Name: a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
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Gostaríamos de agradecer a Mads Radmer Jensen por seus conselhos práticos e acadêmicos; Lau Lindqvist e Kaare Svejstrup para fornecer conhecimentos técnicos; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt e Solveig W. Harpøth para sua assistência técnica; os funcionários do ambulatório de Gentofte TB para sua formação em administração de PPD; e todos os voluntários para participar no estudo. Este projeto é financiado pelo programa Europeu Comissão H2020 [número de concessão TBVAC2020 643381], e nós gostaríamos de agradecer os parceiros do consórcio para os debates frutíferos.

Todos os métodos descritos abaixo, incluindo o uso de voluntários humanos, foram aprovados pelo Comité Dinamarquês saúde ética em pesquisa (H-15002988) e a agência de protecção de dados dinamarquês (jr.nr. 0102-2015-57). PPD deve ser um produto certificado aprovado para uso humano e administrado dentro a dosagem correcta fornecida pelo fabricante. Qualquer desvio na dosagem ou administração pode exigir aprovações éticas adicionais e voluntários devem dar o consentimento informado.
1. pele de tuberculina
<ol><li>Obter consentimento oral e escrito do voluntário. Antes da injeção, certifique-se de que o voluntário entende e aceita o procedimento, incluindo os efeitos adversos possíveis. Nota: Os critérios de inclusão específicos para este protocolo são idade > 18 anos e a vacinação de BCG documentada. Critérios de inclusão podem variar consoante a pergunta de pesquisa (ou seja, um critério de inclusão adicionais pode ser uma prova do TST positiva).</li>
	<li>Use uma solução pronta de PPD para uso humano [20 tuberculina unidades (TU) /mL]. Desinfecte a tampa de borracha do frasco com um algodão embebido em álcool.</li>
	<li>Preparar o local de injeção<ol>
<li>Localize o local da injeção no lado ventral do antebraço do voluntário.</li>
		<li>Coloque o braço palm-up sobre uma superfície lisa e escolha uma área no terço superior do antebraço, cerca de 5 a 10 cm da articulação do cotovelo. Afaste-se das cicatrizes, veias ou pele danificada.</li>
		<li>Desinfete a área usando um cotonete alcoólico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a solução-PPD<ol>
<li>Use uma seringa 1 mL estéril com 27-30G/short (por exemplo, 12 mm) fixada a agulha.</li>
		<li>Delicadamente, misture e aspire 0,1 mL da solução de PPD. Certifique-se de que não há nenhuma bolha visível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injeção intradérmica de PPD Nota: Este passo descreve como executar um único depoimento de PPD, mas vários depoimentos de PPD no mesmo braço é possível. No entanto, isso pode exigir aprovação ética específica.<ol>
<li>Estique a pele e aponte a agulha em um ângulo de 5-15° para a pele com o bisel voltado para cima.</li>
		<li>Insira a ponta da agulha na camada dérmica da pele e verifique se que a ponta está quase visível através da epiderme.</li>
		<li>Injecte lentamente 0,1 mL da solução PPD. Nota: Se administrado corretamente, uma pápula pálida de 6-10 mm aparecerá imediatamente. A pápula desaparece após cerca de 10 min.</li>
		<li>Ao fazer dois ou mais depoimentos, aponta para uma separação máxima (5-10 cm) dos sites de injeção, mantendo-se em uma boa distância da área de cotovelo e pulso. Nota: Isto evita que um potencial confluência da resposta teste de pele e permite o posicionamento ininterrupto de duas câmaras de sucção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. avaliação da reação da pele - dia 3
<ol><li>Após 48-72 h, observe o tamanho da reação da pele. Medir o endurecimento (inchaço) e não a Eritema (vermelhidão) da reação.</li>
	<li>Palpar o difícil inchaço usando os dedos e, em seguida, marque as bordas da induração usando uma caneta esferográfica. Use uma régua para medir o diâmetro de induração e observe o resultado em mm. Nota: Uma leitura do tamanho da induração pode orientar a escolha do diâmetro do orifício para a câmara de sucção.</li>
</ol>3. aspiração Blister indução - dia 7
