Name: a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

우리는 그의 실용적이 고 학문적 인 조언을; Mads Radmer 젠 슨을 감사 하 고 싶습니다. 라우 Lindqvist 및 Kaare Svejstrup 제공 전문 기술; 헬렌 Bæk Juel, 조나단 Filskov, 로그인 토니 슈미트, Solveig W. Harpøth 그들의 기술 지원; PPD 관리;에서 그들의 훈련에 대 한 젠 토 프 트 TB 외래 환자 진료소에서 직원 그리고 연구에 참여에 대 한 모든 자원 봉사자. 이 프로젝트는 유럽 위원회 H2020 프로그램 [보조금 번호 TBVAC2020 643381]와 우리 컨소시엄 파트너 유익한 토론에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

인간의 자의 사용을 포함 하 여 아래 설명 된 모든 방법은 건강 연구 윤리 (H-15002988) 및 덴마크어 데이터 보호 기관 (jr.nr. 2015-57-0102) 덴마크 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고. PPD는 인간 사용을 위해 승인 하 고 제조업체에서 제공 하는 정확한 복용량에서 관리 인증된 제품 이어야 합니다. 복용량 또는 관리 모든 편차가 추가 윤리적인 승인 해야 하 고 자원 봉사자 동의 부여 해야 합니다.
1. 투베르쿨린 피부 검사
<ol><li>자원 봉사에서 구두 및 서 면 동의 얻을. 주입, 이전 지원자를 이해 하 고 수락 가능한 불리 한 효과 포함 하는 절차를 확인 합니다. 참고:이 프로토콜 특정 포함 기준 > 18 세 및 문서화 BCG 예방 접종은. 포함 기준 연구 질문에 따라 다를 수 있습니다 (즉, 추가 포함 기준 긍정적인 TST의 증거 일 수 있었다).</li>
	<li>PPD의 기성 솔루션을 사용 하 여 인간의 사용 [20 투베르쿨린 단위 (TU) /mL]에 대 한. 소독 알콜 면봉을 사용 하 여 유리병의 고무 캡.</li>
	<li>사출 사이트 준비<ol>
<li>자원 봉사자의 팔 뚝의 복 부 측에 사출 사이트를 찾습니다.</li>
		<li>일반 표면에 팜 업 팔을 놓고 팔 뚝, 팔꿈치 관절에서 약 5-10 cm의 위 세 번째 영역을 선택 합니다. 숙박은 상처, 정 맥, 또는 손상 된 피부의 선택을 취소 합니다.</li>
		<li>알코올 면봉을 사용 하 여 영역을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPD 솔루션 준비<ol>
<li>1 mL 균 주사기 27-30 G/짧은 (예를들면, 12 m m) 바늘을 고정을 사용 합니다.</li>
		<li>부드럽게 혼합 하 고 PPD 솔루션의 0.1 mL를 갈망. 거품 없는 볼 수 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피부 PPD 주사 참고:이 단계 단일 PPD 증 착을 수행 하는 방법을 설명 하지만 동일한 팔에서 PPD의 여러 증언 가능 합니다. 그러나,이 특정 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다.<ol>
<li>피부를 스트레칭 하 고 위쪽으로 향하게 하는 경사와 함께 피부에 5-15 ° 각도로 바늘을 가리킵니다.</li>
		<li>피부 피부 층에 바늘의 팁을 삽입 하 고 팁은 표 피를 통해 거의 볼 수 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>천천히 PPD 솔루션의 0.1 mL를 주사. 참고: 올바르게 관리 하는 경우 6 ~ 10 mm의 창백한 구 진 즉시 나타납니다. 구 진 약 10 분 후 사라진다.</li>
		<li>두 개 이상의 증언 때, 팔꿈치 및 손목 영역에서 좋은 거리에서를 유지 하면서 사출 사이트의 최대 별거 (5-10 cm)에 대 한 목표. 참고:이 피부 테스트 응답의 잠재적인 합류를 방지 하 고 있습니다 두 개의 흡입 챔버의 중단 위치.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 피부 반응-3 일의 평가
<ol><li>48-72 시간 후 note 피부 반응의 크기. 단단하게 됨 (붓기)를 측정 하지 반응의 홍 반 (적색).</li>
	<li>하드를 만져 손가락을 사용 하 여 붓기와 볼펜을 사용 하 여 단단하게 됨의 가장자리를 표시 하는 다음. 눈금자를 사용 하 여 단단하게 됨 직경을 측정 하 고 결과 m m. 참고: 단단하게 됨 크기의 흡입 챔버에 대 한 오리 피스 직경의 선택을 가이드 수 있습니다.</li>
</ol>3. 흡입 물집 유도-7 일
