות: 15). שני המתנדבים היו ללא תגובה קלינית באחת TSTs 2, תשואה נמוכה בתא סכום המקביל של תאים 15,000/שלפוחית. התשואה תא היה קשור עם התגובה הקלינית אכזרי של הבטחה למחיר (של ספירמן r = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> איור 1 : שאיבה שלפוחית תא התשואה. () לוח זה מציג נציג מיקרוסקופיה של תאים שהוכתמו nigrosine מבודד SBs גידלה 7 ימים פוסט-הבטחה למחיר. (b) לוח זה מציג קשרי הגומלין בין את induration הבטחה למחיר הממוצע (מ מ) את התשואה תא רשע (n/blister) 8 מתנדבים חיסון ה-BCG (מספר של שלפוחיות = 15). הנקודות מייצגות מדידות מרושע. אנא שימו לב כי 2 נקודות חופפות 2 מתנדבים שני היה induration הבטחה למחיר של 0 מ מ ותשואה תא של 15,000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כדי להדגים את האפיון cytometric SB זרימה, התקבלו SBCs מתנדב בת 43 שהיו חיסון ה-BCG 30 שנה קודם לכן, אין חשיפה מוכרות Mtb. SBCs שהיו מבודדים בעקבות של אינדוקציה של (שלפוחית יחיד induration: 1.4 בקרי גבול הפעלה מ מ/100,000). איור 2 מציג את הנציגה חלקות ההכתמה ציטוקין תאיים של בקרי גבול הפעלה לעומת PBMCs.
המתנדב הזה, השבר של CD3 + CD4 + CD8-SBCs גדל מ- 67% בתאים unstimulated > 90% על PPD במבחנה לרסטימולציה, ואילו השבר של CD3 + CD4 + CD8-PBMCs נשאר קבוע (~ 51%, איור 2). מעל 92% של ה- in vitro לקשרי PPD-, כמו גם את unstimulated CD3 + CD4 + CD8-בקרי גבול הפעלה, היו סוג זיכרון אפקטור (CCR7 - CD45RA-, נתונים לא מוצג). שברים הכולל של תאי-CD3 + CD4 + CD8 ספציפי המושרה על ידי גירוי PPD היו גבוהים יותר SBCs בהשוואה את PBMCs (33.1 vs. 0.2%, דוגמאות unstimulated המופחת). PBMCs, היו השברים של polyfunctional תאי-CD3 + CD4 + CD8 PPD ספציפיים כל < 0.05%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> איור 2 : חלקות cytometry זרימה נציג של בקרי גבול הפעלה לעומת PBMCs. לוחות ו b הצג נציג צפיפות מגרשים לאוכלוסיות CD8 + ו CD4 + ב () unstimulated vs. מגורה-PPD PBMCs, (ג) SBCs. לוחות b ו- d לאט מתווה של ציטוקין תאיים צביעת תאי CD3 + CD4 + CD8 מגורה-PPD עבור (b) PBMCs, (ד) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול יותר הגירסה של הדמות הזו.</a>
כצפוי, CD3 + CD4 + CD8-SBCs היו מופעל ויוו, מאויר על ידי שיעור גבוה של תאי צביעת עבור ציטוקינים upregulated (12%), עם ציטוקינים השולט TNF-α ו IFN-γ. עם זאת, בעת PPD-גירוי, ציטוקין הפרשת תאי העביר לכיוון משולש - או כפול-חיובי IFN-γ + TNF-α + IL-2 + (17%) ו IFN-γ + TNF-α + (15%) פרופיל (איור 3b, פרופילים PBMC מהתורם באותו כלולים עבור השוואה ב- איור 3 א). פרופילי ביטוי ציטוקינים אפקטור מגורה-PPD זיכרון CD4 + T-cell קבוצות משנה (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) היו דומות באוכלוסייה-CD3 + CD4 + CD8 הציג דמויות 2 ו- 3 (נתונים לא מוצג).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> איור 3: ציטוקין פרופילים עבור בקרי גבול הפעלה מגורה-PPD CD4 +, unstimulated לעומת PBMCs.  מראות אלה בודדים פרופילים לייצור ציטוקינים () PBMCs-CD3 + CD4 + CD8 תאים ו- (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. הסורגים המייצגים שברים של פרופילים ציטוקין אנטיגן ספציפי בתאים unstimulated (ברים לבן) ועל של גירוי במבחנה עם PPD (ברים צבעוניים).
על מנת לחקור את הנוזלים SB כמקור מידע על microenvironment ציטוקין באתר של בדיקת העור, נמדדו רמות ציטוקינים בנוזל שנקטפו SBs המושרה 7 ימים פוסט-הבטחה למחיר (איור 4a). רמות החציוני של IFN-γ, TNF-α ו- il-2 היו 339 pg/mL, 19 pg/mL, ו 1 pg/mL, בהתאמה (n = 6). רמות פלזמה היו בדרך כלל נמוך מאוד. תאים מבודד SBs מיוצרים רמות גבוהות של ציטוקינים פרו-דלקתיים ex-vivo (איור 4b). Titrations של SBCs מ 1 מתנדבים היו תרבותי ארבעה ימים בנוכחות מידבק מ. שחפת ± PBMCs עצמיים. רמות IFN-γ היו > 30-fold גבוה יותר בתרבויות המכיל בקרי גבול הפעלה, ללא התחשבות הנוכחות של PBMCs.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> איור 4 : רמות ציטוקינים בנוזל SB, פלזמה, ו שחרור מהיר למוט אוכף -נגוע התרבות supernatants. () לוח זה מציג רמות ציטוקינים supernatants נוזלים SB ו פלזמה 6 מתנדבים חיסון ה-BCG. העמודות מסמנות את רמות ציטוקינים החציוני; קווי השגיאה מייצגים את הטווח. (b) לוח זה מציג רמות ציטוקינים supernatants מתרבויות 4 במקביל 600 µl ex-vivo 4 ימים של עונה 1 פרק 106 PBMCs (קווים שחורים), 1.75 x 105 בקרי גבול הפעלה (ברים לבן), עונה 1 פרק 106 PBMCs, מתובל או 0.5 או 1.75 x 10 5 SBCs (ברים אפור) נגוע Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

כאן, אנו מספקים הפגנה של המודל האחזור עורית שלפוחית היניקה. המודל מאפשר גישה פשוטה ללמוד האנושי ויוו מסתגלת תגובות מערכת החיסון, למשל בהקשר של פיתוח החיסון.

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...