Name: a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes
Uploaded: 2018-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het Shenzhen wetenschap en technologie Raad Basic Research Program (JCYJ20150331142757383), strategische prioriteit Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDA16030502), Hong Kong onderzoek subsidie Raad thema gebaseerd onderzoek Regeling (T12-705/11), samenwerking programma van de Onderzoeksraad van de subsidies van de speciale administratieve regio van Hongkong en de nationale natuurlijke Science Foundation van China (N-HKU730/12 en 81261160506), Team onderzoeksproject van Guangdong natuurwetenschappen Stichting (2014A030312001), Guangzhou Science en technologie programma (201607010086), en de provincie Guangdong Science and Technology Program (2016B030229007 en 2017B050506007).

Alle methoden die hier worden beschreven die betrekking hebben op het gebruik van dieren zijn goedgekeurd door de Commissie op de gebruiken van levende dieren in het onderwijs en onderzoek (CULATR) van de Universiteit van Hongkong.
1. muis voorbereiding en fenotypische testen
<ol><li>
Generatie van immunodeficiëntie Ldlr knock-out (KO) muizen.
	<ol>
<li>Gebruik de muizen stammen Ldlr- / - Rag2- /-en Il2rg- / -</...

<ol>
	<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor-mediated+pathway+for+cholesterol+homeostasis.">A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis.</a> Science. 232 (4746), 34-47 (1986).</li><li>Endo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+HMG-CoA+reductase+inhibitors.">The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.</a> J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).</li><li>Dubuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+upregulate+PCSK9,+the+gene+encoding+the+proprotein+convertase+neural+apoptosis-regulated+convertase-1+implicated+in+familial+hypercholesterolemia.">Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).</li><li>Robinson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+alirocumab+in+reducing+lipids+and+cardiovascular+events.">Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events.</a> N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).</li><li>Fitzgerald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+an+RNA+interference+drug+on+the+synthesis+of+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+and+the+concentration+of+serum+LDL+cholesterol+in+healthy+volunteers:+a+randomised,+single-blind,+placebo-controlled,+phase+1+trial.">Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial.</a> Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+inbreeding+of+rabbits+with+hereditary+hyperlipidemia+(WHHL-rabbit).">Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit).</a> Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).</li><li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs.">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations.">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li><li>Bissig, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+chimeric+mice+provide+a+model+for+hepatitis+B+and+C+virus+infection+and+treatment.">Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment.</a> J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).</li><li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-)+mice.">Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice.</a> Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).</li><li>Bissig-Choisat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+rescue+of+human+familial+hypercholesterolaemia+in+a+xenograft+mouse+model.">Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model.</a> Nat Commun. 6, 7339 (2015).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+liver+chimeric+mice+with+hepatocytes+from+familial+hypercholesterolemia+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).</li><li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+hyperbilirubinemia+in+gunn+rats+after+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).</li><li>Ortmann, D., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Variability of human pluripotent stem cell lines.</a> Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).</li><li>Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+regeneration+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+diverse+origins.">In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins.</a> Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).</li></ol>

Eerdere studies met behulp van iHeps in knaagdieren hebben bevestigd dat zij een effectieve manier zijn om het studeren overgenomen leverziekten17. Verder uitbreiden van het gebruik van deze technologie omdat huidige FH diermodellen suboptimaal zijn, wij en FH iHeps geaccepteerd in LRG muizen is gebleken dat het werk LDLR +/- of heterozygoot LDLR-gemuteerde FH iHeps muizen plasma LDL-C niveau kan verminderen en reageren op het lipide-verlagende drugs in vivo.
<p clas...