<ol><li>흡입 장치 단위 조립. 참고: 흡입 장치 단위는 흡입 물집 유도 대 한 연결 된 챔버와 진공 펌프. 이 데모에서 사용 되는 장치는 사용자 정의 하지만 흡입 장치 단위는 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 펌프-20 ~-40 kPa의 범위 내에서 조정 가능 하 고 안정 하 고 신뢰할 수 있는 부정적인 압력을 제공 해야 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 실험을 실시 이전 지역 윤리적인 승인을 얻은 합니다.<ol>
<li>첫째, 하단 오리 피스 플레이트와 챔버와 연결 호스 창 접시를 조립 하 여 흡입 챔버를 준비 합니다. 진공 펌프를 단단히 챔버에 연결 호스를 연결 합니다. 참고: 챔버는 인간의 피부와 접촉에 적합 해야 합니다, 물집 유도 구멍 바닥판 및 물집의 비주얼 모니터링에 대 한 허용 창 상단 플레이트 포함 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피부 반응;의 크기를 기준으로 오리 피스 플레이트의 최적의 오리 피스 직경을 결정 오리 피스, 크기가 큰 물집.</li>
	<li>오리 피스 플레이트와는 자원 봉사자의 피부 소독 알코올 면봉을 사용 하 여.</li>
	<li>피부에 흡입 챔버를 연결 합니다.<ol>
<li>자원 봉사자의 팔 편안 하 게 휴식 하 고는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>피부 반응의 센터 표시 되도록 PPD 반응을 통해 흡입 챔버의 하단 플레이트에 구멍 위치 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>안전 띠를 사용 하 여 느슨하게 챔버: 챔버 피부에 준수 되며 그 위치를 유지 때 부정적인 압력이 적용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>흡입 장치를 설정 하 고-20 kPa에 압력을 조정 합니다.</li>
	<li>30 분 후-25 kPa에 부정적인 압력을 증가.</li>
	<li>60 분 후-30 kPa에 부정적인 압력을 더욱 높일.</li>
	<li>물집은 완전히 형성 될 때까지-30 kPa에서 압력을 유지. 이 프로토콜에서 제공 하는 부정적인 압력 특정 사용자 지정 된 악기 인지 확인 합니다. 그것은 약간 다른 설정에서 프로토콜을 적용할 때 압력을 조정 해야 합니다. 참고: 물집 유도 단계 Blistering는 종종 가려움 센 세이 션과 관련 된 마지막 30 분 이내에 발생 하는 실제 물집 형성-180 분 (1-3 h) 60에서 배열 한다. 물집은 하나 또는 여러 개의 병합 물집으로 발생할 수 있습니다. 만약 물집이 파열 또는 출혈 발생, 천천히 압력을 방출 하 여 물집 유도 종료 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>물집은 완전히 형성 후 압력을 놓고 피부에서 물집 파열 없이 흡입 챔버를 조심 스럽게 제거.</li>
	<li>주변 피부에 부드러운 드레싱을 적용 하 고 물집 하드 캡 (예를 들어, 50 mL 플라스틱 튜브에서) 장소.</li>
	<li>부드러운 신축성 붕대 뒤 비 알레르기 수술 테이프로 모자를 보안 합니다.</li>
	<li>다음 12-24 h에 대 한 물집 지역에 과도 한 신체 부담을 피하기 위해 자원 봉사를 하도록 지시 합니다.</li>
</ol>4. 수확 물집 유체의-주 8
<ol><li>8번째 날, 부드럽게 보호 드레싱을 제거 하 고 피부 소독 스프레이와 물집을 치료.</li>
	<li>23 G 바늘으로 2 mL의 멸 균 주사기를 사용 하 여 물집 콘텐츠를 수확. 물집의 상단/측면 쪽에 바늘을 삽입 하 고 액체를 천천히 발음. 구멍의 바닥을 만지지 마십시오 하지만 모든 액체를 수확.</li>
	<li>축소 된 물집에 드레싱을 적용 합니다.</li>
	<li>무 균 튜브에 물집 유체를 전송. 볼륨 note</li>
	<li>탁상 원심 분리기를 사용 하 여 4 분 600 x g에 아래로 물집 액체를 회전 합니다.</li>
	<li>다른 튜브에는 상쾌한 전송 및 셀 매체의 500 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend. 참고: 셀은 계산 및 추가 분석에 대 한 준비. Supernatants 사용까지-20-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 흡입의 분석 물집 세포 및 체액
참고:이 프로토콜의 범위 내에서 않습니다 세포와 피부 흡입 물집에서 얻은 액체의 분석에 대 한 지침을 제공. 그러나,이 보고서에 대 한 대표적인 결과 제공, 세포내 얼룩 흐름 cytometry 및 멀티플렉스 분석 수행 했다. 방법론은 아래에 간단히 설명 되어 있습니다.
