Name: a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes
Uploaded: 2018-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

وقد أيد هذا العمل شنتشن للعلوم و "التكنولوجيا مجلس البحوث البرنامج الأساسي" (JCYJ20150331142757383)، برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDA16030502)، "هونغ كونغ البحث منحة المجلس الموضوع على أساس البحث" مخطط (T12-705/11)، برنامج تعاون مجلس منح الأبحاث لمنطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية مشروع فريق البحث (N-HKU730/12 و 81261160506)، الصين للعلوم الطبيعية في قوانغدونغ مؤسسة (2014A030312001)، والعلم قوانغتشو وبرنامج التكنولوجيا (201607010086)، ومقاطعة قوانغدونغ العلم والتكنولوجيا برنامج (2016B030229007 و 2017B050506007).

كافة الأساليب الموصوفة هنا التي تنطوي على استخدام الحيوانات أقرتها اللجنة المعنية "استخدام الحيوانات تعيش" في التدريس والبحوث (كولتر) من جامعة هونغ كونغ.
1-الماوس إعداد واختبار المظهرية
<ol><li>
جيل من العوز الفئران خروج المغلوب (كو) لدلر .
	<ol>
<li>استخدام الفئران س?...

<ol>
	<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor-mediated+pathway+for+cholesterol+homeostasis.">A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis.</a> Science. 232 (4746), 34-47 (1986).</li><li>Endo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+HMG-CoA+reductase+inhibitors.">The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.</a> J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).</li><li>Dubuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+upregulate+PCSK9,+the+gene+encoding+the+proprotein+convertase+neural+apoptosis-regulated+convertase-1+implicated+in+familial+hypercholesterolemia.">Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).</li><li>Robinson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+alirocumab+in+reducing+lipids+and+cardiovascular+events.">Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events.</a> N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).</li><li>Fitzgerald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+an+RNA+interference+drug+on+the+synthesis+of+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+and+the+concentration+of+serum+LDL+cholesterol+in+healthy+volunteers:+a+randomised,+single-blind,+placebo-controlled,+phase+1+trial.">Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial.</a> Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+inbreeding+of+rabbits+with+hereditary+hyperlipidemia+(WHHL-rabbit).">Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit).</a> Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).</li><li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs.">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations.">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li><li>Bissig, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+chimeric+mice+provide+a+model+for+hepatitis+B+and+C+virus+infection+and+treatment.">Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment.</a> J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).</li><li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-)+mice.">Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice.</a> Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).</li><li>Bissig-Choisat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+rescue+of+human+familial+hypercholesterolaemia+in+a+xenograft+mouse+model.">Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model.</a> Nat Commun. 6, 7339 (2015).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+liver+chimeric+mice+with+hepatocytes+from+familial+hypercholesterolemia+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).</li><li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+hyperbilirubinemia+in+gunn+rats+after+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).</li><li>Ortmann, D., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Variability of human pluripotent stem cell lines.</a> Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).</li><li>Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+regeneration+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+diverse+origins.">In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins.</a> Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).</li></ol>

وقد أكدت دراسات السابقة باستخدام إيهيبس في القوارض فوسيلة فعالة لدراسة أمراض الكبد الموروثة17. لزيادة التوسع في استخدام هذه التكنولوجيا، ونظرا للنماذج الحيوانية FH الحالية دون المستوى الأمثل، ونحن انجرافتيد إيهيبس FH في الفئران lrg صندوق، وأظهرت أن انجرافتيد لدلر +/--أو متخ...

