Name: a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Mads Radmer Jensen por sus consejos prácticos y académicos; Lau Lindqvist y Kaare Svejstrup para proporcionar conocimientos técnicos; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt y Solveig W. Harpøth para su asistencia técnica; el personal de la clínica ambulatoria de Gentofte TB para su formación en la administración de PPD; y todos los voluntarios por participar en el estudio. Este proyecto es financiado por el programa europeo Comisión H2020 [número de concesión TBVAC2020 643381], y nos gustaría agradecer a socios de Consorcio para las discusiones fructíferas.

Todos los métodos descritos a continuación, incluyendo el uso de voluntarios humanos, han sido aprobados por el Comité danés sobre ética de investigación de la salud (H-15002988) y la Agencia danesa de protección de datos (jr.nr. 2015-57-0102). PPD debe ser un producto certificado aprobado para uso humano y administrado en la dosis correcta proporcionada por el fabricante. Cualquier desviación en la dosis o la administración puede necesitar aprobaciones éticas adicionales y voluntarios deben dar su consentimiento informado.
1. prueba cutánea de tuberculina de
<ol><li>Obtener el consentimiento oral y escrito de los voluntarios. Antes de la inyección, asegúrese de que el voluntario comprenda y acepta el procedimiento incluyendo los posibles efectos adversos. Nota: Criterios de inclusión específicos para este protocolo son edad > 18 años y una vacunación BCG documentada. Criterios de inclusión pueden variar dependiendo de la pregunta de investigación (es decir, un criterio de inclusión adicional podría ser evidencia de TST positiva).</li>
	<li>Use una solución preparada de PPD para uso humano [20 tuberculina (TU) las unidades/ml]. Desinfectar el tapón de goma de un frasco con un algodón embebido en alcohol.</li>
	<li>Prepare el sitio de inyección<ol>
<li>Localizar el sitio de la inyección en el lado ventral del antebrazo de los voluntarios.</li>
		<li>Coloque el brazo Palma-para arriba sobre una superficie lisa y elegir una zona en el tercio superior del antebrazo, aproximadamente 5-10 cm de la articulación del codo. Manténgase alejado de cicatrices, venas o piel dañada.</li>
		<li>Desinfectar la zona con un algodón embebido en alcohol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare la solución de PPD<ol>
<li>Utilice una jeringa 1 mL estéril con un 27-30G/corto (p. ej., 12 mm) fijada la aguja.</li>
		<li>Suavemente mezcle y aspirar 0.1 mL de la solución PPD. Asegúrese de que no hay ninguna burbujas visibles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyección intradérmica de PPD Nota: Este paso describe cómo realizar una sola deposición de PPD, pero múltiples declaraciones de PPD en el mismo brazo es posible. Sin embargo, esto puede requerir aprobación ética específica.<ol>
<li>Estire la piel y punto de la aguja en un ángulo de 5-15° a la piel con el bisel hacia arriba.</li>
		<li>Inserte la punta de la aguja en la capa dérmica de la piel y asegúrese de que la punta es casi visible a través de la epidermis.</li>
		<li>Lentamente Inyecte 0.1 mL de solución de PPD. Nota: Si se administra correctamente, un pálido pápula de 6-10 mm aparecerá inmediatamente. La pápula desaparece después de aproximadamente 10 minutos.</li>
		<li>Cuando dos o más declaraciones, busca una separación máxima (5-10 cm) de los sitios de inyección, manteniendo en una buena distancia de la zona del codo y la muñeca. Nota: Esto evita una posible confluencia de la respuesta de la prueba de la piel y permite el posicionamiento continuo de dos cámaras de succión.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. evaluación de la reacción de la piel - día 3
<ol><li>Después de 48-72 h, tenga en cuenta el tamaño de la reacción de la piel. Medir la induración (inflamación) y no el eritema (enrojecimiento) de la reacción.</li>
	<li>Palpe la hinchazón con los dedos y luego marque los bordes de la induración con un bolígrafo. Use una regla para medir el diámetro de la induración y anote el resultado en mm. Nota: Una lectura del tamaño de la induración que guíe la elección del diámetro del orificio para la cámara de succión.</li>
</ol>3. aspiración ampolla inducción - día 7