<ol><li>Cytometry<ol>
<li>1 x 105 신선한 셀 1 BCG 예방 접종 자원 봉사자와 PPD의 10 µ g/mL에서에서 흡입 물집에서 절연의 현 탁 액을 자극 하 고 37 ° C, 5%에서 세포를 품 어 공동2. 병렬 부 화에 대 한 unstimulated 셀을 포함 합니다.</li>
		<li>1 x 106 PBMCs PPD의 10 µ g/mL와 함께 1 BCG 예방 접종 자원에서 얻은 정지를 자극 하 고 37 ° C에서 5% 혼합물을 품 어 공동2. 병렬 부 화에 대 한 unstimulated 셀을 포함 합니다.</li>
		<li>2 시간 후 Brefaldin A와 monensin 모든 세포를 치료 하 고 37 ° c.에 6 h에 대 한 그들을 품 어</li>
		<li>라이브/죽은-얼룩-BV510, 안티-CD4-AF780, 안티-CD3-BV421, 안티-CD8-PerCP-Cy5.5, 안티-CCR7-PE, 안티-CD45RA-BV786, 안티-IFN-γ-AF700, 안티-TNF-α-PE-Cy7, 및 안티-일리노이-2-FITC 패널 셀 얼룩.</li>
		<li>PBMC 패널에 FMO 컨트롤을 포함 합니다.</li>
		<li>교류 cytometer와 흐름 cytometric 분석을 수행 하 고 관련 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석.</li>
		<li>Cytokine 생산 CD3 + CD4 + CD8-하위 다음과 같은 제어 전략을 사용 하 여에 게이트: singlets-> 가능한 CD3 +-> CD4 + CD8--> IFN-γ +, TNF-α + 또는 일리노이-2 +.</li>
		<li>이펙터 메모리 셀 인구는 다음과 같은 제어 전략을 사용 하 여에 게이트: singlets-> 가능한 CD3 +-> CD4 + CD8--> CCR7-CD45RA-.</li>
		<li>부울 게이팅을 사용 하 여 개별 cytokine 프로필을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytokine 릴리스 데모<ol>
<li>Vivo에서릴리스에 cytokine의 데모에 대 한, 다중 분석을 사용 하 여 계량 일리노이-2, IFN-γ, TNF-α, 일리노이의 레벨-10, 및 IL-13 4 자원에서 얻은 해 동된 흡입 물집 액체에서.</li>
		<li>세포 cytokine 방출의 데모에서 얻은 흡입 물집 전 비보, 사용 신선한 흡입 물집 세포와 PBMCs 1 BCG 예방 접종 자원에서 얻은.</li>
		<li>감염에서 PBMC 100 콜로 니 형성 단위 (CFU) Mtb H37Rv 물집 세포를 흡입 하 고 4 일 동안 그들을 품 어.</li>
		<li>다중 분석을 사용 하 여 계량 일리노이-2, IFN-γ, TNF-α, 일리노이의 레벨-10과 IL-13 모든 문화 supernatants에.</li>
		<li>위 계산도 분석 결과 계산 범위 위의 측정을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+vaccine+H56/CAF01+induces+a+population+of+circulating+CD4+T+cells+that+traffic+into+the+Mycobacterium+tuberculosis-infected+lung.">Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung.</a> Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).</li><li>Gideon, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+tuberculosis+granuloma+T+cell+responses+exists,+but+a+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+is+associated+with+sterilization.">Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization.</a> PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).</li><li>Ruhwald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+the+C-Tb+skin+test+to+diagnose+Mycobacterium+tuberculosis+infection,+compared+with+an+interferon+&#947;+release+assay+and+the+tuberculin+skin+test:+a+phase+3,+double-blind,+randomised,+controlled+trial.">Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon &#947; release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).</li><li>He, X., de Oliveira, V. 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저자는 공개 없다.