مستقبلات low-density lipoprotein (لدلر) تلتقط الكولسترول الضار (LDL-C) في الدم تعدل توليف الكولسترول في الكبد. الطفرات في الجينات لدلر هي السبب الأكثر شيوعاً الكوليستيرول الأسرية (FH)1. Statins تقليديا في السطر الأول من الأدوية لعلاج FH وأنواع أخرى من الكوليستيرول (موروثة أو مكتسبة). Statins تمنع 3-هيدروكسي-3-ميثيلجلوتاريل-إنزيم ريدكتيز إلى انخفاض تخليق الكوليسترول في الكبد2. بالإضافة إلى ذلك، statins زيادة مستويات لدلر على السطح تتمثل لتعزيز البلازما إزالة LDL-C. تحذير رئيسية للمعاملة مع الستاتين غير أنها حمل في نفس الوقت التعبير عن كونفيرتاسي بروبروتين سوبتيليسين/هيكسين 9 (PCSK9)، إنزيم يربط لدلر النهوض تدهور3. هذا التأثير المسؤول عن الاستجابة غير كافية أو null حتى statins لوحظ في العديد من المرضى. دراسة هذه الآلية، بشكل غير متوقع، أدى إلى اكتشاف طريقة بديلة لعلاج الكوليستيرول. أضداد PCSK9 التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير مؤخرا تستخدم حاليا في التجارب السريرية، وإظهار كفاءة أعلى والتسامح أفضل من statins4. نجاح PCSK9 الأجسام المضادة يعني أيضا أنه قد تكون هناك إمكانيات أخرى علاجية لتعديل مسار التدهور لدلر (إلى جانب PCSK9) في المرضى الذين يعانون من الكوليستيرول. وبالمثل، هناك اهتمام بتطوير مثبطات جديدة من PCSK9 خلاف الأجسام المضادة، على سبيل المثال، siRNA أوليجوس5.
لاختبار علاجات جديدة FH وعامة أخرى على أي نوع من الكوليستيرول، نماذج مناسبة في فيفو ضرورية. مشكلة رئيسية من الحالي في فيفو نماذج، ومعظمهم من الفئران6 والأرانب7، هي تلك الاختلافات الفسيولوجية مع البشر. من الأهمية بمكان هذه المشاكل تشمل ملف تعريف الأيض الدهون مختلفة. الجيل من الحيوانات تشيميريك الكبد البشري8 قد تساعد في التغلب على هذا التحذير. الماوس تشيميريك الكبد البشري نوع من "أنسنة" الماوس مع الكبد في إعادة ملء مع خلايا الكبد البشري، على سبيل المثال، خلايا الكبد البشري الأساسي (pHH)9. مشكلة مع pHH أنه لا يمكن توسيع فيفو السابقين، بسرعة تفقد وظيفتها على العزلة، ومصدر محدود. بديل ل pHH هو استخدام الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية)-اشتقاق خلايا الكبد (إيهيبس)10. جدير بالذكر أن إيبسكس الخاصة بالمريض ويمكن زراعتها إلى أجل غير مسمى، حيث يمكن أن تنتج عبس على الطلب، وميزة كبيرة على مدى pHH الطازجة. وعلاوة على ذلك، إيبسكس يمكن أيضا أن تكون بسهولة وراثيا مع nucleases مصمم لتصحيح أو استحداث الطفرات في اسوي خلفية للسماح بإجراء مقارنات أكثر إخﻻصا11.
الماوس تشيميريك الكبد البشري مع pHH انجرافتيد إظهار أوجه الشبه للبشر في التشكيلات الجانبية الأيضية للكبد، واستجابات المخدرات، والقابلية ل الإصابة بفيروس التهاب الكبد12. وهذا يجعلها نموذجا جيدا لدراسة الدهون في الجسم الحي. تستند النماذج الأكثر استخداماً الماوس الماوس فاه-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (FRG)13 والتحالف التقدمي المتحد الماوس المعدلة وراثيا8، التي تصل إلى 95 في المائة الماوس في الكبد يمكن الاستعاضة عن pHH. من المثير للاهتمام، وصف تقرير حديث لبشرية FH كبد تشيميريك ماوس (استناداً إلى الماوس الغواتيمالية) مع pHH من مريض تحمل تحور لدلر متماثل14. في هذا النموذج، خلايا الكبد البشري repopulated قد لا لدلر الوظيفية، ولكن خلايا الكبد الماوس المتبقية، مما يقلل من فائدة للأداء في فيفو اختبار العقاقير الاعتماد على المسار لدلر.
هنا، نحن تقرير بروتوكول مفصل استناداً إلى الأعمال المنشورة مؤخرا لدينا15 انجرافتينج عبس FH في الكبد الماوس لدلر-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (lrg صندوق). هذا الفأر تشيميريك الكبد البشري مفيد للنمذجة FH وإجراء اختبار المخدرات المجراة في.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>B4-VW-352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>Extracellular matrix coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6625</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>IW-1100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>TrypLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10829</td>
			<td>Knockout DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td>0.5 M, PH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for cell suspension)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for iHep differentiation)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat and high-cholesterol diet</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12079B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human hepatocyte growth factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC maintenance medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>mTeSR1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL-C detection kit</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>993-00404 and 993-00504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium&#160;chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P25108</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NADA 141-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>USB</td>
			<td>S20227</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>Calcium and magnesium-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCSK9 antibodies</td>
			<td>Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td>SAR236553/REGN727</td>
			<td>Alirocumab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenobarbital</td>
			<td>Alfamedic company</td>
			<td>013003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>RBI</td>
			<td>P-133</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated petri dish</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simvastatin</td>
			<td>Merck Sharp &#38; Dohme</td>
			<td>ZOCOR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-46619</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16450</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAT</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0012</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALB</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A80-129</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASGPR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-28977</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4A</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-6557</td>
			<td>1:35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0020</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0023</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il2rg-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>003174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ldlr-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>002077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag2-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>008449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Countess</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma irradiator</td>
			<td>MDS Nordion</td>
			<td>Gammacell 3000 Elan II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Model 8/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides scanning system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>Aperio scanScope system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding Microtome</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicrocope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>ASP200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire myograph</td>
			<td>DMT</td>
			<td>610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital slide viewing software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Aperio ImageScope Version 12.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.51e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CC Version 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>AxioVision LE Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes

معظمها بسبب طفرات مستقبلات (لدلر) low-density lipoprotein الكوليستيرول الأسرية (FH) ويؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بأمراض القلب والشرايين بداية مبكرة بسبب الارتفاع الملحوظ الكولسترول الضار (LDL-C) في الدم. Statins السطر الأول من الأدوية الخافضة للدهون لعلاج FH وأنواع أخرى من الكوليستيرول، ولكن نهج جديدة آخذة في الظهور، في أجسام PCSK9 خاصة، والآن يجري اختبارها في التجارب السريرية. لاستكشاف النهج العلاجية رواية FH, أدوية جديدة أو تركيبات جديدة، نحن بحاجة إلى مناسبة في فيفو نماذج. ومع ذلك، الاختلافات في الملامح الأيض الدهون مقارنة بالبشر مشكلة رئيسية للنماذج الحيوانية المتاحة من FH. لمعالجة هذه المسألة، ونحن قد ولدت نموذجا ماوس تشيميريك كبد البشري باستخدام الخلايا الجذعية pluripotent FH التي يسببها (اللجنة التوجيهية)-اشتقاق خلايا الكبد (عبس). كنا الفئران لدلر-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (lrg صندوق) لتفادي الرفض المناعي لزرع الخلايا البشرية وتقييم تأثير لدلر-عبس ناقصة في لدلر فارغة الخلفية. يمكن إعادة زرع FH عبس ملء 5-10% الكبد الماوس lrg صندوق استناداً إلى تلطيخ الزلال البشري. وعلاوة على ذلك، إيهيبس انجرافتيد تستجيب للأدوية الخافضة للدهون ولخص الملاحظات الإكلينيكية لزيادة فعالية الأجسام المضادة PCSK9 مقارنة مع statins. وهكذا يمكن أن يكون نموذجنا تشيميريك الكبد البشري مفيدة للتجارب السريرية للعلاجات الجديدة إلى FH. استخدام البروتوكول نفسه، ومشابهة من الفئران تشيميريك الكبد البشري للمتغيرات الجينية FH الأخرى، أو الطفرات المقابلة لغيرها من أمراض الكبد الموروثة، قد يتم أيضا إنشاء.