<ol><li>Monte a unidade de dispositivo de sucção. Nota: As unidades de dispositivo de sucção são bombas de vácuo com câmaras anexadas para indução de sucção da bolha. O dispositivo utilizado nesta demonstração é feito, mas unidades de dispositivo de sucção também estão disponíveis comercialmente. A bomba deve ser ajustável dentro do intervalo de -20 a-40 kPa e fornecer uma pressão negativa constante e de confiança. Aprovação ética regional deve ser obtida antes da experimentação usando esse método.<ol>
<li>Primeiro, prepare a câmara de sucção, montar a placa de orifício inferior e a placa de janela com a câmara e a mangueira de conexão. Fixe a mangueira de conexão de câmara firmemente para a bomba de vácuo. Nota: As câmaras devem incluir uma placa inferior com um buraco para a indução da bolha, que deve ser apropriado para o contato com a pele humana, e uma placa superior com uma janela, que permite o acompanhamento visual da bolha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine o diâmetro do orifício ideal da placa de orifício em relação ao tamanho da reação da pele; Quanto maior o tamanho do orifício, quanto maior a bolha.</li>
	<li>Desinfectar a pele do voluntário e a placa de orifício usando cotonetes de álcool.</li>
	<li>Anexe a câmara de sucção da pele.<ol>
<li>Certifique-se de que o braço do voluntário está descansando confortavelmente.</li>
		<li>Certifique-se que o orifício na placa inferior da câmara de sucção está situado sobre a reação de PPD, para que o centro da reação da pele é visível.</li>
		<li>Fixar a câmara vagamente usando cintas: quando a pressão negativa é aplicada, a câmara irá aderir à pele e manter a sua posição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligue o dispositivo de sucção e ajustar a pressão a-20 kPa.</li>
	<li>Após 30 min, aumente a pressão negativa de-25 kPa.</li>
	<li>Depois de 60 min, aumente ainda mais a pressão negativa a-30 kPa.</li>
	<li>Manter a pressão a-30 kPa até uma bolha totalmente formada. Certifique-se de que as pressões negativas previstas no presente protocolo são específicas para um instrumento personalizado. Pode ser necessário ajustar a pressão ligeiramente ao aplicar o protocolo em outras configurações. Nota: A fase de indução da bolha varia de 60 a 180 min (1-3 h) com a formação de bolha real ocorrendo dentro de 30 min. o último que empolar está frequentemente associada uma sensação de coceira. As bolhas podem ocorrer como única ou múltiplas bolhas se fundem. Se a ruptura da bolha ou hemorragia ocorre, é aconselhável terminar a indução da bolha, lentamente, liberando a pressão.</li>
	<li>Depois que a bolha totalmente formada, liberar a pressão e remover cuidadosamente a câmara de sucção da pele sem romper a bolha.</li>
	<li>Aplique um curativo macio na área de pele circundante e coloque uma tampa dura (por exemplo, de um tubo de plástico de 50 mL) sobre a bolha.</li>
	<li>Fixe a tampa com fita cirúrgica anti-alérgicos, seguida de um curativo macio e elástico.</li>
	<li>Instrua o voluntário para evitar excessiva tensão física na área da bolha para o próximo 12-24 h.</li>
</ol>4. colheita de líquido da bolha - dia 8
<ol><li>No dia 8th , delicadamente Retire o curativo protetor e desinfectar o blister com spray de desinfecção da pele.</li>
	<li>Use uma seringa estéril de 2 mL com agulha 23G para colher o conteúdo da bolha. Insira a agulha no lado superior/lateral do telhado da bolha e Aspire lentamente o líquido. Evite tocar o assoalho da cavidade, mas certifique-se de colher todo o fluido.</li>
	<li>Aplique um curativo sobre a colapso da bolha.</li>
	<li>Transfira o líquido da bolha para um tubo estéril. Anote o volume.</li>
	<li>Gire o líquido da bolha para baixo a 600 x g, utilizando uma centrífuga de mesa para 4 min.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para outro tubo e ressuspender as células em 500 µ l do meio celular. Nota: As células agora estão prontas para contar e ainda mais análise. Sobrenadantes podem ser armazenados em -20 a-80 ° C até o uso.</li>
</ol>5. as análises de sucção da bolha, células e fluidos
Nota: Fornecer instruções para a análise de células e fluidos obtidos de sucção bolhas na pele não é no âmbito do presente protocolo. No entanto, a fim de proporcionar resultados representativos para este relatório, mancha intracelular fluxo cytometry e multiplex análises foram realizadas. A metodologia é descrita em breve abaixo.