이 원고는 인간의 면역 메모리 응답에서 vivo에서, 흡입 물집 유도 함으로써 피부 항 원 회수 및 셀 수확을 사용 하 여 연구에 대 한 실질적인 절차를 설명 합니다. TST 피부 항 원 증 착 및 BCG 백신 회수의 한 예로 사용 되었다. 마지막으로, SB 표본 특성 흐름 cytometric 및 멀티플렉스 cytokine 분석의 예를 제공, 이펙터 메모리 형의 항 원 특정 polyfunctional T-세포를 했다 SB 셀의 세 번째는 대략 시연 했다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 피부 주입, 흡입 물집 유도 기술과 물집 펑크 포함 됩니다. 첫째, 올바른 피부 증 착 훈련된 인원을 필요합니다. 잘못 된 증 착 차선의 결과 발생할 수 있습니다. PPD는 일반적으로 잘 알려진 하 고 안전한 피부 항, 하지만 그 구성 comparability13,20제한 제조 업체 간의 다를 수 있습니다. 이 보고서는 2 TU의 단일 피부 증 착 및 필요에 따라 두 개의 병렬 증언 (2 x 2 TU), 추가 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다에 대 한 지침을 제공 합니다. 그러나, 다른 연구 사용 10 부 엉, 강한 피부 반응10,21의 가능성을 증가 하는. SB 유도 단계에서 부정적인 압력에서 작은 stepwise 증가 출혈 및 물집 파열의 위험을 줄일 것입니다. 적혈구와 백혈구 혈 류에서 오염의 기회는 일반적으로 낮은2. 무 균 바늘 기술 미생물 오염을 방지 하 고 파편 또는 거주 피부 세포의 불순물을 감소 펑크 바늘 및 피부 물집 바닥 사이의 접촉을 피하고. 그러나, 일부 연구 자들은 SB 액체 구멍이 물집10회전 압력을 적용 하 여 수확을 선호 합니다. 그것은 물집 내의 septa 펑크 필요할 수 있습니다. SB 기법 자체는 최소 침 습; 축소 된 SBs 흉터 없이 치료 하 고 감염 매우 드물다. 그러나 2 , 어느 정도의 hypo-착 색 발생할 수 있습니다 및 SB 유도 아마 콜 로이드 흉터의 역사를 가진 사람들에 피해 야 한다.
기술 한계는 낮은 총 셀 수율 및 장기 저장을 위한 따라서 제한 된 옵션을 포함합니다. 백혈구 수율, 임상 TST 응답, 물집 크기, 및 적혈구 오염 간의 관계 되었습니다 철저 하 게2,10설명 되어. BCG 회수 실험에서 여기에 제시 된 (그림 1), 각 물집에서 평균 총 수익률 50000, Sbc는15공부 혼자 하는 경우에 특히 이러한 세포를 사용 하 여 소규모 실험 설정을 암시 했다. 그러나, SB 샘플에서 특정 T 세포 인구 대부분 초과 두 상대 및 절대 셀 카운트에서 PBMC 샘플에서 무엇을 발견 합니다. 그림 2에 표시 하는 예제에서 트리플-긍정적인 PPD 전용 T-셀 100000 SB 세포의 샘플 수는 숫자에서 1 x 106 PBMCs 같은 기증자 (데이터 표시 되지 않음)에서 보다 큰 x 2 이상 했다. TST 반응은 시각적으로 채 점 하는 것은 M. 결핵 메모리 평가 대 한 가장 일반적인 임상 방법입니다. 메모의 기본 적응 면역 반응 임상 피부 반응2,21로 동시에 피크 하지 않습니다. 모든 BCG-예방 접종을 하지 또는 Mtb-노출된 개인 강한 TST 반응 및 분류, 그리고 응답자, TST 비-연구 인구에 기존 mycobacterial sensitization에서 샘플의 처리에 대 한 전략을 개발할 것입니다 이 메서드를 사용 하 여 리콜 재판을 시작 하기 전에 고려 될 필요가 있다. 또한, SB 샘플링 및 시각적 득점, 이론적인 편견 감소 피부 반응 때문에 글로벌 개인에 대 한 가능성 또는 본, 예를 들어, 특정 연령 그룹2, HIV 감염에 면역 장애 피부 관련 13,,1820. 또한, 반복 테스트와 TST 반응의 면역 증폭 잘 알려진20,22입니다. 그러나, TSTs는 반복된10SB 셀 고기 오히려 지속적인 유지 됩니다. 이 관찰 세포 면역 반응의 경도 연구에서 SB 회수의 역할을 지원합니다.