إيبسكس "تمايز الإنسان" الموجهة إلى عبس عند التوصل إلى التقاء 70%، ميزت إيبسكس البشرية إلى عبس مع بروتوكول 3-الخطوة16 (الشكل 1 اللوحة العلوية). بعد 3 أيام تمايز الأنسجة، تصبح خففت المستعمرات اللجنة التوجيهية وامتدت إلى التقاء كامل (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

طراز ماوس تشيميريك كبد البشري الكوليستيرول أسرية باستخدام خلايا الكبد المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنشاء نموذج ماوس تشيميريك كبد البشري من الكوليستيرول الأسرية باستخدام خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent. وهذا نموذجا قيماً لاختبار علاجات جديدة الكوليستيرول.

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

وقد أجاب هذا الأسلوب الأسئلة الرئيسية في هذا المجال، مثل كيفية توليد نموذج الماوس الكبري الكبد الإنسان، فرط الكوليسترول في الدم العائلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح بإجراء اختبارات المخدرات في في الجسم الحي. هذه التقنية لديها syndication لعلاج فرط الكوليسترول العائلي.كعلاج جديد لهذا المرض ، يمكن اختباره باستخدام مثل هذه النماذج الحيوانية chimeric. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة فرط الكوليسترول في الدم العائلي, ويمكن أيضا أن تطبق على أمراض الكبد الموروثة الأخرى. قبل 24 ساعة من النقاب، ذوبان 40 ميكرولترات من مصفوفة خارج الخلية لكل فأرة، عن طريق وضعها في صندوق الثلج، في غرفة باردة.هدئ حقنة الأنسولين لكل فأر ليتم حقنه وصندوق من 200 نصائح ميكرولتر في ثلاجة درجة مئوية أربع. ساعة واحدة قبل engraftment، دافئة إنزيم تفكك الخلية، تستكمل مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من DNAase 1، إلى درجة حرارة الغرفة ومكان RPMI 1640 المتوسطة، تستكمل مع استبدال المصل 20 في المئة على الجليد. التقاط صور على النقيض من المرحلة من iHeps لتسجيل وضعهم، بما في ذلك مورفولوجيا الخلية والنمو وكثافة الخلايا.بعد ذلك، قم بغسل كل بئر من iHeps مع 2 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة الكالسيوم والمغنيسيوم الخالي من أيونات PBS مرتين ثم أضف ملليلتر واحد من إنزيم تفكك الخلايا قبل تسخينه إلى كل بئر. إعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة 8 إلى 10 دقائق. مراقبة مورفولوجيا الخلية تحت المجهر.عندما تصبح معظم الخلايا جولة, إضافة في حجم متساو من المتوسط البارد في البئر, ماصة الخلايا بلطف لفصل من لوحة, ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لموثوقية خلايا الكبد. إذا كان من الصعب فصل الخلايا عن اللوحة ، يمكن ترك بعضها على اللوحة.وإذا كانت الخلايا منفصلة، ثم ماص بلطف بعد الطرد المركزي، للحصول على تعليق خلية واحدة. كرر إجراء انفصال الخلية لكل بئر حتى يتم جمع تقريبا جميع الخلايا المرفقة. ثم جهاز طرد مركزي في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية.بعد الطرد المركزي، وإزالة عظمى وإعادة تعليق الخلايا مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني الباردة في أنبوب المليلتر خمسة عشر. Pipette الخلايا بلطف للحصول على تعليق خلية واحدة. ثم، تمرير الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون لإزالة المجاميع.