<ol><li>Citometria de fluxo<ol>
<li>Estimular as suspensões de 1 x 105 células frescas isoladas de sucção bolhas de 1 voluntário BCG-vacinados com 10 µ g/mL de PPD e incube as celulas a 37 ° C e 5% CO2. Inclua células unstimulated para uma incubação paralela.</li>
		<li>Estimular as suspensões 1 x 106 PBMCs obtidos de 1 voluntário BCG-vacinados com 10 µ g/mL de PPD e incubar a mistura a 37 ° C e 5% CO2. Inclua células unstimulated para uma incubação paralela.</li>
		<li>Após 2 h, tratar todas as células com Brefaldin A e monensina e incube-os durante 6 h a 37° C.</li>
		<li>Manche as células com um painel de Live/mortos-mancha-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 e anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>Incluem FMO controles no painel PBMC.</li>
		<li>Realizar uma análise do fluxo cytometric com um citômetro de fluxo e analisar os resultados usando software relevante.</li>
		<li>Portal sobre produção de citocina CD3 + CD4 + CD8-subconjuntos usando a seguinte estratégia associada: camisolas - > viável CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + ou IL-2 +.</li>
		<li>Portão em populações de células efetoras memória usando a seguinte estratégia associada: camisolas - > viável CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Calcule os perfis cytokine individuais usando gating booleano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manifestações de liberação de citocinas<ol>
<li>Para uma demonstração de uma citocina lançamento na vivo, use uma multiplex análise para quantificar os níveis de Il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-13 no fluido descongeladas bolha sucção obtido de 4 voluntários.</li>
		<li>Para uma demonstração de uma liberação de citocinas por células obtidas de sucção bolhas ex vivo, uso fresco da bolha sucção células e PBMCs obtidos de 1 voluntário BCG-vacinados.</li>
		<li>Infectar o PBMC e sucção da bolha células com 100 unidades de formadoras de Colônia (UFC) de Mtb H37Rv e incube-os por 4 dias.</li>
		<li>Usar uma análise multiplex para quantificar os níveis de Il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-13 em todos os sobrenadantes de cultura.</li>
		<li>Ajuste as medições acima da faixa de cálculo do ensaio para o limite superior de cálculo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Este manuscrito descreve um procedimento prático para o estudo da memória humana imune respostas na vivo, usando a colheita de recordação e a célula antígeno cutâneo por indução de sucção da bolha. TST foi usado como um exemplo de deposição de antígeno intradérmico e BCG-vacina recall. Finalmente, um exemplo de caracterização de espécime SB por análise de fluxo cytometric e multiplex citocina foi fornecido, demonstrando que aproximadamente um terço das células SB foram antígeno-específicas polifuncionais T-células do fenótipo memória efetoras.