Low-density lipoprotein receptor (LDLR) vangt LDL-cholesterol (LDL-C) in het bloed naar het moduleren van de synthese van cholesterol in de lever. Mutaties in het gen LDLR zijn de meest voorkomende oorzaak van familiale hypercholesterolemie (FH)1. Statines zijn traditioneel de eerste regel van medicatie voor de behandeling van FH en andere soorten hypercholesterolemie (geërfd of verworven). Statines remmen 3-hydroxy-3-methylglutaryl-co-enzym een reductase te verlagen van de synthese van cholesterol in de lever2. Bovendien, verhogen statines LDLR op het oppervlak van de hepatocyte ter bevordering van plasma LDL-C klaring. Een belangrijke caveat van behandeling met statines is echter dat ze gelijktijdig de expressie van het proprotein convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9), een enzym dat zich aan LDLR bindt te bevorderen de afbraak3induceren. Dit effect is verantwoordelijk voor de onvoldoende of zelfs null reactie op statines bij veel patiënten waargenomen. Bestuderen van dit mechanisme heeft onverwacht, geleid tot de ontdekking van een alternatieve manier voor de behandeling van hypercholesterolemie. PCSK9 antilichamen onlangs goedgekeurd door de FDA worden momenteel gebruikt in klinische proeven en Toon grotere werkzaamheid en betere tolerantie dan statines4. Het succes van PCSK9 antilichamen houdt ook in dat er mogelijk andere therapeutische mogelijkheden aan het moduleren van het traject van de LDLR-degradatie (behalve PCSK9) bij patiënten met hypercholesterolemie. Ook is er belang bij de ontwikkeling van nieuwe remmers van PCSK9 dan antilichamen, bijvoorbeeld, siRNA oligos5.
Als u wilt testen van nieuwe therapieën voor FH en in het algemeen een andere soort hypercholesterolemie, zijn passende in vivo modellen nodig. Een groot probleem van de huidige in-vivo modellen, meestal muizen6 en7, konijnen hun fysiologische verschillen met de mens. Deze problemen omvatten is cruciaal, een verschillende lipide metabole profiel. De generatie van menselijke lever chimeer dieren8 kan helpen overwinnen van deze waarschuwing. De menselijke lever Chimeer muis is een soort "gehumaniseerd" muis met haar lever opnieuw gevuld met menselijke hepatocyten, bijvoorbeeld primaire menselijke hepatocyten (pHH)9. Een probleem met pHH is dat ze niet kunnen uitgevouwen ex vivo, snel worden verliezen hun functie op isolatie, en een beperkte bron. Een alternatief voor pHH is het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleid van hepatocyten (iHeps)10. Met name iPSCs patiënt-specifiek zijn en kunnen worden gekweekt voor onbepaalde tijd, zodat iHeps kunnen worden geproduceerd op vraag, die een aanzienlijk voordeel ten opzichte van verse pHH. Bovendien, iPSCs kan ook worden gemakkelijk genetisch gemanipuleerde met designer nucleasen te corrigeren of mutaties in een isogene achtergrond om meer trouw vergelijkingen11te voeren.
Menselijke lever Chimeer muis met werk pHH vertonen overeenkomsten op de mens in de lever metabool profielen, drug reacties en gevoeligheid voor hepatitis virus infectie12. Dit maakt ze een goed model te bestuderen hyperlipidemie in vivo. De meest gebruikte Muismodellen zijn gebaseerd op de/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (FRG) muis13 en de uPA transgene muis8, welke tot 95% van de muis lever door pHH vervangen kan. Interessant, beschreven een recent rapport een menselijke FH lever Chimeer muis (gebaseerd op de muis FRG) met pHH uit een patiënt een homozygoot LDLR mutatie14uitvoering. In dit model, de nieuwe menselijke hepatocyten had geen functionele LDLR, maar de resterende muis hepatocyten deed, waardoor het hulpprogramma voor het uitvoeren van de in vivo tests van drugs afhankelijk van de LDLR-pathway.
Wij rapporteren hier een gedetailleerde protocol is gebaseerd op onze onlangs gepubliceerde werk15 voor enten FH iHeps in de/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) muis lever. Deze menselijke lever Chimeer muis is handig voor het modelleren van FH en uitvoeren van de drug testen in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>B4-VW-352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>Extracellular matrix coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6625</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>IW-1100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>TrypLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10829</td>
			<td>Knockout DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td>0.5 M, PH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for cell suspension)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for iHep differentiation)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat and high-cholesterol diet</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12079B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human hepatocyte growth factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC maintenance medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>mTeSR1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL-C detection kit</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>993-00404 and 993-00504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium&#160;chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P25108</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NADA 141-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>USB</td>
			<td>S20227</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>Calcium and magnesium-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCSK9 antibodies</td>
			<td>Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td>SAR236553/REGN727</td>
			<td>Alirocumab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenobarbital</td>
			<td>Alfamedic company</td>
			<td>013003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>RBI</td>
			<td>P-133</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated petri dish</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simvastatin</td>
			<td>Merck Sharp &#38; Dohme</td>
			<td>ZOCOR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-46619</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16450</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAT</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0012</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALB</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A80-129</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASGPR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-28977</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4A</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-6557</td>
			<td>1:35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0020</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0023</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il2rg-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>003174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ldlr-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>002077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag2-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>008449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Countess</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma irradiator</td>
			<td>MDS Nordion</td>
			<td>Gammacell 3000 Elan II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Model 8/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides scanning system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>Aperio scanScope system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding Microtome</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicrocope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>ASP200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire myograph</td>
			<td>DMT</td>
			<td>610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital slide viewing software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Aperio ImageScope Version 12.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.51e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CC Version 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>AxioVision LE Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes

Familiale hypercholesterolemie (FH) wordt meestal veroorzaakt door mutaties van low-density lipoprotein receptor (LDLR) en resulteert in een verhoogd risico op hart-en vaatziekten van early-onset als gevolg van de aanzienlijke verhoging van LDL cholesterol (LDL-C) in het bloed. Statines zijn de eerste regel van lipide-verlagende medicijnen voor de behandeling van FH en andere soorten hypercholesterolemie, maar nieuwe benaderingen zijn in opkomst, in bepaalde PCSK9 antilichamen, die nu zijn getest in klinische proeven. Voor het verkennen van nieuwe therapeutische benaderingen voor FH, nieuwe geneesmiddelen of nieuwe formuleringen, moeten we in vivo modellen nodig. Verschillen in de metabole lipidenprofielen vergeleken bij de mens zijn een kernprobleem van de beschikbare dierlijke modellen van FH. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een muismodel van de menselijke lever chimeer met behulp van FH geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) gegenereerd-afgeleid van hepatocyten (iHeps). We gebruikten/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) muizen te vermijden immuun afwijzing van getransplanteerde menselijke cellen en te beoordelen van het effect van LDLR-deficiënte iHeps in een LDLR null achtergrond. Getransplanteerde FH iHeps kon weer toevoegen aan 5-10% van de IRG muis lever gebaseerd op menselijke albumine kleuring. Bovendien, het werk iHeps gereageerd op lipide-verlagende medicijnen en klinische waarnemingen van verhoogde efficiëntie van PCSK9 antilichamen t.o.v. statines gerecapituleerd. Onze menselijke lever chimeer model kan dus nuttig zijn voor preklinische testen van nieuwe therapieën voor FH. Met behulp van de hetzelfde protocol, soortgelijke menselijke lever chimeer muizen voor andere FH genetische varianten of overeenkomt met andere erfelijke lever ziekten, mutaties kan ook worden gegenereerd.

Gestuurde differentiatie van menselijke iPSCs in iHeps Bij het bereiken van 70% samenvloeiing, worden menselijke iPSCs onderscheiden in iHeps met een 3-stap protocol16 (Figuur 1 bovenste deelvenster). Na 3 dagen van endoderm differentiatie, worden iPSC kolonies losgemaakt en verspreiden tot volledige samenkomst (Figuur 1 lagere paneel). Vervolgens met 2nd fase medium, hepatob...

Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Een familiale hypercholesterolemie menselijke lever chimeer muismodel met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een menselijke lever chimeer muismodel van familiale hypercholesterolemie met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten. Dit is een waardevol model voor het testen van nieuwe therapieën voor hypercholesterolemie.