عادة، يمكن حصاد مليون إلى مليوني خلية حول بعد قليل من تير-ه. المقبل، إضافة microliters من 0.4 في المئة Trypan حل الأزرق إلى 20 ميكرولترات من تعليق الخلية. عد الخلايا وسجل تركيز تعليق الخلية كما C.Calculate حجم المطلوبة من تعليق الخلية لحقن مليون خلية لكل ماوس.ثم تخصيص حجم المطلوب من تعليق الخلية في أنابيب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية. بعد إزالة ناظر، إعادة تعليق الخلايا في 27.5 ميكرولترات من PBS الباردة لكل فأرة. ثم إضافة حجم متساو من مصفوفة خارج الخلية لحجم النهائي من 55 ميكرولترات لكل ماوس.الآن، ضع واحدة من حقن الأنسولين الباردة على الجليد. افصل المكبس، ونقل 55 ميكرولترات من تعليق الخلية في الحقنة ومن ثم وضع المكبس مرة أخرى. فقاعات التفريغ بعناية، ووضع حقنة مرة أخرى على الجليد.تأكد من أن الفئران LRG يتم تخديرها بشكل صحيح قبل البدء في إجراء الحقن. تطبيق مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف أثناء إجراء التخدير. مرة واحدة في الماوس قد فقدت منعكس العضلات إلى التحفيز، وضعه في الحق، الجانبي، موقف decubitus.ضع طبقة سميكة من كريم إزالة الشعر على منطقة الشق في الجناح الأيسر، واتركها لمدة خمس إلى ثماني دقائق. إزالة كريم إزالة الشعر والشعر عن طريق مسح المنطقة مع وسادة الشاش مبلل بالماء. فرك الجناح الأيسر مع 70 في المئة الإيثانول ثلاث مرات.ثم حدد مكان الطحال، الذي يمكن رؤيته في الجناح الأيسر. تليها نقع النهائي مع البيتادين للتطهير. بعد استخدام مقص لجعل شق 0.5 إلى واحد سنتيمتر واحد في الجلد وجدار البطن، واستخدام ملقط لإضفاء الطابع الخارجي على الطحال عن طريق سحب بلطف الأنسجة الدهنية المحيطة.تحقيق الاستقرار بلطف الطحال باستخدام مسحة. أدخل إبرة حقنة الأنسولين من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات في البارينشيما من الطحال ، وحقن بلطف حوالي 50 ميكرولترات من تعليق الخلية. سحب الإبرة ووضع مسحة القطن على الحقن لمدة دقيقة واحدة لمنع النزيف وانسكاب المواد.العودة الطحال إلى الصفاق، وإغلاق الجرح مع خياطة النايلون خمسة يا. بعد خياطة، ووضع الماوس في قفص نظيف مع سهولة الوصول إلى الطعام والماء. تبدأ عن طريق إزالة الأعضاء الداخلية من الماوس القتل الرحيم حديثا بحيث الشريان الأورطي التنازلي، بالتوازي مع العمود الفقري، مرئية.ثم تشريح بعيدا الأنسجة المجاورة، وإزالة القلب. استخدام مقص غرامة لتشريح الشريان الأورطي، ووضع كل واحد في الباردة، والمكبس الأوكسجين الحل. بعد جمع، نقل الشريان الأبهر في حل كريبس إلى طبق بيتري المغلفة بالسيليكون.دبوس النسيج الضام لإصلاح موقف الشريان الأورطي دون تمتد عليه. تحت مجهر معقمة، واستخدام ملقط غرامة ومقص الربيع لتشريح الشريان الأورطي خالية من الأنسجة المحيطة الدهون ومدفنيتيال دون الإضرار جدار السفينة. ثم قطع كل الشريان الأورطي إلى واحد ونصف إلى اثنين من شرائح طول ملليمتر.المقبل, قطع قطعة سنتيمترين طويلة من 40 ميكرون سميكة الأسلاك غير القابلة للصدأ, وإدراج بلطف في تجويف الشريان الأورطي. عقد السلك لنقل الجزء إلى غرفة الأسلاك myograph، مليئة حل كريبس المؤكسج. لقياس طول شرائح الشريان الأورطي عند دراسة قابلية التقلص، ضع كل قطعة عموديًا بين الفكين، وسجل قراءة D1 على ميكرومتر.ثم قم بإزالة الجزء وتحريك الفكين معًا. تسجيل القراءة D0 وحساب طول الجزء. بعد ذلك ، المشبك السلك وتأمينه مع مفك البراغي في حين وضع الجزء غير الممدودة بين الفكين.