Os passos críticos do presente protocolo incluem a técnica de injeção intradérmica, a indução de sucção da bolha e a punção da bolha. Em primeiro lugar, uma correcta deposição intradérmica exige pessoal treinado. Uma deposição incorreta pode levar a resultados subótimos. PPD é geralmente um antígeno cutâneo seguro e bem conhecido, mas sua composição pode variar entre fabricantes, limitando a sua comparabilidade13,20. Este relatório fornece instruções para um único depoimento intradérmico de 2 TU e opcionalmente dois depoimentos paralelos (2 x 2 TU), que podem exigir a aprovação ética adicional. No entanto, outros estudos têm usado 10 TU, que aumentam a probabilidade de uma reação de pele forte10,21. Durante o passo de indução de SB, pequenos aumentos gradual na pressão negativa irão reduzir o risco de hemorragia e bolha de ruptura. As chances de contaminação com células vermelhas do sangue ou leucócitos do sangue são geralmente baixa2. A técnica de punção asséptica impede a contaminação microbiana e evitando o contato entre a agulha de punção e o chão da bolha cutâneo reduz impurezas de detritos ou residente da pele células. No entanto, alguns pesquisadores preferem colher líquido SB aplicando uma pressão de rolamento para a bolha perfurado10. Pode ser necessário perfurar os septos dentro da bolha. A técnica de SB em si é minimamente invasiva; SBs recolhidos curam sem deixar cicatrizes e infecções são muito raras. 2 no entanto, pode ocorrer algum grau de hipo-pigmentação e indução de SB provavelmente deve ser evitada em pessoas com antecedentes de cicatrizes coloidais.
Limitações técnicas incluem célula total baixo rendimento e, consequentemente, poucas opções para armazenamento a longo prazo. Relações entre o rendimento de leucócito, respostas clínicas do TST, o tamanho da bolha e contaminação de eritrócitos tem sido exaustivamente descrito em outra parte2,10. Nas BCG-recordar experiências aqui apresentadas (Figura 1), o rendimento total médio de cada bolha era 50.000, implicando uma montagem experimental em pequena escala usando essas células, especialmente se SBCs são estudados só15. No entanto, a população de células T específica em uma amostra de SB principalmente excede o que é encontrado em amostras PBMC em ambas as contagens de célula relativa e absoluta. No exemplo apresentado na Figura 2, o número de triplo-positivos específicos PPD-células T em uma amostra de 100.000 células SB foram mais de 2 x maior que o número encontrado em 1 x 106 PBMCs do mesmo doador (dados não mostrados). Uma pontuação de visual da reação TST é o método clínico mais comum para a avaliação da memória de M. tuberculosis . Digno de nota, a reação imunológica adaptativa subjacente não pico ao mesmo tempo como a reação de pele clínica2,21. Não tudo BCG-vacinados ou Mtb-indivíduos expostos irão desenvolver fortes reações do TST e estratégias para a classificação e a manipulação das amostras dos TST não-respondedores, bem como uma sensibilização micobacteriana preexistente na população estudada, precisam ser considerados antes de iniciar um julgamento de recordação usando esse método. Também, em amostragem de SB e marcando visual, existe um potencial para um viés teórico em indivíduos com respostas de pele reduzida devido a global ou relacionados com pele prejudicada a imunidade, como visto, por exemplo, na infecção pelo HIV e certos grupos etários2, 13,18,20. Além disso, um reforço imunológicos da reação TST com testes repetidos é conhecidos20,22. No entanto, os fenótipos de célula SB permanecem bastante constantes quando TSTs são repetidas10. Esta observação apoia o papel de recordação do SB em estudos longitudinais de respostas imunes de celular.
Para imunologistas de células T, recordação do SB permite a colheita de altas frações de células antígeno-específicas. No entanto, o tempo do SB para uma amostragem de um depósito de PPD é crítico, tanto a composição celular e o microambiente cytokine mudar ao longo do tempo. Neste protocolo, bolhas eram induzido 7 dias pós-desafio e as células isoladas principalmente CD4 + efetoras memória T-células incluindo frações elevadas de células com uma expressão de IFN-γ e TNF-α IL-2 de co. Estas observações estão de acordo com estudos anteriores descrevendo como células T ativação, proliferação e diferenciação ocorre na pele PPD-aprontadas2,15,21. Os estudos cinéticos SB em indivíduos PPD-sensibilizadas sugerem que a resposta inicial de pele inespecífica; no entanto, já nos primeiros dias após o PPD-desafio, a resposta torna-se dominado por células CD4 + T-(ambos os fenótipos de memória de memória e efetoras centrais foram descritos) e, depois de 3 dias, a resposta é dominada por altas frações de PPD-específicas do cytokine produzindo células T CD4 +2,8,10,15,21. Esta resposta adaptativa cytokine permanece detectável por mais de 2 semanas2,8,10,23. Post do dia 7-TST parece ser o ponto de tempo mais ideal para a coleção do cytokine produzindo memória CD4 + células T2. No entanto, outros pontos de tempo podem, naturalmente, ser relevantes dependendo do antígeno e a resposta de interesse. De notar, em um estudo, a resposta adaptativa de PPD tem sido relatada até o máximo, um pouco mais cedo, com uma diminuição da secreção de citocinas pró-inflamatórias já em 5 dias post-TST10.