<ol><li>Montar la unidad de dispositivo de succión. Nota: Unidades de dispositivo de aspiración son las bombas de vacío con cámaras adjuntas para la inducción de ampolla de succión. El dispositivo utilizado en esta demostración es personalizado, pero unidades de dispositivo de succión también son disponibles en el mercado. La bomba debe ser ajustable dentro del rango de -20 a-40 kPa y proporcionar una presión negativa constante y confiable. Aprobación ética regional debe obtenerse antes de la realización de experimentos con este método.<ol>
<li>En primer lugar, preparar la cámara de succión de montaje de la placa de orificio inferior y la placa de la ventana con la cámara y la manguera de conexión. Conecte la manguera de conexión de cámara firmemente a la bomba de vacío. Nota: Las cámaras deben incluir una placa inferior con un agujero para la inducción de la ampolla, que debe ser apto para el contacto con la piel humana, y una placa superior con una ventana, lo que permite el control visual de la ampolla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinar el diámetro óptimo del orificio de la placa de orificio en comparación con el tamaño de la reacción de la piel; cuanto mayor sea el tamaño del orificio, más grande la ampolla.</li>
	<li>Desinfectar la placa orificio y la piel de los voluntarios utilizando hisopos de alcohol.</li>
	<li>Coloque la cámara de succión en la piel.<ol>
<li>Asegúrese de que descanse cómodamente brazo del voluntario.</li>
		<li>Asegúrese de que el agujero en la placa inferior de la cámara de aspiración está situado sobre la reacción de PPD para que el centro de la reacción de la piel es visible.</li>
		<li>Asegure la cámara ligeramente con las correas: cuando se aplica presión negativa, la cámara se adhieren a la piel y mantener su posición.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encender el aspirador y ajustar la presión de-20 kPa.</li>
	<li>Después de 30 min, aumentar la presión negativa de-25 kPa.</li>
	<li>Después de 60 min, aumentar aún más la presión negativa de-30 kPa.</li>
	<li>Mantenga la presión en-30 kPa, hasta una ampolla está completamente formada. Asegúrese de que las presiones negativas en este protocolo son específicas de un instrumento de medida. Puede ser necesario ajustar la presión ligeramente al aplicar el protocolo en otros ámbitos. Nota: La fase de inducción de ampolla oscila entre 60 y 180 min (1-3 h) con la formación de ampolla reales que ocurren dentro de los últimos 30 minutos que ampollar suele estar asociada con una sensación que pica. Las ampollas pueden presentarse una o varias ampollas de fusión. Si la ampolla ruptura o hemorragia se produce, se aconseja terminar la inducción ampolla liberando lentamente la presión.</li>
	<li>Después de que la ampolla está completamente formada, libere la presión y retire con cuidado la cámara de succión de la piel sin ruptura de la ampolla.</li>
	<li>Aplique un vendaje suave en el área circundante de la piel y colocar un casquillo duro (por ejemplo, de un tubo de plástico de 50 mL) sobre la ampolla.</li>
	<li>Asegure la tapa con cinta quirúrgica hipoalergénica seguido de un vendaje elástico suave.</li>
	<li>Instruir a los voluntarios para evitar excesiva tensión física en el área de blister para lo próximo 12-24 h.</li>
</ol>4. cosecha de líquido de la ampolla - día 8
<ol><li>El día 8, suavemente Retire el apósito protector y desinfectar la ampolla con vaporizador de desinfección de la piel.</li>
	<li>Utilice una jeringa estéril de 2 mL con una aguja de 23G para cosechar el contenido de la ampolla. Inserte la aguja en la parte superior lateral del techo de la ampolla y aspirar lentamente el líquido. Evite tocar el piso de la cavidad, pero asegúrese de que el líquido de la cosecha.</li>
	<li>Aplicar un apósito en la ampolla colapsada.</li>
	<li>Transferir el líquido de la ampolla a un tubo estéril. Tenga en cuenta el volumen.</li>
	<li>Girar el líquido de la ampolla hacia abajo a 600 x g utilizando una centrífuga de mesa para 4 minutos.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a otro tubo y resuspender el precipitado de células en 500 μl de medio de celular. Nota: Las células están listas para el conteo y más análisis. Sobrenadantes pueden almacenarse a -20 a-80 ° C hasta su uso.</li>
</ol>5. Análisis de la succión de las células y fluidos de la ampolla
Nota: Proporcionar instrucciones para el análisis de las células y el líquido Obtenido de ampollas de succión de la piel no está dentro del ámbito de este protocolo. Sin embargo, con el fin de proporcionar resultados representativos para este informe, tinción intracelular flujo cytometry y múltiplex se realizaron análisis. A continuación se describe brevemente la metodología.
