Name: a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Mads Radmer Jensen per i suoi consigli pratici e accademici; Lau Lindqvist e Kaare Svejstrup per consulenza tecnica; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt e Solveig W. Harpøth per la loro assistenza tecnica; il personale presso l'ambulatorio di Gentofte TB per la loro formazione in amministrazione PPD; e tutti i volontari per la partecipazione allo studio. Questo progetto è finanziato dal programma europeo Commissione H2020 [concessione numero TBVAC2020 643381], e vorremmo ringraziare i partner del Consorzio per le discussioni fruttuose.

Tutti i metodi descritti di seguito, compreso l'uso di volontari umani, sono stati approvati dal Comitato Danese Health Research Ethics (H-15002988) e l'Agenzia danese per la protezione dei dati (jr.nr. 2015-57-0102). PPD deve essere un prodotto certificato approvato per uso umano e somministrato entro il dosaggio corretto fornito dal produttore. Qualsiasi deviazione nel dosaggio o amministrazione può richiedere ulteriori approvazioni etiche e volontari devono dare il consenso informato.
1. pelle della tubercolina
<ol><li>Ottenere il consenso informato scritto e orale da volontario. Prima dell'iniezione, assicurarsi che il volontario capisce e accetta la procedura inclusi i possibili effetti negativi. Nota: Criteri di inclusione specifici di questo protocollo sono età > 18 anni e una documentata vaccinazione di BCG. Criteri di inclusione possono variare a seconda della domanda di ricerca (cioè, un criterio di inclusione aggiuntiva potrebbe essere la prova di TST positivo).</li>
	<li>Utilizzare una soluzione già pronta di PPD per uso umano [20 unità (TU) di tubercolina /mL]. Disinfettare il tappo di gomma del flaconcino utilizzando un tampone imbevuto di alcool.</li>
	<li>Preparare il sito di iniezione<ol>
<li>Individuare il sito di iniezione sul lato ventrale dell'avambraccio del volontario.</li>
		<li>Posizionare il braccio palm-up su una superficie piana e scegliere un'area sul terzo superiore dell'avambraccio, circa 5-10 cm dal giunto del gomito. Soggiorno chiaro di cicatrici, vene o pelle danneggiata.</li>
		<li>Disinfettare la zona utilizzando un tampone alcolico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione di PPD<ol>
<li>Utilizzare una siringa da 1 mL sterile con un 27-30G/breve (ad esempio, 12 mm) fissata dell'ago.</li>
		<li>Delicatamente mescolare e aspire 0,1 mL della soluzione di PPD. Assicurarsi che non vi siano nessun bolle visibile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniezione intradermica di PPD Nota: Questo passaggio viene descritto come eseguire una singola deposizione di PPD, ma più deposizioni di PPD nel braccio stesso è possibile. Tuttavia, questo può richiedere specifica approvazione etica.<ol>
<li>Tendere la pelle e scegliere l'ago con un angolo di 5-15° la pelle con lo smusso rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Inserire la punta dell'ago nello strato dermico della pelle e assicurarsi che la punta è quasi visibile attraverso l'epidermide.</li>
		<li>Iniettare lentamente 0,1 mL di soluzione PPD. Nota: Se somministrato correttamente, verrà visualizzato immediatamente una papula pallida di 6-10 mm. La papula scomparirà dopo circa 10 min.</li>
		<li>Quando si effettuano due o più deposizioni, obiettivo per una massima separazione (5-10 cm) i siti di iniezione, mantenendo in una buona distanza dalla zona di gomito e polso. Nota: Questo impedisce una potenziale confluenza della risposta test cutaneo e permette il posizionamento ininterrotto di due alloggiamenti di aspirazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. valutazione della reazione della pelle - giorno 3
<ol><li>Dopo 48-72 h, notare le dimensioni della reazione della pelle. Misurare l'indurimento (il gonfiore) e non l'eritema (il rossore) della reazione.</li>
	<li>Palpare il duro gonfiore usando le dita e quindi contrassegnare i bordi dell'indurimento utilizzando una penna a sfera. Usare un righello per misurare il diametro di indurimento e annotare il risultato in millimetri. Nota: Una lettura della dimensione indurimento può guidare la scelta del diametro dell'orifizio per la camera di aspirazione.</li>
</ol>3. aspirazione Blister induzione - giorno 7
<ol><li>Montare l'unità di dispositivo di aspirazione. Nota: Unità di dispositivo di aspirazione sono pompe per vuoto con annesso chambers per induzione aspirazione blister. Il dispositivo utilizzato in questa dimostrazione è personalizzato, ma unità di dispositivo di aspirazione sono anche disponibili in commercio. La pompa deve essere regolabile all'interno della gamma da-20 a-40 kPa e fornire una pressione negativa costante e affidabile. Approvazione etica regionale deve essere ottenuto prima conducendo esperimenti utilizzando questo metodo.<ol>