Fluido de SB contém níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias e de outras proteínas mostradas para ser representante do microambiente pele15,24. Estudos de cinética mostraram que TNF-α e IFN-γ níveis no fluido pico SB depois de 3 dias ao pico de níveis de IL-2 após 7 dias2,10, provavelmente refletindo a predominância de respostas adaptáveis nesta fase posterior. Porque as células SB foram registrados na vivo, eles exibem uma liberação de citocinas espontânea elevada, bem como um potencial para uma versão específica sobre restimulation (Figura 3 e 4).
Este relatório concentra-se na imunidade de células T CD4 +. Como demonstrado na Figura 2, a maioria das células-T isoladas foram de fato CD4 +, enquanto não havia quase nenhum CD8 + células T na sucção da bolha fluido. Isto está em consonância com outros estudos de PPD SB-Lembre-se, relatando proporções baixas e uma inferior capacidade migratória de CD8 + células T em comparação com as células T CD4 +2,8,10,de23. Uma caracterização mais da contribuição CD8 + seria preferível; no entanto, isso está além do escopo deste relatório.
As células T são consideradas essenciais para o controle imune de Mtb; no entanto, tem sido difícil identificar uma correlação confiável da proteção refletida na resposta imune adaptativa de sangue25,26. Neste bloqueio severamente dificulta o desenvolvimento de novas vacinas de TB, como não há atualmente nenhuma alternativa aos ensaios de eficácia de grande e muito dispendiosa27. Os desenvolvedores de vacina TB determinam imunogenicidade da vacina avaliando transitórias e pequenas mudanças nas populações de células T vacina específica no sangue28,29. No entanto, é questionável se a pequena fração de células T antígeno-específicos encontradas no sangue em circulação é relevante (ou seja, capaz de migrar para o local de uma infecção e representante de controlar o microambiente de T-celular-ricos Mtb) 27 , 30 , 31 .
Baseado em estudos anteriores e os dados aqui apresentados, o modelo de recuperação cutânea SB representa um potencial inexplorado para o estudo de células-T de vacina específica. Não só o modelo permite um recall de uma vacina resposta gerada décadas, também permite a avaliação da memória verdadeira potencial em um contexto de tecido-específica15,18,19,21. Romance, testes específicos da pele, que inclui antígenos também compostos de vacinas de TB de subunidade de candidato, sugerir novas oportunidades para avaliação de vacina usando este modelo28,32. Além disso, transcriptomic análises sugerem que uma célula – mediada por resposta imune gerada em pele PPD-desafiado é semelhante à resposta encontrada no Mtb-infectados pulmão18.
Enquanto biópsias de pele soco também permitem uma colheita de células da pele e fornecem informações espaciais, em comparação com amostragem de SB, o método é mais invasivo e requer processamento mecânico ou enzimático para preparar suspensões de célula única33. Medições de marcadores citocinas e células são comparáveis entre os dois métodos de2,10.
O método de sucção da bolha já foi aplicado em muitas áreas de pesquisa médica, além de Dermatologia, sozinho ou em combinação com um desafio de pele local ou sistêmica. Exemplos incluem estudos de sepse, doença linfoproliferativa associada a vírus de Epstein - Barr, neuropatia diabética, efeitos de ingestão de glicocorticoide e testes em humanos teste de anticorpos terapêuticos ou modelos para terapias T-célula-alvo10 ,34,35,36,37,38.