T-셀 immunologists, SB 회 항 원 특정 셀의 높은 분수의 수확 할 수 있습니다. 그러나, PPD 증 착에서 샘플링 SB의 타이밍은 세포 구성과 cytokine microenvironment 시간이 지남에 변경 중요 합니다. 이 프로토콜에서 물집 있었다 유도 7 일 후 도전과 고립 된 세포 주로 CD4 + 이펙터 메모리 T-세포 IFN-γ, TNF-α와 일리노이-2의 공동 식 셀의 높은 분수를 포함 하 여. 이 관측은 T-세포 활성화, 확산, 그리고 차별화 준비 하는 PPD 피부2,,1521에서 발생 하는 방법을 설명 하는 이전 연구에 맞춰. PPD 응 개인 운동 SB 연구 제안 초기 피부 반응입니다. 그러나, 이미 일 내에 첫 번째 PPD 도전 다음, 응답 CD4 + T 세포 (둘 다 중앙 메모리와 이펙터 메모리 고기 설명 되었습니다)에 의해 지배 되 고, 3 일 후, 응답의 높은 분수에 의해 지배 된다 PPD 관련 cytokine 생산 하는 CD4 + T 세포2,,810,,1521. 이 적응형 cytokine 응답 2 주2,,810,23이상 감지 남아 있습니다. 7 일 게시물 TST 메모리 CD4 + T 세포2를 생산 하는 사이토카인의 컬렉션에 대 한 가장 최적의 시간 지점에 것 처럼 보인다. 그러나, 다른 시간 점 물론, 항 원 및 관심의 응답에 따라 관련성이 있을 수 있습니다. 노트, 한 연구에 적합 한 PPD 반응 5 일 포스트 TST10에 이미 프로-염증 성 cytokine 분 비 감소와 조금 일찍 절정에 보고 되었습니다.
SB 액체 프로 염증 성 cytokines과 피부 microenvironment15,24의 대표자를 표시 하는 다른 단백질의 높은 수준을 포함 합니다. 활동 연구는 TNF-α와 IFN-γ 레벨 SB 유체 피크에 일리노이-2 레벨 피크 동안 3 일 후 7 일2,10, 후 아마 반영 하는 적응형 응답의 지배력이 나중 단계에서 나타났습니다. 때문에 SB 세포 활성화 vivo에서, 그들은 높은 자발적인 cytokine 방출으로 restimulation (그림 3 및 4)에 따라 특정 릴리스에 대 한 잠재력을 전시.
이 보고서는 CD4 + T 세포 면역에 주력합니다. 그림 2에서 설명 된, 격리 된 T-세포의 대부분은 실제로 CD4 +, 동안 있었다 거의 아무 CD8 + T-세포는 흡입에 물집이 액체. 이 낮은 비율 및 CD8 + T 세포 CD4 + T 세포2,8,,1023에 비해 열 등 한 철새 용량 보고 다른 SB PPD 리콜 연구 라인. CD8 + 기여의 더 특성 더 좋을 것 이다; 그러나,이이 보고서의 범위를 벗어납니다.
T-세포는 Mtb;의 면역 제어에 대 한 필수적인 것으로 간주 그러나, 그것은 혈액25,26에서 적합 한 면역 반응에 반영 하는 보호의 믿을 수 있는 상관을 식별 하기 위해 어렵게 되었습니다. 이 바리 케이트로 현재 크고 매우 비용이 많이 드는 효능 실험27대안이 새로운 결핵 백신의 개발을 심각 하 게 방해. 결핵 백신 개발자는 백신 immunogenicity 혈액28,29에 백신 관련 T 세포 인구에 있는 작은, 일시적인 변화를 평가 하 여 결정 합니다. 그러나, 그것은 의심 항 원 특정 T-세포는 혈액에 순환의 작은 분수 관련 인지 (즉, 감염 및 T-세포-풍부한 microenvironment 제어의 대표 사이트로 마이그레이션 가능 Mtb) 27 , 30 , 31 .
이전 연구와 여기에 소개 하는 데이터를 바탕으로, SB 피부 리콜 모델 백신 관련 T-세포의 연구에 대 한 미 개발된 잠재력을 나타냅니다. 뿐만 아니라 않는 모델 사용 전 백신 생성 된 응답 수십 회, 그것은 또한 조직 관련 컨텍스트15,18,,1921에 잠재적인 실제 메모리의 평가 있습니다. 소설, 특정 피부 테스트 후보 소 단위 결핵 백신의 구성 또한 항을 포함 하는이 모델28,32를 사용 하 여 백신 평가 위한 새로운 기회를 제안 합니다. 또한, transcriptomic 분석 PPD 도전 피부에 생성 된 셀-중재 면역 응답은 유사 Mtb에 응답 제안-폐18감염.
피부 펀치 생체 검사는 피부에서 세포 수확에 대 한 허용 하 고 SB 샘플링에 비해 공간 정보를 제공 하는 동안 메서드를 사용 하면 더 많은 침략 및 효소 또는 기계 처리 단일 셀 정지33준비 필요. Cytokines 및 셀 마커의 측정 두 가지 방법2,10사이 비교할 수 있습니다.
흡입 물집 방법 단독으로 또는 함께 조직 또는 지역 피부 도전 외에 피부과, 의료 연구의 많은 분야에서 적용 된 이미. 예로 패 혈 증, 엡 스타인-바 바이러스 관련 lymphoproliferative 질병, 당뇨병 신경 병, glucocorticoid 섭취 효과 및 치료 항 체 또는 T-세포 타겟 요법10 모델을 테스트 하는 인체 실험의 연구 ,3435,36,,3738.