<li>In primo luogo, preparare la camera di aspirazione assemblando la piastra di orifizio inferiore e la finestra con la camera e il tubo di collegamento. Collegare il tubo di collegamento camera strettamente alla pompa del vuoto. Nota: Le camere dovrebbero includere una piastra inferiore con un foro per l'induzione della bolla, che dovrebbe essere adatto al contatto con la pelle umana, e una piastra superiore con una finestra, consentendo il monitoraggio visivo del blister.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare il diametro dell'orifizio ottimale il diaframma rispetto alle dimensioni della reazione della pelle; maggiori sono le dimensioni dell'orifizio, la più grande bolla.</li>
	<li>Disinfettare il diaframma e la pelle del volontario utilizzando tamponi imbevuti di alcool.</li>
	<li>Fissare la camera di aspirazione per la pelle.<ol>
<li>Assicurarsi che il braccio del volontario sta riposando tranquillamente.</li>
		<li>Assicurarsi che il foro nella piastra di fondo della camera di aspirazione è situato sopra la reazione di PPD affinché il centro della reazione della pelle è visibile.</li>
		<li>Fissare la camera senza bloccare usando cinghie: quando viene applicata pressione negativa, la camera di aderire alla pelle e mantenere la sua posizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Accendere il dispositivo di aspirazione e regolare la pressione di-20 kPa.</li>
	<li>Dopo 30 min, aumentare la pressione negativa di-25 kPa.</li>
	<li>Dopo 60 min, aumentare ulteriormente la pressione negativa di-30 kPa.</li>
	<li>Mantenere la pressione a-30 kPa fino a quando un blister è completamente formato. Garantire che le pressioni negative fornite in questo protocollo sono specifiche per uno strumento personalizzato. Può essere necessario regolare la pressione leggermente quando si applica il protocollo in altre impostazioni. Nota: La fase di induzione della bolla varia da 60 a 180 min (1-3 h) con la formazione di effettivo della bolla che si verificano entro gli ultimi 30 min che rigonfiamento è spesso associata a una sensazione di prurito. Le bolle possono verificarsi come bolle di fusione singole o multipla. Se la rottura della bolla o l'emorragia si verifica, si consiglia di terminare l'induzione della bolla rilasciando lentamente la pressione.</li>
	<li>Dopo il blister è completamente formato, rilasciare la pressione e rimuovere accuratamente la camera di aspirazione dalla pelle senza rompersi il blister.</li>
	<li>Applicare una medicazione morbida sulla zona di pelle circostante e mettere un cappello rigido (ad esempio, da un tubo di plastica da 50 mL) sopra il blister.</li>
	<li>Fissare il tappo con nastro chirurgico anallergici, seguita da un bendaggio elastico morbido.</li>
	<li>Istruire il volontario per evitare l'eccessivo sforzo fisico sulla zona della bolla per il prossimo 12-24h.</li>
</ol>4. raccolta del liquido della bolla - giorno 8
<ol><li>L'8° giorno, delicatamente rimuovere la medicazione protettiva e disinfettare il blister con spray di disinfezione della pelle.</li>
	<li>Utilizzare una siringa sterile da 2 mL con un ago di 23G per raccogliere il contenuto della bolla. Inserire l'ago nel lato superiore e laterale del tetto della bolla ed aspirare lentamente il liquido. Evitare di toccare il pavimento della cavità, ma assicuratevi di raccogliere tutto il liquido.</li>
	<li>Applicare una medicazione sul blister compresse.</li>
	<li>Trasferire il liquido della bolla in una provetta sterile. Nota il volume.</li>
	<li>Girare il liquido della bolla giù a 600 x g usando una centrifuga da tavolo per 4 min.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in un'altra provetta e risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di terreno cellulare. Nota: Le cellule sono ora pronte per il conteggio e ulteriori analisi. Surnatanti possono essere conservati a -20 a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>5. analisi di aspirazione Blister cellule e fluidi
Nota: Con le istruzioni necessarie per l'analisi delle cellule e il liquido ottenuto da aspirazione bolle della pelle non è nell'ambito del presente protocollo. Tuttavia, al fine di fornire risultati rappresentativi per la presente relazione, macchia intracellulare flusso cytometry e multisala analisi sono state eseguite. La metodologia è descritta in breve qui di seguito.