Do ponto de vista terapêutico, o método de recuperação cutânea SB oferece vantagens exclusivas para estudar a memória central de células T potencial e -de ambos um biológico e técnica do ponto de vista, a pele parece oferecer uma amostragem relevante do compartimento2, 15,18,19,21. Em particular, comparado a amostragem tradicional, passiva circulantes de PBMC, o método de recuperação cutânea SB permite o estudo de células-T que provaram que a capacidade de migrar a partir do nó de linfa em resposta ao seu antígeno relevante e completar o local expansão e diferenciação em um tecido-específica no vivo contexto15,18,19,21.
Em conclusão, o modelo demonstrou que aqui pode ser relevante para os investigadores no campo da imunidade adaptativa humana e agentes de direcionamento de células T (ou seja, na investigação de doenças infecciosas Vacinologia ou câncer). O modelo TST aplicado neste protocolo é, naturalmente, de especial relevância no campo da Vacinologia TB. No entanto, o conceito básico deste modelo é altamente aplicável em outros campos de pesquisa.

Um pele SB é uma bolha induzida artificialmente, o que permite a colheita de células e fluido diretamente da pele. A técnica de criar SBs por vácuo é uma ferramenta bem conhecida no campo da dermatologia, usado para o estudo da Imunologia da pele na saúde e na doença,1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. este relatório demonstra como a técnica de SB combinada com recuperação antigênica cutânea (método de recuperação cutânea SB) pode fornecer insights diretos em respostas imunes adaptáveis em vivo.
O princípio por trás da indução de SB é simples: uma ligeira depressão é aplicado a uma pequena área da pele. A pressão negativa eventualmente forçará a epiderme para separar da derme, criando uma bolha local preenchida com líquido e células de2,1,9. O líquido da bolha pode ser colhido por uma punção aspirativa por agulha fina e o conteúdo pode ser usado para mais estudo em vitro.
Nos últimos anos, tem havido um crescente interesse no método para o estudo na vivo respostas imunes diferentes doenças restringidas a pele10,11SB. O estudo da imunidade adaptativa em humanos é limitado pelo fato de que as células e citocinas de interesse são amostradas de sangue periférico, porque uma amostragem invasiva do linfonodo ou do tecido da mucosa gastrointestinal pode ser antiético e inaceitável. Um exemplo é o estudo da memória humana long-lived células T respostas após vacinação12. Em tais ensaios, a amostragem de células-T relevantes pode ser um grande desafio, porque a população relevante de células que medeiam a imunidade reside no tecido linfoide, e apenas um número muito limitado de células T específicas circula no sangue periférico.
A técnica de SB oferece uma oportunidade única para o estudo de células T de memória e outras populações de células específicas. Após a inoculação cutânea do antígeno, células T específicas para o antígeno são recrutados de seus esconderijos linfoides na pele e pode facilmente ser amostrados de SB. Os aplicativos de pesquisa e metodologia deste modelo de recuperação cutânea foram descritos por Akbar et al em 2013,2. Um antígeno comumente usado para retirada de pele é o derivado de proteína purificada comercialmente disponíveis (PPD) de micobactérias usadas para executar um teste cutâneo (TST) de tuberculina13, onde o PPD é injetado na camada dérmica da pele. Em indivíduos com uma memória imunológica existente para PPD [por exemplo, indivíduos com uma infecção de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ou uma vacinação prévia de Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], a deposição de antígeno resulta em um Lembre-se resposta com a migração para a pele e na vivo expansão clonal de células T CD4 + PPD específico2,11,14,15. Como resultado, altas frações de PPD específico polifuncionais células T CD4 + se acumulam na pele pronta para amostragem de SB. T-células coletadas por esse método provaram para ser robusto e são suficientemente abundantes para ser caracterizada por uma variedade de imunoensaios e por um longo prazo na vitro cultura15. Assim, o modelo de recuperação cutânea e a indução de SB podem provar um valioso método para estudar na vivo células T respostas por análises ex vivo , e aumento do conhecimento desta abordagem pode beneficiar pesquisadores com interesses em imunologia celular e Vacinologia.