<ol><li>Citometría de flujo<ol>
<li>Estimular la suspensiones de 1 x 105 células aisladas de ampollas de succión de 1 voluntario vacunados de BCG con 10 μg/mL de PPD e incubar las células a 37 ° C y 5% CO2. Incluyen sin estimular las células para una incubación paralelo.</li>
		<li>Estimular suspensión 1 x 106 PBMCs obtenida de voluntarios vacunados de BCG 1 con 10 μg/mL de PPD e incubar la mezcla a 37 ° C y 5% CO2. Incluyen sin estimular las células para una incubación paralelo.</li>
		<li>Después de 2 h, tratar todas las células con Brefaldin A y monensina e incúbelos durante 6 h a 37° C.</li>
		<li>Se tiñen las células con un panel de Live/Dead-mancha-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, CD45RA-anti-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 y anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>Incluyen controles de FMO en el panel PBMC.</li>
		<li>Realizar un análisis de citometría de flujo con un citómetro de flujo y analizar los resultados utilizando el software correspondiente.</li>
		<li>Puerta en el CD3 + CD4 + CD8-subconjuntos del cytokine producción usando la siguiente estrategia bloquea: camisetas - > viable CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + o IL-2 +.</li>
		<li>En poblaciones de células de memoria efectora usando la siguiente estrategia bloquea la puerta: camisetas - > viable CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Calcular perfiles de cytokine individuales utilizando control booleano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manifestaciones de liberación de citoquinas<ol>
<li>Para una demostración de un cytokine lanzamiento en vivo, utiliza un análisis multiplex para cuantificar los niveles de IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 y IL-13 en líquido de la ampolla de succión descongeladas Obtenido de 4 voluntarios.</li>
		<li>Para una demostración de una liberación de citoquinas por las células obtenidas de ampollas de succión ex vivo, las células de ampolla de succión fresco uso y PBMCs obtienen de voluntarios vacunados de BCG 1.</li>
		<li>Infectar la PBMC y succión de las células de la ampolla con 100 unidades formadoras de colonias (UFC) de Mtb H37Rv e incubar durante 4 días.</li>
		<li>Utilizar un análisis multiplex para cuantificar los niveles de IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 y IL-13 en los sobrenadantes de cultivo.</li>
		<li>Ajustar las mediciones sobre el rango de cálculo hasta el límite de cálculo superior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+Isolation+from+Human+Skin+for+Phenotypic+Analysis+and+Ex+Vivo+Cell+Culture.">Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Koskela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blister+fluid+and+serum+cytokine+levels+in+severe+sepsis+in+humans+reflect+skin+dysfunction.">Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).</li><li>Wada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+skin+blister+fluids+from+children+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease.">Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease.</a> The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).</li><li>Andersson, C., Rajala, T., S&#228;rkk&#228;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+models+for+epidermal+nerve+fiber+data.">Hierarchical models for epidermal nerve fiber data.</a> Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).</li><li>Ramshanker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Prednisolone+on+Serum+and+Tissue+Fluid+IGF-I+Receptor+Activation+and+Post-Receptor+Signaling+in+Humans.">Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).</li><li>Bouma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL20+neutralization+by+a+monoclonal+antibody+in+healthy+subjects+selectively+inhibits+recruitment+of+CCR6++cells+in+an+experimental+suction+blister.">CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este manuscrito describe un procedimiento práctico para el estudio de la memoria humana inmune respuestas en vivo, con cosecha de memoria y de la célula de antígeno cutáneo por la inducción de ampolla de succión. TST se utilizó como un ejemplo de deposición intradérmica del antígeno y el recuerdo de la vacuna BCG. Por último, un ejemplo de caracterización de muestras de SB por análisis de flujo cytometric y múltiplex del cytokine fue siempre, demostrando que aproximadamente un tercio de las células de SB fueron polifuncional específica de antígeno las células de T del fenotipo de memoria efectora.