<ol><li>Citometria a flusso<ol>
<li>Stimolare le sospensioni di cellule fresche di 1 x 105 isolate da aspirazione blister da 1 volontario di BCG vaccinati con 10 µ g/mL di PPD e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO2. Sono cellule non stimolate per un'incubazione di parallela.</li>
		<li>Stimolare sospensioni 1 x 106 PBMCs ottenuti da 1 volontario di BCG vaccinati con 10 µ g/mL di PPD e incubare la miscela a 37 ° C e 5% CO2. Sono cellule non stimolate per un'incubazione di parallela.</li>
		<li>Dopo 2 h, trattare tutte le celle con Brefaldin A e monensin e li Incubare per 6 h a 37° C.</li>
		<li>Macchia le celle con un pannello di Live/Dead-macchia-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy 5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 e anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>Includono FMO controlli nel pannello di PBMC.</li>
		<li>Eseguire un'analisi cytometric di flusso con un citometro a flusso e analizzare i risultati utilizzando il relativo software.</li>
		<li>Cancello il CD3 + CD4 + CD8-sottoinsiemi producenti citochina utilizzando la seguente strategia di gating: Canottiere - > vitali CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + o il-2 +.</li>
		<li>Cancello su popolazioni di cellule effettrici memoria utilizzando la seguente strategia di gating: Canottiere - > vitali CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Calcolare i profili di cytokine individuali usando gating booleano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dimostrazioni di rilascio di citochine<ol>
<li>Per una dimostrazione di una citochina rilascio in vivo, utilizzare un'analisi multiplex per quantificare i livelli del-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-13 nel liquido della bolla di aspirazione scongelati ottenuto da 4 volontari.</li>
		<li>Per una dimostrazione di un rilascio di citochine dalle cellule ottenute da aspirazione vesciche ex vivo, uso fresco aspirazione blister cellule e PBMC ottenuti da 1 volontario vaccinati BCG.</li>
		<li>Infettare i PBMC e cellule di blister con 100 unità formanti colonie (CFU) di Mtb H37Rv di aspirazione e loro Incubare per 4 giorni.</li>
		<li>Utilizzare un'analisi multiplex per quantificare i livelli del-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-13 in tutti i surnatanti della cultura.</li>
		<li>Regolare le misure sopra la gamma di calcolo analisi al limite superiore di calcolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo manoscritto descrive una procedura pratica per lo studio della memoria immunitaria umana responses in vivo, utilizzando antigene cutaneo delle cellule e richiamo raccolto tramite induzione aspirazione blister. TST è stato utilizzato come esempio di deposizione di antigene intradermica e richiamo del vaccino di BCG. Infine, un esempio di SB esemplare caratterizzazione mediante analisi di flusso cytometric e multisala citochina è stata fornita, che dimostrano che circa un terzo delle cellule SB erano polifunzionale di antigene-specifiche cellule T del fenotipo memoria effettrici.
I passaggi critici del presente protocollo comprendono la tecnica di iniezione intradermica, l'induzione di aspirazione blister e la puntura della bolla. In primo luogo, una corretta deposizione intradermica richiede personale specializzato. Una deposizione non corretta può portare a risultati non ottimali. PPD è generalmente un antigene cutaneo ben noto e sicuro, ma la sua composizione può variare tra produttori, limitando la comparabilità13,20. Questo rapporto fornisce le istruzioni per una singola deposizione intradermica di 2 TU e facoltativamente due deposizioni parallele (2 x 2 TU), che possono richiedere ulteriore approvazione etica. Tuttavia, altri studi hanno utilizzato 10 TU, che aumentano la probabilità di una pelle forte reazione10,21. Durante la fase di induzione di SB, piccolo aumento graduale della pressione negativa ridurrà il rischio di rottura di emorragia e sul blister. Le possibilità di contaminazione con globuli rossi o leucociti dal sangue sono generalmente basso2. La tecnica di puntura asettica previene la contaminazione microbica ed evitando il contatto tra l'ago puntura e il pavimento della bolla cutanea riduce le impurità di detriti o di cellule cutanee residenti. Tuttavia, alcuni ricercatori preferiscono raccogliere il fluido SB applicando una pressione di rotolamento per il blister perforato10. Può essere necessario forare i setti all'interno del blister. La stessa tecnica di SB è minimamente invasiva; SBs compresso guariscono senza cicatrici e infezioni sono molto rare. 2 tuttavia, può verificarsi un certo grado di ipo-pigmentazione e induzione di SB dovrebbe probabilmente essere evitato in persone con una storia di colloide cicatrici.