للتطبيع قبل التجربة، قم بتعيين myograph إلى صفر في الموضع غير الممدودة. ثم تتحرك ببطء الفكين وبصرف النظر ومراقبة التوتر الشريان الأورطي تغيير حتى تصل إلى ثلاثة millinewton. بعد 15 دقيقة، استنزف الحل من غرفة myograph واستبدلها بحل كريبس الطازج.بعد انتظار آخر 15 دقيقة، مرة أخرى ضبط التوتر إلى ثلاثة millinewton. ثم تغيير حل كريبس القياسية لمحلول كريبس تكملها 60 كلوريد البوتاسيوم ميليمولر، للحث على انكماش لمدة لا تقل عن خمس عشرة دقيقة. شطف مع حل كريبس الطازجة ثلاث مرات، ثم إضافة تركيزات متزايدة من الفينيلفرين.على سبيل المثال، 10 نانوموللار إلى 100 ميكرومولار. ثم، بعد غسل بها مع محلول كريبس القياسية، إضافة تركيز واحد من فينيليفرين، في حوالي 70 في المئة من الانكماش الأقصى. عندما يكون الانكماش مستقرًا، أضف تركيزات متزايدة من الأستيل كولين على فترات دقيقة.على سبيل المثال، واحد إلى ثلاثة نانوموللار إلى 10-30 ميكرومولار للحث على توسع الأوعية. تُظهر هذه الصورة صورة تمثيلية كاملة المقطع الممسوحة ضوئيًا لألبومين بشري يلطخ في كبد الماوس الذي يُعاد اصمره بمستقبلات البروتين الدهني المنخفضة نقصًا في مستقبلات البروتين الدهني iHeps. الأسهم تشير إلى مجموعات من iHeps الإنسان نقش في كبد الماوس.وينظر إلى مجموعات من iHeps الإنسان engrafted في مزيد من التفاصيل هنا. يوضح الرسم البياني scatterplot هذا النسبة المئوية للخلايا الإيجابية التي تمت إعادة إليها في اللولب البشري المقابلة لـ iHep التي تحتوي على مناطق في كبد الماوس ، من iPSCs مانحة مختلفة. هذه هي صورة تمثيلية من تلطيخ المناعة الكيميائية للنوى البشرية في كبد الماوس، مع فرط الكوليسترول العائلي iHeps.الرسم البياني شريط يظهر النسبة المئوية من النوى البشرية repopulati إيجابية iHeps من مختلف المانحة iPSCs في كبد الماوس LRG. هذه هي الصور التمثيلية للألبومين البشري والنوى البشرية تلطيخ على قسمين متتاليين من كبد الماوس ، وإعادة إسكانها مع iHeps من النوع البري. وأخيرا، تظهر هذه الصورة توسع الأوعية التي تعتمد على الغدد الأورطية في فرط الكوليسترول في الدم البشري الفئران الكبري، استجابة لزيادة تركيزات أستيل.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد فئران الكَبَل البشري ، باستخدام خلايا الكبد المشتقة من iPSC البشرية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

جيل من التكامل خالية الإنسان المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية عن طريق الشعر المستمدة من الخلايا الكيراتينية

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

المحفزة الخلايا الجذعية المشتقة خلايا القلب لإصلاح عضلة القلب

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

تحليل الكهربية من الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية (هسك-كمس) باستخدام صفائف متعدد القطب (مياس)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

تشوندروسيتيس التفريق من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة البشرية المستحثة من الدم

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

والرزن موائع جزيئية "تقييم التصاق الكريات البيض" إلى "خلايا بطانية" المستمدة من "الخلايا الجذعية Pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان" (هيبسك-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...