Los pasos críticos de este protocolo incluyen la técnica de inyección intradérmica, la inducción de la aspiración de la ampolla y la ampolla perforaciones. En primer lugar, una correcta deposición intradérmica requiere a personal capacitado. Una deposición incorrecta puede conducir a resultados subóptimos. PPD es generalmente un antígeno cutáneo conocido y seguro, pero su composición puede variar entre fabricantes, limitar la comparabilidad13,20. Este informe proporciona las instrucciones de una sola deposición intradérmica de TU 2 y opcionalmente dos declaraciones paralelas (TU 2 x 2), que pueden requerir aprobación ética adicional. Sin embargo, otros estudios han utilizado TU 10, que aumentan la probabilidad de que una piel fuerte reacción10,21. Durante la etapa de inducción de SB, aumento gradual en la presión negativa reduce el riesgo de hemorragia y la ampolla de la ruptura. Las posibilidades de contaminación con glóbulos rojos o leucocitos de la sangre son generalmente bajos2. La técnica de punción aséptica previene la contaminación microbiana y evitando el contacto entre la aguja de punción y el suelo de la ampolla cutánea reduce impurezas de desechos o células residentes de la piel. Sin embargo, algunos investigadores prefieren cosechar líquido SB aplicando una presión balanceo a la ampolla pinchado10. Puede ser necesario perforar los tabiques dentro de la ampolla. La propia técnica de SB es mínimamente invasiva; SBs colapsados curan sin dejar cicatrices y las infecciones son muy raras. 2 sin embargo, puede ocurrir algún grado de la hypo-pigmentación e inducción SB probablemente debería evitarse en personas con antecedentes de cicatrización coloide.
Limitaciones técnicas incluyen la celda total bajo rendimiento y por lo tanto limitadas opciones para el almacenamiento a largo plazo. Las relaciones entre la producción de leucocitos, respuestas clínicas de TST, el tamaño de la ampolla y contaminación de eritrocitos ha sido minuciosamente descrito en otra parte2,10. En los experimentos de BCG-memoria presentados aquí (figura 1), la producción total promedio de cada ampolla era 50.000, lo que implica un montaje experimental en pequeña escala mediante estas células, sobre todo si SBCs son estudiados solo15. Sin embargo, la población de células T específica en una muestra de SB supera sobre todo lo que se encuentra en muestras PBMC en ambos recuento absoluto y relativo. En el ejemplo presentado en la figura 2, el número de triple positivo PPD específico células de T en una muestra de 100.000 células SB fueron más de 2 x mayor que el número encontrado en 1 x 106 PBMCs del mismo donante (datos no mostrados). Una calificación visual de la reacción de la TST es el más común método clínico para la evaluación de la memoria de M. tuberculosis . De la nota, la reacción inmunológica adaptativa subyacente no pico a la vez que la clínica piel reacción2,21. No todos vacunados BCG o Mtb-individuos expuestos desarrollará fuertes reacciones de TST y estrategias para la clasificación y manejo de muestras de TST no respondedores, así como una sensibilización micobacterias preexistente en la población de estudio, hay que considerar antes de iniciar un juicio de destitución mediante este método. También, en muestreo de SB y puntuación visual, existe una posibilidad de un sesgo teórico en individuos con las respuestas de la piel reducida debido al mundial o relacionados con la piel deterioraron inmunidad como se ve, por ejemplo, en infección por el VIH y determinados grupos de edad2, 13,18,20. Además, un impulso inmunológico de la reacción de TST con la prueba repetida es conocida20,22. Sin embargo, los fenotipos celulares de SB permanecen bastante constantes cuando TSTs repetida10. Esta observación apoya el papel de la memoria de SB en estudios longitudinales de la respuesta inmune celular.