치료 관점에서 SB 피부 리콜 방법 이점이 독특한 잠재적인 중앙 T-셀 메모리를 공부 하 고-의 관점-스킨 제공 관련 샘플링 구획2, 것 두 생물에서 및 기술 15,18,,1921. 특히, PBMCs 순환의 전통, 수동 샘플링에 비해, SB 피부 리콜 메서드를 수 있습니다 로컬을 완료 하 고 그들의 관련 항 원에 대 한 응답에서 림프절에서 마이그레이션할 능력 입증 된 T-세포의 연구에 대 한 확장 그리고 vivo에서 조직 관련 컨텍스트15,18,,1921에서 차별화.
결론적으로, 모델 여기 분야 내에서의 인간의 적응 면역과 T-셀 대상 에이전트 (즉, 전염병 백신 또는 암 연구에서) 연구자에 대 한 관련 될 수 있는 시연. TST 모델이이 프로토콜에 적용 되는, 물론, 결핵 백신 분야에 특별 한 관련성 의입니다. 그러나,이 모델의 기본적인 개념 연구의 다른 분야에도 적용 됩니다.

피부 SB는 인위적으로 유도 물집 세포와 피부에서 직접 액체의 수확에 대 한 허용 하는. 진공으로 SBs를 올리기의 기술이 이다 피부과 피부 면역학 건강과 질병1,2,3,,45, 의 연구에 대 한 사용의 분야에서 잘 알려진 도구 6 , 7 , 8.이 보고서 보여줍니다 어떻게 피부 항 원 리콜 (SB 피부 리콜 방법)와 결합 된 SB 기술을 적응 면역 반응 비보에 직접적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.
SB 유도 뒤에 원리는 간단 하다: 가벼운 진공 피부의 작은 영역에 적용 됩니다. 부정적인 압력은 결국 표 피 및 셀1,,29가득 로컬 물집을 만드는 진 피에서 분리를 강제 합니다. 물집 액체 정밀한 바늘 포부에 의해 수확 수 있습니다 고 추가 연구에서 시험관에대 한 콘텐츠를 사용할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안에 SB 방법 질병 피부10,11제한 이외의 면역 반응 생체 내에서 의 연구에 대 한 관심이 증가 되었습니다. 인간의 적응 면역의 연구는 세포 그리고 cytokines의 샘플링 말 초 혈액에서 림프 노드 또는 위장 점 막 조직에의 한 침략 샘플링 용납 하 고 비 윤리적인 수 있기 때문에 사실에 의해 제한 됩니다. 예를 들어는 예방 접종12후 긴 인간의 기억 T 세포 응답의 연구 이다. 이러한 시련에 관련 T-세포의 샘플링 관련 인구 면제를 중재 하는 셀의 림프 조직에 존재 하기 때문에 큰 도전 수 고만 매우 제한 된 수의 특정 T-세포는 말 초 혈액에서 순환.
SB 기술은 메모리 T-세포의 연구는 독특한 기회 및 다른 특정 세포 인구를 제공합니다. 항 원 피부 접종 다음 T-세포는 항 원에 대 한 특정 피부 림프 그들의 은신처에서 모집 하 고 SB에서 쉽게 샘플링할 수 있다. 이 피부 리콜 모델의 방법론 및 연구 응용 프로그램 아크 바르 외. 에 의해 설명 했다 20132에서. 피부 회수에 대 한 일반적으로 사용 되는 항 mycobacteria PPD 피부 피부 층에 주입은 투베르쿨린 피부 검사 (TST)13, 수행 하는 데 사용의 상용 순화 된 단백질 유도체 (PPD)입니다. PPD [예를 들어, 개인 결핵균 (Mtb) 감염 또는 이전 균 메 게 랭 (BCG) 접종]으로 기존 면역 메모리를 가진 개인, 항 원 증 착에서 결과 피부 하 비보에 클론 확장 PPD 특정 CD4 + T 세포2,11,,1415의 마이그레이션 응답을 기억 합니다. 그 결과, PPD 특정 polyfunctional의 높은 분수 CD4 + T 세포는 SB 샘플링에 대 한 준비 피부에 누적 됩니다. 이 방법에 의해 수집 된 T-세포는 강력한 것을 입증 되며 immunoassays의 범위 및 장기 생체 외에서 문화15특징을 충분히 풍부. 따라서, 피부 리콜 모델과 SB 유도 비보 전 분석에 의해 vivo에서 T 세포 응답을 공부 하는 귀중 한 방법을 증명할 수 있습니다. 그리고이 방법의 증가 지식 세포 면역학에 관심을 가진 연구자 혜택을 수 있습니다. 그리고 백신입니다.