Este relatório fornece o primeiro guia passo a passo sobre como induzir bolhas sucção na pele humana em pele PPD-injetado. O modelo de recuperação de antígeno cutâneo é demonstrado usando o TST em voluntários vacinados BCG. Finalmente, a análise relevante ex vivo das células e citocinas isoladas por SB é exemplificado. Características fenotípica e funcionais de células T específicas PPD obtidas pelo método de SB são minuciosamente descrito em outra parte2,10,11,16,17, 18 , 19. este relatório visa discutir os aspectos práticos e imunológicos da metodologia para facilitar a aplicação desta técnica por outros grupos de pesquisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

Recolhimento do antígeno cutâneo modelos permite para estudos da memória humana respostas em vivo. Quando combinado com indução de sucção da bolha (SB) de pele, este modelo oferece acessibilidade às populações raras do representante de células T antígeno-específicas de resposta a memória celular, bem como o cytokine microambiente em situ.
Este relatório descreve o procedimento prático de um recall cutâneo, uma indução de SB e uma colheita de células T antígeno-específicas. Para exemplificar o método, o teste cutâneo de sensibilidade é usado para recuperação antigênica em indivíduos que, antes deste estudo, foi submetido a uma vacinação de Bacillus Calmette-Guérin contra uma infecção com Mycobacterium tuberculosis. Finalmente, são fornecidos exemplos de multiplex e fluxo cytometric análises de amostras de SB, ilustrando a altas frações de antígeno-específicas polifuncionais células CD4 + T disponíveis por este método de amostragem em comparação com células isoladas do sangue.
O método descrito aqui é seguro e minimamente invasiva, oferece uma oportunidade única de estudar ambas as respostas de imune inata e adaptativa na vivoe pode ser benéfico para uma ampla comunidade de pesquisadores que trabalham com humanos e imunidade mediada por células respostas de memória, no contexto do desenvolvimento de vacinas.

Oito voluntários adultos saudáveis (idade mediana: variam de 30 anos,: 26-43 anos) com uma vacinação de BCG anterior documentada (tempo médio de vacinação BCG: faixa de 5,5 anos,: 1-30 anos) foram incluídos. Os participantes foram desafiados por via intradérmica com 2 TU de PPD, seguido por uma avaliação do TST no dia 3. SBs foram induzidas no dia 7 e colhidas no dia 8, e todas as bolhas foram levantadas usando câmaras de sucção da bolha com diâmetros de orifício de 10 mm. Sete indivíduos receberam 2 inoculações de PPD separadas simultaneamente no mesmo braço seguido por 2 induções paralelas de SB (consulte a nota sobre vários depoimentos de PPD passo 1.4 no protocoloa seguir). Sangue periférico foi desenhado no dia 7 para o plasma e um isolamento de PBMC por centrifugação gradiente de densidade. Sobrenadantes de plasma e fluido do SBs foram armazenadas a-20 ° C. As pilhas novas SB (SBCs) foram contadas usando microscopia e mancha de nigrosine.
As respostas clínicas do TST e rendimento SBC são apresentadas na Figura 1. O tamanho médio da indurações TST foi 10,25 mm (intervalo: 0 - 20 mm) e o número de célula mediana por bolha era 50.000 (intervalo: 15.000-210.000 células, o número de bolhas: 15). Dois dos voluntários não tinham nenhuma resposta clínica em algum dos 2 TSTs e um correspondente rendimento baixo célula total de 15.000 células/bolha. O rendimento da célula foi associado com a resposta clínica média do TST (Spearman r = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Figura 1 : Rendimento de célula de bolha sucção. (um) este painel mostra um representante microscopia das células manchadas de nigrosine isolado do SBs levantadas 7 dias post-TST. (b) este painel mostra as relações entre a induração TST média (mm) e o rendimento médio da célula (/blistern) em 8 voluntários vacinados BCG (número de bolhas = 15). Os pontos representam medidas individuais. Por favor, note que os 2 pontos se sobrepõem como 2 voluntários ambos tinham uma induração TST de 0 mm e um rendimento de célula de 15.000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para demonstrar a caracterização fluxo cytometric SB, SBCs foram obtidos de um voluntário de 43 anos que tinha sido vacinados BCG 30 anos antes e tinha nenhuma exposição conhecida para Mtb. O SBCs foram isolados após a indução de uma bolha única ( endurecimento: 1,4 mm/100.000 SBCs). A Figura 2 mostra a parcela representativa da coloração de citocinas intracelulares do SBCs contra PBMCs.