Para inmunólogos de la célula de T, llamada SB permite la cosecha de altas fracciones de células específicas de antígeno. Sin embargo, la sincronización de SB para una muestra de una deposición de PPD es fundamental como la composición celular y el microambiente de citocinas cambian con el tiempo. En el presente Protocolo, las ampollas eran inducido 7 días post desafío y las células aisladas principalmente CD4 efectoras memoria + células de T incluyendo altas fracciones de células con la expresión de IFN-γ, TNF-α y IL-2. Estas observaciones están en consonancia con estudios anteriores que describen cómo la activación, proliferación y diferenciación de células T se produce en piel preparado PPD2,15,21. Estudios cinéticos de la SB en individuos sensibilizados PPD sugieren que la respuesta de la piel muy temprana es inespecífica; sin embargo, ya en los primeros días tras el desafío de PPD, la respuesta se convierte en dominado por células CD4 + T-(ambos fenotipos de memoria central memoria y efectoras se han descrito) y, después de 3 días, la respuesta está dominada por altas fracciones de Específicos de PPD cytokine producción de CD4 + células de T2,8,10,15,21. Esta respuesta adaptativa del cytokine siga siendo detectable por más de 2 semanas2,8,10,23. Día 7 post-TST parece ser el momento más óptimo para la colección de cytokine producción de células T de memoria CD4 +2. Sin embargo, otros puntos del tiempo, por supuesto, puede pertinentes dependiendo del antígeno y la respuesta de interés. De nota, en un estudio, la respuesta adaptativa del PPD se ha divulgado al máximo un poco antes con una disminución en la secreción de citoquinas pro-inflamatorias ya en 5 días post-TST10.
SB líquido contiene altos niveles de citoquinas proinflamatorias y otras proteínas que se muestra para ser representante de la piel microambiente15,24. Estudios de cinética han demostrado que TNF-α y IFN-γ niveles pico fluido SB después de 3 días al pico de los niveles de IL-2 después de 7 días2,10, que probablemente refleja el predominio de las respuestas de adaptación a esta etapa posterior. Porque las células SB han sido activados en vivo, que exhiben una liberación de citoquinas espontáneo elevado así como un potencial para un lanzamiento específico sobre restimulation (figura 3 y 4).
Este informe se centra en la inmunidad del T-cell de CD4 +. Como se demuestra en la figura 2, era la mayoría de los aislados linfocitos T CD4 +, mientras que no hubo casi CD8 + células de T en la succión de la ampolla líquido. Esto está en consonancia con otros estudios SB PPD-memoria Informe bajas proporciones y una inferior capacidad migratoria de células CD8 + T-comparado con CD4 + T células2,8,10,23. Era preferible una caracterización adicional de la contribución de CD8 +; sin embargo, esto está más allá del alcance de este informe.
Las células T se consideran esenciales para el control inmune de Mtb; sin embargo, ha sido difícil identificar una correlación confiable de la protección que se refleja en la respuesta inmune adaptativa del sangre25,26. Este obstáculo impide seriamente el desarrollo de nuevas vacunas TB, como en la actualidad no existe alternativa a eficacia grandes y muy costosos ensayos27. Los desarrolladores de vacunas TB determinan inmunogenicidad de la vacuna mediante la evaluación de cambios pequeños y transitorios en las poblaciones de células T de vacunas específicas en sangre28,29. Sin embargo, es cuestionable si la pequeña fracción de células T específicas de antígeno se encuentra en la sangre que circula es relevante (es decir, capaz de migrar al sitio de una infección y representante de la t-célula-rico microambiente controla Mtb) 27 , 30 , 31 .
Basado en estudios anteriores y los datos presentados en este documento, el modelo de recuperación cutánea SB representa un potencial sin explotar para el estudio de las células de T de vacunas específicas. No sólo el modelo permite un recuerdo de hace una décadas de respuesta generada vacuna, también permite la evaluación de la memoria cierta potencial en un contexto de tejidos específicos15,18,19,21. Novela, pruebas específicas de la piel, que incluyen antígenos también de candidatas a vacunas TB subunidad, sugieren nuevas oportunidades para la evaluación de vacuna usando este modelo28,32. Además, análisis transcriptómico sugieren que una célula – inmunorespuesta transmitida por generados en piel desafió a PPD es similar a la respuesta encontrada en la Mtb-infección pulmonar18.
Mientras que las biopsias del sacador de la piel también permiten una cosecha de células de la piel y proporcionan información espacial, en comparación con el muestreo de SB, el método es más invasivo y requiere tratamiento enzimático o mecánico para preparar suspensiones celulares solo33. Las mediciones de marcadores de cytokines y célula son comparables entre los dos métodos2,10.
El método de aspiración de la ampolla ya se ha aplicado en muchas áreas de la investigación médica además de Dermatología, ya sea solos o en combinación con un reto de la sistémica o local de la piel. Los ejemplos incluyen estudios de sepsis, enfermedad linfoproliferativa asociada a virus de Epstein - Barr, neuropatía diabética, efectos de la ingesta de glucocorticoides y ensayos humanos anticuerpos terapéuticos o modelos para terapias dirigidas de célula T10 ,34,35,36,37,38.