이 보고서는 PPD 주사 피부에 인간 피부 흡입 물집을 유도 하는 방법에 첫 번째 단계적 가이드를 제공 합니다. 피부 항 원 리콜 모델은 BCG 예방 접종 자원 봉사자에서는 TST를 사용 하 여 보여 줍니다. 마지막으로, 세포의 cytokines SB에 의해 분리 관련 비보 전 분석은 exemplified. SB 메서드에서 얻은 PPD 전용 T-세포의 phenotypical 및 기능적 특성은 철저 하 게 설명 되어2,,1011,,1617, 18 , 19.이 보고서 다른 연구 그룹에 의해이 기술의 응용 프로그램 완화 방법의 실용적이 고 면역 측면을 논의 하는 것을 목표로.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

피부 항 원-리콜 모델 인간의 메모리 응답 비보의 연구에 대 한 수 있습니다. 피부 흡입 물집 (SB) 유도 결합 하 여,이 모델은 셀룰러 메모리 응답으로는 cytokine microenvironment에서 현장에서의 항 원 특정 T-세포 대표의 드문 인구를 내게 필요한 옵션을 제공 합니다.
이 보고서에서는 피부 리콜, SB 유도 및 항 원 특정 T-세포의 수확의 실질적인 절차를 설명합니다. 방법을 예증, 투베르쿨린 피부 검사 사용 개인,이 연구에 앞서 수술 감염 접종 균 메-게 랭에 항 원 리콜 결핵균. 마지막으로, 예제 SB 표본의 멀티 플렉스 및 흐름 cytometric 분석의 제공 됩니다, 세포는 혈액에서 분리에 비해이 샘플링 방법으로 항 원 특정 polyfunctional CD4 + T 세포 수의 높은 분수를 보여주는.
여기 설명 하는 방법을 안전 하 고 최소한 침략 적 공부를 모두 타고 난 및 적응형 면역 응답 vivo에서, 독특한 기회를 제공 합니다 이며, 셀 중재 면역과 인간의 협력 연구의 광범위 한 지역 사회에 도움이 될 수 있습니다. 메모리 응답, 백신 개발의 맥락에서.

8 건강 한 성인 자원 봉사자 (평균 나이: 30 년 범위: 26-43 년) 문서화 이전 BCG 예방 접종으로 (BCG 예방 접종에서 중간 시간: 5.5 년, 범위: 1-30 년) 포함 했다. 참가자는 2 TU PPD TST 평가 3 일에 의해 다음의 intradermally 도전 되었다. SBs는 7 일에 유도 되었고 8, 당일 수확 그리고 모든 물집 물집 흡입 챔버를 사용 하 여 10mm 구멍 직경을 제기 했다. 7 개인 2 병렬 SB inductions 뒤 같은 팔에서 동시에 분리 되 2 PPD 예방 접종을 부여 했다 (단계 1.4 프로토콜아래 여러 PPD 증언에 관한 참고를 참조 하십시오). 주변 혈액 플라스마 및 PBMCs 절연 제 7 일에 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 의해 그려진 했다. SBs에서 플라즈마와 액체 supernatants-20 ° c.에 저장 된 신선한 SB 셀 (SBCs) nigrosine 얼룩 현미경 검사 법을 사용 하 여 계산 했다.
임상 TST 반응과 SBC 수익률 그림 1에 표시 됩니다. TST indurations의 평균 크기는 10.25 m m (범위: 0-20 m m) 그리고 물집 당 평균 휴대폰 번호 50000 (범위: 15000-210000 셀, 물집의 수: 15). 2 자원 봉사자 2 TSTs 중 고 15000 셀/물집의 해당 낮은 총 셀 수익률에 임상 응답을 했다. 셀 항복 TST의 평균 임상 응답와 관련 되었다 (Spearman의 r = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> 그림 1 : 흡입 물집 세포 수확량. (한)이이 패널이 보여줍니다 대표 SBs에서 격리 nigrosine-얼룩진 세포의 현미경 7 일 게시물 TST 제기. (b)이이 패널에서는 평균 TST 단단하게 됨 (mm)와 평균 셀 생산량 (n/blister) 사이의 관계 8 BCG 예방 접종 자원 봉사자 (물집의 수 = 15). 점 들 개별 비 열 측정을 나타냅니다. 2 자원 봉사자 모두 0 m m의 TST 단단하게 됨 및 15, 000의 셀 항복 했다 2 점 겹치며 note 하시기 바랍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
흐름 cytometric SB 특성을 보여 SBCs BCG 예방 접종 30 년 전에 었 었던 43-올해-옛 자원 봉사에서 가져온 고 Mtb. 는 SBCs를 알려진된 노출 없이 단일 물집 (의 유도 따라 격리 했다 단단하게 됨: 1.4 m m/100000 SBCs). 그림 2 는 SBCs 대 PBMCs의 얼룩이 지는 세포내 cytokine의 대표 작을 보여준다.