Limitazioni tecniche includono basso cellulare totale rendimenti e conseguenza limitati opzioni per l'archiviazione a lungo termine. Le relazioni tra la resa del leucocita, le risposte cliniche di TST, la dimensione della bolla e contaminazione dell'eritrocito è stato accuratamente descritto altrove2,10. Negli esperimenti BCG-richiamo qui presentati (Figura 1), la resa totale mediana da ogni blister era 50.000, implicando un set-up sperimentale e su piccola scala, utilizzando queste cellule, soprattutto se SBCs sono studiati da solo15. Tuttavia, la popolazione di cellule T specifica in un campione di SB supera per lo più quello che è trovato in campioni di PBMC in entrambi i conteggi relativi e assoluti delle cellule. Nell'esempio presentato nella Figura 2, il numero di cellule T specifiche PPD triple-positivi in un campione di 100.000 SB cellule era più di 2 x maggiore rispetto al numero trovato in 1 x 106 PBMCs dallo stesso donatore (dati non mostrati). Un segnare visivo della reazione TST è il più comune metodo clinico per la valutazione della memoria di M. tuberculosis . Della nota, la reazione immunologica adattiva sottostante non picco allo stesso tempo come la clinica pelle reazione2,21. Non tutti i vaccinati BCG o Mtb-gli individui esposti svilupperà forti reazioni di TST e strategie per la classificazione e una gestione dei campioni da TST non-responder, come pure una preesistenza sensibilizzazione micobatterica nella popolazione di studio, devono essere considerati prima di iniziare un processo di richiamo utilizzando questo metodo. Inoltre, in entrambi campionamento SB e segnare visivo, c'è un potenziale per una polarizzazione teorica in individui con le risposte di pelle riduttrice dovuto globale o dermo-affine alterato l'immunità, come si è visto, per esempio, l'infezione da HIV e determinate fasce di età2, 13,18,20. Inoltre, un'amplificazione immunologica della reazione con ripetuti test TST è ben noto20,22. Tuttavia, i fenotipi cellulari SB rimangono piuttosto costanti quando TSTs sono ripetute10. Questa osservazione sostiene il ruolo di richiamo di SB in studi longitudinali delle risposte immunitarie cellulari.
Per immunologi T-cellula, richiamo SB permette la raccolta delle frazioni alte di cellule antigene-specifiche. Tuttavia, i tempi di SB per un campionamento da un PPD-deposizione sono critico come sia la composizione cellulare e il microambiente di citochina cambiano nel tempo. In questo protocollo, vesciche erano indotto 7 giorni post-sfida e le cellule isolate erano principalmente CD4 + effettrici cellule T di memoria tra cui alte frazioni delle cellule con una co-espressione di IFN-γ, TNF-α e il-2. Queste osservazioni sono in linea con precedenti studi che descrivono come attivazione, proliferazione e differenziazione delle cellule T si verifica nella pelle di PPD-innescato2,15,21. Studi cinetici di SB in individui sensibilizzati PPD suggeriscono che la risposta di pelle molto precoce è aspecifica; Tuttavia, già entro i primi giorni dopo la sfida di PPD, la risposta diventa dominata da T-cells CD4 + (entrambi fenotipi di memoria memoria ed effettrici centrali sono state descritti) e, dopo 3 giorni, la risposta è dominata da alte frazioni di PPD specifiche citochine producendo i T-cells di CD4 +2,8,10,15,21. Questa risposta adattativa citochina rimane rilevabile per più di 2 settimane2,8,10,23. Giorno 7 post-TST sembra essere il punto di tempo ottimo per la raccolta della citochina producendo le cellule di T di memoria CD4 +2. Tuttavia, altri punti di tempo possono, naturalmente, essere pertinenti a seconda dell'antigene e la risposta di interesse. Da notare, in uno studio, la risposta adattativa di PPD è stata segnalata per un po' prima di picco con una diminuzione della secrezione di citochina pro-infiammatoria già a 5 giorni post-TST10.