Neste voluntário, a fração de CD3 + CD4 + CD8-SBCs aumentou de 67% nas células unstimulated para > 90% em cima de um PPD em vitro restimulation, Considerando que a fração de CD3 + CD4 + CD8-PBMCs permaneceu constante (~ 51%, Figura 2). Mais de 92% do em vitro PPD-, bem como os CD3 + CD4 + CD8-SBCs unstimulated, foram do tipo memória efetoras (CCR7 - CD45RA-, dados não mostrados). As frações globais de CD3 + CD4 + CD8-células específicas induzidas pela PPD-estimulação foram maiores nos SBCs em comparação com os PBMCs (33.1 vs. 0,2%, unstimulated amostras subtraídas). No PBMC, as frações de polifuncionais PPD específico CD3 + CD4 + CD8-células foram todos < 0,05%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Figura 2 : Parcelas de citometria de fluxo representativo da SBCs contra PBMCs. Painéis a e b mostram representativa densidade unstimulated parcelas das populações de CD8 + e CD4 + em (um) vs. PPD-estimulada PBMCs e (c) SBCs. painéis b e d lento de citocinas intracelulares coloração em PPD-estimulada CD3 + CD4 + CD8-células para (b) PBMCs parcelas e (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver um maior versão desta figura.</a>
Como esperado, CD3 + CD4 + CD8-SBCs foram registrados na vivo, ilustrado por uma elevada proporção das células mancha para upregulated citocinas (12%), com as citocinas predominantes, sendo o TNF-α e IFN-γ. No entanto, em cima de PPD-estimulação, o cytokine secretoras células deslocado para um triplo ou duplo-positivo IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%) e IFN-γ + TNF-α + (15%) perfil (Figura 3b, PBMC perfis do mesmo doador são incluídos para comparação no Figura 3a). Os perfis de expressão de citocinas para subconjuntos de células T de memória CD4 + PPD-estimulada effector (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) eram comparáveis à população-CD3 + CD4 + CD8 apresentada nas figuras 2 e 3 (dados não mostrados).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Figura 3: perfis de citocinas para CD4 + PPD-estimulada e unstimulated SBCs contra PBMCs.  Estes painéis mostram perfis individuais para a produção de citocinas (um) CD3 + CD4 + CD8-PBMC células e (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. As barras representam fracções de perfis cytokine antígeno-específicas em células unstimulated (barras brancas) e após uma estimulação em vitro com PPD (barras coloridas).
Para explorar o fluido SB como fonte de informações sobre o microambiente de citocinas no local do teste a pele, os níveis de citocinas foram medidos no fluido colhido do SBs induzido 7 dias post-TST (figura 4a). Os níveis medianos de IFN-γ, TNF-α e IL-2 foram 339 pg/mL, 19 pg/mL e 1 pg/mL, respectivamente (n = 6). Os níveis de plasma eram geralmente muito baixos. Células isoladas de SBs produziram níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias ex vivo (figura 4b). Titulações dos SBCs de 1 voluntário foram cultivadas por 4 dias na presença de virulenta de M. tuberculosis ± PBMCs autólogos. Os níveis de IFN-γ foram > 30-fold maior em culturas contendo SBCs, independentemente da presença de PBMC.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Figura 4 : Os níveis de citocinas no fluido de SB, plasma, e MTB -infectados sobrenadantes cultura. (um) este painel mostra níveis de citocinas no plasma e sobrenadantes fluidos SB de 6 voluntários vacinados BCG. As barras representam os níveis de citocina mediana; as barras de erro representam o intervalo. (b) este painel mostra os níveis de citocinas em sobrenadantes de 4 paralelo 600 µ l ex vivo 4 dias culturas de 1 x 106 PBMCs (barras pretas), 1,75 x 105 SBCs (barras brancas) e 1 x 106 PBMCs cravado com 0,5 ou 1,75 x 10 5 SBCs (barras cinzentas) infectados com Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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