Desde un punto de vista terapéutico, el método de recuperación cutánea SB ofrece ventajas únicas para estudiar el potencial central de la memoria del T-cell y -de ambos biológicos y técnicos punto de vista la piel parece proporcionar un muestreo correspondiente compartimento2, 15,18,19,21. En particular, en comparación con el muestreo tradicional, pasivo de PBMCs en circulación, el método de recuperación cutánea SB permite el estudio de las células T que han demostrado la capacidad de migrar desde el nodo de linfa en respuesta a su antígeno correspondiente y completar el local expansión y diferenciación de un tejido específico en vivo contexto15,18,19,21.
En conclusión, el modelo demostrado aquí podría ser relevante para los investigadores en el campo de la inmunidad adaptativa humana y células T dirigida a agentes (es decir, en la investigación de enfermedades infecciosas vacunología o cáncer). El modelo TST aplicado en el presente Protocolo es, por supuesto, de especial relevancia en el campo de la vacunología de TB. Sin embargo, el concepto básico de este modelo es altamente aplicable en otros campos de investigación.

Un SB de piel es una ampolla artificialmente inducida, que permite la cosecha de las células y el líquido directamente en la piel. La técnica de levantar el SBs por vacío es una herramienta bien conocida dentro del campo de la dermatología que utiliza para el estudio de la inmunología de la piel en salud y enfermedad1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. este informe demuestra cómo la técnica SB combinada con recuerdo antigénico cutáneo (método de recuperación cutánea SB) puede proporcionar penetraciones directas en inmunorespuestas adaptantes en vivo.
El principio de la inducción de la SB es simple: un ligero vacío se aplica a un área pequeña de la piel. La presión negativa obligará eventualmente a la epidermis de la dermis, creando una ampolla local llenada de líquido y células de1,2,9. El líquido de la ampolla puede ser cosechado por una aspiración con aguja fina y el contenido puede ser utilizado para más estudio en vitro.
En los últimos años ha habido un creciente interés en el método del SB para el estudio de la respuesta inmune en vivo distintas enfermedades restringidas a la piel10,11. El estudio de la inmunidad adaptante en seres humanos está limitado por el hecho de que las células y citoquinas de interés se tomaron muestras de sangre periférica porque un muestreo invasivo del ganglio linfático o tejido mucoso gastrointestinal puede ser inaceptable y poco ético. Un ejemplo es el estudio de las respuestas de memoria larga vida humana células T después de la vacunación12. En estos ensayos, el muestreo de las células de T puede ser un gran desafío, porque la población relevante de las células que median la inmunidad reside en el tejido linfoide, y sólo un número muy limitado de las células de T específicas circula en la sangre periférica.
La técnica SB ofrece una oportunidad única para el estudio de las células T de memoria y otras poblaciones celulares específicas. Después de la inoculación cutánea de antígeno, las células T específicas para el antígeno son reclutados de sus escondites linfoides en la piel y fácilmente se pueden degustar de la SB. Las metodología y aplicaciones de investigación de este modelo de recuperación cutánea fueron descritas por Akbar et al. en 20132. Un antígeno utilizado para la recuperación de la piel es el derivado de proteína purificada comercialmente disponibles (PPD) de micobacterias que se utiliza para realizar una prueba cutánea (TST) de tuberculina13, donde el PPD se inyecta en la capa dérmica de la piel. En personas con una memoria inmunológica existente hacia PPD [p. ej., individuos con una infección de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) o una vacuna de bacilo Calmette-Guérin (BCG) anterior], la deposición de antígeno da lugar a una recordar la respuesta con la migración a la piel y una expansión clonal en vivo de PPD específicos de células CD4 + T2,11,14,15. Como resultado, altas fracciones de polifuncional PPD específico CD4 + células de T se acumulan en la piel lista para el muestreo de SB. Las células de T, recopiladas por este método han demostrado para ser robusto y son suficientemente abundantes para ser caracterizado por una variedad de inmunoensayos y a largo plazo en vitro cultura15. Así, el modelo de recuperación cutánea y la inducción de la SB pueden resultar un valioso método para el estudio en vivo T-cell responses análisis ex vivo , y mayor conocimiento de este enfoque puede beneficiar a los investigadores con intereses en Inmunología celular y vacunología.