SB liquido contiene alti livelli di citochine pro-infiammatorie e di altre proteine indicati per essere rappresentante della pelle microambiente15,24. Studi di cinetica hanno dimostrato che TNF-α e IFN-γ livelli nel picco fluido SB dopo 3 giorni mentre il picco dei livelli IL-2 dopo 7 giorni2,10, probabilmente riflettendo la dominanza di risposte adattative in questa fase successiva. Perché le cellule SB sono stati attivati in vivo, esibiscono un rilascio di citochine spontaneo alta così come un potenziale per un rilascio specifico su restimolazione (Figura 3 e 4).
Questa relazione si concentra sulla immunità delle cellule T CD4 +. Come dimostrato nella Figura 2, la maggior parte delle T-cellule isolate era infatti CD4 +, mentre non c'erano quasi nessun CD8 + cellule T nell'aspirazione blister fluido. Questo è in linea con altri studi di SB PPD-richiamo reporting proporzioni basse e un'inferiore capacità migratoria delle T-cellule CD8 + rispetto a cellule T CD4 +2,8,10,23. Un'ulteriore caratterizzazione del CD8 + contributo sarebbe preferibile; Tuttavia, questo esula dall'ambito della presente relazione.
Le cellule T sono considerate essenziali per il controllo immune di Mtb; Tuttavia, è stato difficile identificare un affidabile correlato della tutela riflettuto nella risposta immunitaria adattativa dal sangue25,26. Questo blocco impedisce gravemente lo sviluppo di nuovi vaccini di TB, come attualmente non esiste alcuna alternativa all'efficacia di grandi dimensioni e molto costose prove27. Gli sviluppatori di vaccino TB determinano l'immunogenicità del vaccino valutando cambiamenti piccoli e transitori nelle popolazioni vaccino-specifiche cellule T nel sangue28,29. Tuttavia, è lecito chiedersi se sia rilevante la piccola frazione di cellule T antigene-specifiche nel sangue di circolazione (cioè, in grado di migrazione verso il sito di un'infezione e rappresentante del microambiente di T-cellula-ricco, il controllo Mtb) 27 , 30 , 31 .
Basato su studi precedenti e i dati presentati nel presente documento, il modello di richiamo cutaneo SB rappresenta un potenziale non sfruttato per lo studio delle cellule T specifiche del vaccino. Non solo il modello consente un richiamo di un vaccino risposta generata da decenni, permette anche la valutazione della memoria vera potenziale in un contesto di tessuto-specifica15,18,19,21. Romanzo, specifici test cutanei, che includono antigeni compreso anche dei vaccini subunità TB, suggerire nuove opportunità per la valutazione del vaccino utilizzando questo modello28,32. Inoltre, analisi trascrittomica suggeriscono che una risposta comunicata per cellule immunitarie generata nella pelle di PPD-sfidati sia simile alla risposta trovata in Mtb-infettato del polmone18.
Mentre biopsie di pelle anche consentono una raccolta delle cellule della pelle e forniscono informazioni spaziali, confrontati con campionamento SB, il metodo è più invasivo e richiede trattamento enzimatico o meccanico per preparare sospensioni unicellulari33. Misurazioni dei marcatori delle cellule e citochine sono comparabili tra i due metodi2,10.
Il metodo di aspirazione blister è già stato applicato in molti settori della ricerca medica oltre alla dermatologia, da solo o in combinazione con una sfida di pelle sistemica o locale. Gli esempi includono studi di sepsi, malattia linfoproliferativa associata al virus di Epstein - Barr, neuropatia diabetica, gli effetti di assunzione di glucocorticoidi e prove umane test anticorpi terapeutici o modelli per terapie mirate T-cellula10 ,34,35,36,37,38.