이 자원 봉사자 CD3 + CD4 + CD8-Sbc의 분수에서에서 증가 unstimulated 세포에서 67%는 PPD 생체 외에서 restimulation 시 > 90% 반면 CD3 + CD4 + CD8-PBMCs의 일부분 남아 일정 (~ 51%, 그림 2). 이펙터 메모리 종류의 92%는 체 외에서 PPD-뿐 아니라 unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBCs 했다 하는 이상 (CCR7-CD45RA-, 데이터 표시 되지 않음). PPD 자극에 의해 유도 된 특정 CD3 + CD4 + CD8 세포의 전반적인 분수는 PBMCs에 비해 SBCs에서 높았다 (33.1 vs. 0.2%, unstimulated 샘플 빼고). PBMCs에서 polyfunctional PPD 특정 CD3 + CD4 + CD8 세포의 분수 모든 < 0.05%는 이었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> 그림 2 : Sbc의 대표적인 흐름 cytometry 플롯 대 PBMCs. 패널은 a 와 b 표시 대표 밀도 플롯 CD8 +와 CD4 + 인구 (a)의 unstimulated vs. PPD 자극 PBMCs 및 (c) SBCs. 패널 b 와 d 느린 PPD 자극 CD3 + CD4 + CD8-셀 (b) PBMCs에에서 얼룩이 지는 세포내 cytokine의 플롯 및 (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">제발 큰 보려면 여기 클릭 이 그림의 버전.</a>
예상 했던 대로, CD3 + CD4 + CD8-SBCs 주된 cytokines TNF-α와 IFN-γ와 활성화 된 vivo에서, 얼룩 upregulated cytokines (12%), 대 한 세포의 높은 비율에 의해 그림 했다. 그러나, PPD 자극에 따라 세포를 은닉 하는 cytokine 이동 쪽으로 트리플 또는 더블-양성 IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%)와 IFN-γ + TNF-α + (15%) 프로필 (그림 3b, 같은 기증자에서 PBMC 프로필 포함 된다 에에서 비교에 대 한 그림 3a). PPD 자극 이펙터 메모리 CD4 + T 세포 부분 집합에 대 한 cytokine 식 프로필 (CD3 + CD4 + CD8-CCR7-CD45RA-) CD3 + CD4 + CD8-인구 그림 2와 3 (데이터 표시 되지 않음)에 비교 했다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> 그림 3: PBMCs 대 자극 하는 CD4 + PPD와 unstimulated SBCs Cytokine 프로필.  이 패널 표시 cytokine 생산에 대 한 개별 프로필 (한) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs 세포와 (b) CD3 + CD4 + CD8-Sbc. 막대 항 원 특정 cytokine 프로필 unstimulated 셀 (흰색 막대)와 PPD (컬러 바)와 생체 외에서 자극 시의 분수를 나타냅니다.
피부 테스트 사이트에서 cytokine microenvironment에 정보의 소스로 SB 액체를 탐험, cytokine 수준 SBs 유도 7 일 게시물-TST (그림 4a)에서 수확 하는 유체에서 측정 되었다. IFN-γ, TNF-α와 일리노이-2의 중간 레벨 339 pg/mL, 되었고 19 pg/mL, 1 pg/mL, 각각 (n = 6). 플라스마 수준은 일반적으로 매우 낮은 했다. SBs에서 고립 된 셀 프로 염증 성 cytokines 비보 전 (그림 4b)의 높은 수준의 생산. 1 자원 봉사에서 Sbc의 titrations 4 일 악성 M. 결핵 의 존재에 대 한 교양 했다 ± 헌 PBMCs. IFN-γ 수준 > 30-fold SBCs, PBMCs의 존재에 관계 없이 포함 된 문화에서 더 높은.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> 그림 4 : SB 유체, 플라즈마, Cytokine 수준 및 Mtb -문화 supernatants 감염. (한)이이 패널 cytokine 수준을 보여줍니다 SB 유체 supernatants 및 플라즈마 6 BCG 예방 접종 자원 봉사자에서. 바 대표 중간 cytokine 수준; 오차 막대 범위를 나타냅니다. (b)이이 패널에서는 cytokine 레벨 4 병렬 600 µ l 비보 전 4 일간의 문화 1 x 106 PBMCs (검은 막대), 1.75 x 10에서에서 supernatants5 SBCs (흰색 막대), 및 1 x 106 PBMCs 아군 0.5 또는 1.75 x 10 5 SBCs (회색 막대) Mtb에 감염. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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