Este informe proporciona a la primera guía paso a paso sobre cómo inducir a las ampollas de succión piel humana en piel inyección de PPD. El modelo de memoria antígeno cutáneo es demostrado usando el TST en voluntarios vacunados de BCG. Por último, el análisis relevantes ex vivo de las células y citoquinas aislado por SB es ejemplificada. Características fenotípicas y funcionales de células T específicas de PPD obtenidas por el método de SB son minuciosamente descritos en otra parte2,10,11,16,17, 18 , 19. este informe tiene como objetivo discutir los aspectos prácticos e inmunológicos de la metodología para facilitar la aplicación de esta técnica por otros grupos de investigación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

Recuperación de antígeno cutáneo modelos permite estudios de memoria humana respuestas en vivo. Cuando se combina con la inducción de ampolla de succión (SB) de piel, este modelo ofrece accesibilidad a raras poblaciones de representante de las células T antígeno específicas de la respuesta de la memoria celular como la citoquina microambiente en situ.
Este informe describe el procedimiento práctico de una recuperación cutánea, una inducción de SB y una cosecha de células T específicas de antígeno. Para ejemplificar el método, la prueba cutánea con tuberculina se utiliza para la recuperación antigénica en los individuos intervenidos, antes de este estudio, una vacuna de bacilo de Calmette-Guerin contra una infección con Mycobacterium tuberculosis. Finalmente, se proporcionan ejemplos de análisis cytometric múltiplex y flujo de muestras SB, ilustrando las altas fracciones de polifuncional específica de antígeno CD4 + células T disponibles por este método de muestreo en comparación con células aisladas de la sangre.
El método descrito aquí es seguro y mínimamente invasivo, ofrece una oportunidad única para estudiar tanto las respuestas inmunes innata y adaptativa, en vivoy puede ser beneficioso para una amplia comunidad de investigadores que trabajan con humanos y la inmunidad mediada por células respuestas de memoria, en el contexto del desarrollo de una vacuna.

Ocho voluntarios adultos sanos (edad promedio: 30 años, rango: 26-43 años) con una documentado vacunación anterior de BCG (mediana de tiempo de la vacuna BCG: 5,5 años, rango: 1-30 años) se incluyeron. Los participantes fueron desafiados por vía intradérmica con TU 2 de PPD seguida de una evaluación de TST el día 3. SBs fueron inducido en el día 7 y cosechado el día 8, y todas las ampollas fueron levantadas utilizando cámaras de aspiración de la ampolla con 10 mm de diámetro de orificio. Siete personas recibieron inoculaciones de PPD separados 2 simultáneamente en el mismo brazo seguido por 2 paralelas inducciones de SB (véase la nota sobre múltiples declaraciones de PPD debajo de paso 1.4 en el Protocolo). Sangre periférica fue dibujada en el día 7 de plasma y un aislamiento de PBMCs por centrifugación de gradiente de densidad. Plasma y el líquido sobrenadante de la SBs se almacenaron a-20 ° C. Células frescas de SB (SBCs) contaron usando microscopia y tinción nigrosine.
La respuesta clínica de TST y el rendimiento de la SBC se presentan en la figura 1. El tamaño promedio de las induraciones TST fue de 10,25 mm (rango: 0 - 20 mm) y el número de celular mediano por ampolla era de 50.000 (gama: 210.000 15.000 células, número de ampollas: 15). Dos de los voluntarios no tenían ninguna respuesta clínica en cualquiera de los 2 TSTs y un rendimiento de baja celular total correspondiente de 15.000 células/blister. El rendimiento celular se asoció con la respuesta clínica media de TST (de Spearman r = 0.643, p = 0,094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Figura 1 : Rendimiento de succión blister celular. (a) este panel muestra a un representante de microscopía de células con tinción nigrosine aislado de SBs levantó 7 días post-TST. (b) este panel muestra las relaciones entre la induración de TST media (mm) y el rendimiento de la media de la célula (n/blister) en 8 voluntarios vacunados de BCG (número de ampollas = 15). Los puntos representan las mediciones medias individuales. Tenga en cuenta que los 2 puntos se solapan como 2 voluntarios de ambos tuvieron una induración TST de 0 mm y un rendimiento de la célula de 15.000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para demostrar la caracterización de SB de citometría de flujo, SBCs se obtuvieron de un voluntario de 43 años de edad que había sido vacunados de BCG 30 años antes y no había exposición conocida a Mtb. el SBC fueron aisladas después de la inducción de una sola ampolla ( induración: 1,4 mm/100.000 SBCs). La figura 2 muestra parcelas representativas de tinción intracelular citoquinas de la SBCs versus PBMCs.