Da un punto di vista terapeutico, il metodo di richiamo cutaneo SB offre vantaggi unici per studiare la memoria centrale di T-cellula potenziale e -da entrambi un biologiche e tecniche il punto di vista, la pelle sembra fornire un campione rilevante vano2, 15,18,19,21. In particolare, rispetto al tradizionale campionamento passivo di PBMCs di circolazione, il metodo di richiamo cutaneo SB consente lo studio delle cellule T che hanno dimostrato la capacità di migrare dal linfonodo in risposta al loro antigene pertinenti e completare il locale espansione e differenziazione in un tessuto-specifica in vivo contesto15,18,19,21.
In conclusione, il modello ha dimostrato qui potrebbe essere rilevante per i ricercatori nel campo dell'immunità adattiva umana e agenti mirati della T-cellula (cioè, nella ricerca di vaccinologia o cancro malattia infettiva). Il modello TST applicato in questo protocollo è, naturalmente, di particolare rilevanza nel campo della vaccinologia TB. Tuttavia, il concetto di base di questo modello è fortemente applicabile in altri campi di ricerca.

Una pelle SB è un blister artificialmente indotto, che permette per la raccolta delle cellule e fluidi direttamente dalla pelle. La tecnica di innalzamento SBs di vuoto è uno strumento ben noto nel campo della dermatologia, utilizzato per lo studio sull'immunologia della pelle in salute e malattia1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. questo rapporto dimostra come la tecnica di SB combinata con richiamo antigenica cutaneo (metodo di richiamo cutaneo SB) può fornire intuizioni diretta in risposte immunitarie in vivo.
Il principio dietro l'induzione di SB è semplice: una leggera depressione viene applicata ad una piccola zona della pelle. La pressione negativa alla fine costringerà l'epidermide per separare dal derma, creando una bolla locale piena di liquido e cellule1,2,9. Il liquido della bolla può essere raccolto da un'aspirazione fine dell'ago e il contenuto può essere utilizzato per ulteriore studio in vitro.
Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nel metodo SB per lo Studio in vivo le risposte immunitarie diverso da malattie limitate alla pelle10,11. Lo studio dell'immunità adattativa in esseri umani è limitato dal fatto che le cellule e citochine di interesse vengono campionate da sangue periferico perché un prelievo invasivo del linfonodo o tessuto mucoso gastrointestinale può essere inaccettabile e immorale. Un esempio è lo studio delle risposte di memoria umana longevo della T-cellula dopo vaccinazione12. A tali prove, il campionamento delle T-cellule può essere una grande sfida, perché la relativa popolazione di cellule che mediano l'immunità risiede nel tessuto linfoide, e solo un numero molto limitato di T-cellule specifiche circolazione nel sangue periferico.
La tecnica di SB offre un'opportunità unica per lo studio delle cellule T di memoria e altre popolazioni cellulari specifici. Dopo l'inoculazione cutanea dell'antigene, le cellule T specifiche per l'antigene sono reclutati dai loro nascondigli linfoide alla pelle e possono facilmente essere campionati da SB. Le applicazioni di ricerca e metodologia di questo modello di richiamo cutaneo sono stati descritti da Akbar et al. nel 20132. Un antigene comunemente usato per il richiamo di pelle è derivato commercialmente disponibili proteico purificato (PPD) di micobatteri utilizzati per eseguire un test cutaneo (TST) tubercolina13, dove PPD viene iniettato nello strato dermico della pelle. In individui con una memoria immunologica esistente verso PPD [ad esempio, gli individui con un'infezione di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) o una precedente vaccinazione di Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], la deposizione di antigene si traduce in un ricordare la risposta con la migrazione alla pelle e un'espansione clonale in vivo di cellule CD4 + T-PPD specifiche2,11,14,15. Di conseguenza, alte frazioni di PPD specifico polifunzionale i T-cells di CD4 + si accumulano nella pelle pronta per il campionamento di SB. T-cellule prelevate da questo metodo hanno dimostrato di essere robusto e sono sufficientemente abbondanti per essere caratterizzato da una gamma di test immunologici e da un lungo periodo in vitro cultura15. Così, il modello di richiamo cutaneo e l'induzione di SB può rivelarsi un metodo prezioso per lo Studio in vivo delle cellule T risposte dalle analisi ex vivo , e una maggiore conoscenza di questo approccio può avvantaggiare i ricercatori con interessi in immunologia cellulare e vaccinologia.
Questo rapporto fornisce la prima guida graduale su come indurre il blister aspirazione di pelle umana in pelle di PPD-iniettato. Il modello di richiamo di antigene cutaneo è dimostrato usando la TST in volontari vaccinati BCG. Infine, l'analisi pertinenti ex vivo delle cellule e citochine isolate da SB è esemplificato. Caratteristiche fenotipiche e funzionali delle cellule T specifiche PPD ottenute con il metodo di SB sono accuratamente descritti altrove2,10,11,16,17, 18 , 19. questa relazione mira a discutere gli aspetti pratici e immunologici della metodologia per facilitare l'applicazione di questa tecnica da altri gruppi di ricerca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

Antigene cutaneo-ricordano modelli consentono studi di memoria umana responses in vivo. Quando combinato con induzione della bolla di aspirazione (SB) della pelle, questo modello offre l'accessibilità alle popolazioni rare del rappresentante di cellule T antigene-specifiche della risposta di memoria cellulare nonché la citochina microambiente in situ.
Questo rapporto descrive la procedura pratica di un richiamo cutaneo, un'induzione di SB e un raccolto delle cellule T antigene-specifiche. Per esemplificare il metodo, il test cutaneo alla tubercolina viene utilizzato per il richiamo antigenico in individui che, prima di questo studio, ha subito una vaccinazione di Bacillus Calmette-Guérin contro un'infezione con tubercolosi del micobatterio. Infine, vengono forniti esempi di analisi cytometric di flusso e multisala degli esemplari di SB, illustrandone alte frazioni di polifunzionale antigene-specifici CD4 + T-cellule disponibili con questo metodo di campionamento rispetto con cellule isolate dal sangue.
Il metodo qui descritto è sicuro e mini-invasiva, offre un'opportunità unica di studiare entrambi immunitaria innata e adattativa in vivoe può essere utile per una vasta comunità di ricercatori che lavorano con umani e immunità cellulo-mediata memoria di risposte, nel contesto di sviluppo di un vaccino.

Otto volontari adulti sani (età media: 30 anni, gamma: 26-43 anni) con una documentata precedente vaccinazione BCG (tempo mediano dalla vaccinazione di BCG: 5,5 anni, gamma: 1-30 anni) sono stati inclusi. I partecipanti sono stati sfidati per via intradermica con 2 TU di PPD seguita da una valutazione di TST il giorno 3. SBs erano indotto il giorno 7 e raccolto il giorno 8, e tutte le bolle sono state sollevate utilizzando camere di aspirazione blister con diametri di foro di 10 mm. Sette individui sono stati dati 2 inoculazioni di PPD separati contemporaneamente nel braccio stesso seguito da 2 parallele induzioni di SB (fare riferimento alla nota per quanto riguarda più PPD deposizioni sotto passo 1.4 nel protocollo). Sangue periferico è stato disegnato il giorno 7 per plasma e un isolamento di PBMCs da centrifugazione in gradiente di densità. I surnatanti plasma e liquido da SBs sono stati conservati a-20 ° C. Cellule fresche di SB (SBCs) sono stati contati usando microscopia e Nigrosina macchia.
Le risposte cliniche TST e resa SBC sono presentati nella Figura 1. Il formato mediano del indurimenti TST era 10,25 mm (gamma: 0 - 20 mm) e il numero di cellulare mediano per blister era 50.000 (gamma: 15.000-210.000 celle, numero di bolle: 15). Due dei volontari ha avuto nessuna risposta clinica in entrambi i 2 TSTs e un corrispondente rendimento basso cella totale di 15.000 cellule/blister. Il rendimento delle celle è stato associato con la risposta clinica media di TST (Spearman r = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Figura 1 : Rendimento delle celle aspirazione blister. (un) questo pannello mostra un rappresentante microscopia di Nigrosina-macchiato le cellule isolate da SBs generato 7 giorni post-TST. (b) questo pannello mostra le relazioni tra l'indurimento di TST medio (mm) e il rendimento medio delle cellule (n/blister) in 8 volontari vaccinati BCG (numero di vesciche = 15). I punti rappresentano misurazioni medie individuali. Siete pregati di notare che i 2 punti sono sovrapposte come 2 volontari entrambi avevano un indurimento di TST di 0 mm e un rendimento delle celle di 15.000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per illustrare la caratterizzazione di flusso cytometric SB, SBC sono stati ottenuti da un volontario di 43 anni che era stati vaccinati BCG 30 anni prima e non aveva alcuna esposizione conosciuta per Mtb. The SBC sono stati isolati dopo l'induzione di una singola bolla ( indurimento: 1,4 mm/100.000 SBCs). La figura 2 Mostra trame rappresentativi della colorazione intracellulare cytokine del SBCs contro PBMCs.