En este voluntariado, la fracción de CD3 + CD4 + CD8-SBCs aumentó del 67% en células sin estimular a > 90% con un PPD en vitro restimulation, mientras que la fracción de CD3 + CD4 + CD8-PBMCs se mantuvo constante (~ 51%, figura 2). Más del 92% de los en vitro PPD-, así como el CD3 + CD4 + CD8-SBCs sin estimular, eran del tipo de memoria efectora (CCR7 - CD45RA-, datos no mostrados). Las fracciones totales de células CD3 + CD4 + CD8 específicas inducidas por el estímulo de PPD fueron mayores en los SBCs en comparación con las PBMCs (33,1 vs. 0.2%, las muestras sin estimular restadas). En PBMCs, las fracciones de polifuncional las células CD3 + CD4 + CD8-PPD-específicas fueron todos < 0.05%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Figura 2 : Parcelas de citometría de flujo representativo de SBCs versus PBMCs. Paneles a y b muestran densidad representativa sin estimular parcelas de la población CD8 + y CD4 + en (un) vs. PPD-estimulado PBMCs y (c) SBCs. paneles b y d lento parcelas de citoquinas intracelulares tinción en PPD-estimulado CD3 + CD4 + CD8-celdas para (b) PBMCs y (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una mayor versión de esta.</a>
Como era de esperar, CD3 + CD4 + CD8-SBCs fueron activados en vivo, ilustrado por una alta proporción de las células de coloración para alza de citoquinas (12%), con las citoquinas predominantes que TNF-α y IFN-γ. Sin embargo, sobre el estímulo de PPD, la citocina secretor de las células cambia de puesto hacia un positivo triple o doble IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%) y el IFN-γ + el TNF-α + (15%) perfil (figura 3b, perfiles de PBMC del mismo donante están incluidos para comparación en Figura 3a). Los perfiles de expresión de citocinas para subconjuntos de células T de memoria CD4 + efectoras estimuladas por el PPD (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) fueron comparables a la CD3 + CD4 + CD8-población presentada en las figuras 2 y 3 (datos no mostrados).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Figura 3: perfiles del Cytokine de SBCs sin estimular y estimular CD4 + PPD versus PBMCs.  Estos paneles muestran perfiles individuales para la producción de citocinas (un) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs células y (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Las barras representan fracciones de perfiles del cytokine específica de antígeno en células sin estimular (barras blancas) y a una estimulación en vitro con PPD (barras de color).
Para explorar el fluido de SB como fuente de información en el microambiente de citocinas en el sitio de la prueba de la piel, se midieron los niveles de citocinas en líquido de SBs inducido 7 días post-TST (figura 4a). Los niveles promedio de IFN-γ, TNF-α y IL-2 fueron 339 pg/mL, 19 pg/mL y 1 pg/mL, respectivamente (n = 6). Los niveles plasmáticos eran generalmente muy bajos. Las células aisladas de SBs producen altos niveles de citoquinas pro-inflamatorias ex vivo (Figura 4b). Valoraciones de los SBC de 1 voluntario fueron cultivadas durante 4 días en presencia de virulentas de M. tuberculosis ± PBMCs autólogos. Los niveles de IFN-γ son > 30-fold mayor en cultivos con SBCs, independientemente de la presencia de PBMCs.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Figura 4 : Niveles de citocinas en líquido de SB, plasma, y MTB -infectados supernatants de la cultura. (un) este panel muestra niveles de citoquinas en plasma y fluidos sobrenadantes de SB de 6 voluntarios vacunados de BCG. Las barras representan los niveles de citoquina mediana; las barras de error representan la gama. (b) este panel muestra los niveles de citoquinas en sobrenadantes de 4 paralelo 600 μl ex vivo 4 días culturas de 1 x 106 PBMCs (barras negras), 1.75 x 105 SBCs (barras blancas) y 1 x 106 PBMCs tacon con 0.5 o 1.75 x 10 5 SBCs (barras grises) infectadas por Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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