In questo volontario, la frazione di CD3 + CD4 + CD8-SBCs aumentato dal 67% in cellule non stimolate a > 90% su un PPD in vitro restimolazione, considerando che la frazione di CD3 + CD4 + CD8-PBMCs è rimasto costante (~ 51%, Figura 2). Oltre il 92% della in vitro PPD-, come pure non stimolate CD3 + CD4 + CD8-SBCs, erano del tipo memoria effettrici (CCR7 - CD45RA-, dati non mostrati). Le frazioni complessive di CD3 + CD4 + CD8-cellule specifiche indotte da PPD-stimolazione erano più alti in SBCs rispetto ad i PBMCs (33,1 vs. 0,2%, non stimolati campioni sottratti). In PBMCs, le frazioni di polifunzionale PPD specifiche cellule CD3 + CD4 + CD8 erano tutti < 0.05%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Figura 2 : Rappresentante flusso cytometry appezzamenti di SBC contro PBMCs. Pannelli a e b mostrano densità rappresentativa appezzamenti di popolazioni di CD8 + e CD4 + a (un) stimolate vs. PPD-stimolato PBMC e (c) SBCs. pannelli b e d lento appezzamenti di macchiatura in cellule CD3 + CD4 + CD8 PPD-stimolato per (b) PBMCs intracellulari di cytokine e (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per vedere una più grande versione di questa figura.</a>
Come previsto, CD3 + CD4 + CD8-SBC sono stati attivati in vivo, illustrato da una proporzione elevata delle cellule macchiando per sovraregolati citochine (12%), con il predominante citochine, TNF-α e IFN-γ. Tuttavia, PPD-stimolazione, la citochina che secernono le cellule spostata verso un triple - o doppio-positivo IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%) e IFN-γ + TNF-α + (15%) profilo (Figura 3b, profili PBMC dallo stesso donatore sono inclusi per il confronto in Figura 3a). I profili di espressione di citochina per sottoinsiemi di PPD-stimolata effettrici memoria CD4 + cellule T (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) erano paragonabili a CD3 + CD4 + CD8-popolazione presentata nelle figure 2 e 3 (dati non mostrati).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Figura 3: profili di Cytokine per CD4 + PPD-stimolato e non stimolate SBCs contro PBMCs.  Questi pannelli mostrano profili individuali per la produzione di citochina (un) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs cellule e (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Le barre rappresentano frazioni di profili di cytokine antigene-specifici in cellule non stimolate (barre bianche) e una stimolazione in vitro con PPD (barre colorate).
Per esplorare il fluido di SB come fonte di informazioni sul microambiente citochina al sito della prova della pelle, sono stati misurati i livelli di citochine nel liquido raccolto da SBs indotto 7 giorni post-TST (Figura 4a). I livelli mediani di IFN-γ, TNF-α e il-2 erano 339 pg/mL, 19 pg/mL e 1 pg/mL, rispettivamente (n = 6). I livelli del plasma sono stati generalmente molto bassi. Cellule isolate da SBs prodotto gli alti livelli di citochine pro-infiammatorie ex vivo (Figura 4b). Titolazioni di SBCs da 1 volontario sono state coltivate per 4 giorni in presenza di virulento M. tuberculosis ± PBMCs autologo. I livelli di IFN-γ erano > 30 volte superiore in colture contenenti SBCs, indipendentemente dalla presenza di PBMC.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Figura 4 : Livelli di citochine nel liquido di SB, al plasma, e MTB -infettati surnatanti. (un) questo pannello mostra i livelli di citochina in surnatanti fluidi SB e plasma da 6 volontari vaccinati BCG. Le barre rappresentano i livelli di citochine mediano; le barre di errore rappresentano la gamma. (b) questo pannello mostra i livelli di citochina in surnatanti da 4 600 µ l ex vivo 4 giorni culture parallele di 1 x 106 PBMCs (barre nere), 1.75 x 105 SBCs (barre bianche) e 1 x 106 PBMCs a spillo con 0,5 o 1.75 x 10 5 SBCs (barre grigie) infettato da Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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