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Deze methode heeft beantwoord belangrijke vragen in het veld, zoals hoe je een menselijke lever chimeric muis model te genereren, familiale hypercholesterolemie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt het uitvoeren van drugstests in vivo. Deze techniek heeft syndicatie voor de behandelingen van familiale hypercholesterolemie.Als een nieuwe therapie voor deze ziekte, het kan worden getest met behulp van dergelijke chimeric dier modellen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in familiale hypercholesterolemie, kan het ook worden toegepast op andere erfelijke leverziekten. 24 uur voor engraftment ontdooit u 40 microliter extracellulaire matrix per muis, door in een koelbox in een koude ruimte te plaatsen.Chill een insulinespuit voor elke muis te worden geïnjecteerd en een doos van 200 microliter tips in een vier graden Celsius koelkast. Een uur voor engraftment, verwarm de cel dissociatie enzym, aangevuld met 50 microgram per milliliter van DNAase 1, op kamertemperatuur en plaats RPMI 1640 medium, aangevuld met 20 procent serum vervanging op ijs. Neem fasecontrastbeelden van iHeps om hun status vast te leggen, inclusief celmorfologie, groei en celdichtheid.Was vervolgens twee maal elke put van iHeps met 2 milliliter calcium- en magnesiumionnenvrije PBS en voeg vervolgens een milliliter van het voorverwarmde celdissociatieenzym aan elke put toe. Breng de cellen acht tot tien minuten terug naar de couveuse. Controleer de celmorfologie onder de microscoop.Wanneer de meeste van de cellen rond worden, voeg in gelijke volume van koud medium per put, pipette de cellen voorzichtig los te maken van de plaat, en breng de cel suspensie naar een nieuwe 15 milliliter buis. Deze stap is van cruciaal belang voor de betrouwbaarheid van hepatocyten. Als de cellen moeilijk los te maken van de plaat, kunnen sommige worden overgelaten op de plaat.En als de cellen loskomen, dan pipet voorzichtig na centrifugatie, om een eencellige suspensie te verkrijgen. Herhaal de cel-detachement procedure voor elke put totdat bijna alle bijgevoegde cellen worden verzameld. Dan centrifugeren op 200 g gedurende drie minuten op vier graden Celsius.Na centrifugatie, verwijder de supernatant en opnieuw opschorten van de cellen met twee milliliter koude PBS in de vijftien milliliter buis. Pipette de cellen voorzichtig om een eencellige suspensie te verkrijgen. Vervolgens, geef de cellen door een 40 micron cel zeef om aggregaten te verwijderen.Normaal gesproken kunnen een tot twee miljoen cellen over worden geoogst na weinig-ter-ing. Voeg vervolgens microliters van 0,4 procent Trypan blauwe oplossing toe aan 20 microliter celsuspensie. Tel de cellen en noteer de concentratie van celsuspensie als C.Bereken het vereiste volume van celsuspensie om een miljoen cellen per muis te injecteren.Wijs vervolgens het vereiste volume van de celsuspensie toe in buizen van 15 milliliter en centrifuge op 200 g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van de supernatant, opnieuw opschorten van de cellen in 27,5 microliter koude PBS per muis. En voeg dan een gelijk volume extracellulaire matrix toe voor een eindvolume van 55 microliter per muis.Zet nu een van de koude insulinespuiten op ijs. Trek de zuiger los, breng 55 microliter celsuspensie in de spuit en zet de zuiger terug. Ontlaad bubbels zorgvuldig, en zet de spuit weer op ijs.Zorg ervoor dat LRG-muizen goed verdoofd zijn voordat u met de injectieprocedure begint. Breng veterinaire zalf over de ogen om droogte te voorkomen tijdens de anesthesie procedure. Zodra de muis heeft verloren spierreflex aan stimulatie, plaats het in de juiste, laterale, decubitus positie.Breng een dikke laag ontharingscrème aan op het incisiegebied in de linkerflank en laat vijf tot acht minuten staan. Verwijder de ontharingscrème en het haar door het gebied af te vegen met een met water bevochtigd gaaskussen. Schrob de linkerflank drie keer met 70 procent ethanol.Zoek dan de milt, die kan worden gezien in de linkerflank. Gevolgd door een laatste weken met betadine voor desinfectie. Na het gebruik van een schaar om een 0,5 tot een centimeter incisie in de huid en buikwand te maken, gebruik tangen om de milt te exterioriseren door zachtjes te trekken het omliggende vetweefsel.Stabiliseer de milt voorzichtig met een uitstrijkje. Steek de naald van de insulinespuit drie tot vier millimeter in de parenchyma van de milt en injecteer voorzichtig ongeveer 50 microliter celsuspensie. Trek de naald in en plaats een wattenstaafje gedurende een minuut over de injectie om bloedingen en morsen van materiaal te voorkomen.Breng de milt terug naar het buikvlies en sluit de wond met nylon hechtingen van vijf personen. Plaats de muis na het hechten in een schone kooi met gemakkelijke toegang tot voedsel en water. Begin met het verwijderen van de inwendige organen van de vers geëuthanaseerde muis, zodat de dalende aorta, parallel aan de wervelkolom, zichtbaar is.Ontleed dan het aangrenzende weefsel en verwijder het hart. Gebruik fijne schaar om de aortae te ontleden, waarbij ze elk in koude, zuurstofrijk Krebs-oplossing worden gebracht. Breng na het verzamelen de aortae in Krebs-oplossing over op een petrischaal met siliconen bedekte schaaltje.Pin het bindweefsel om de aortapositie te bevestigen zonder het uit te rekken. Gebruik onder een steriele microscoop fijne tangen en een veerschaar om de aorta vrij van het omringende vet- en adventitial weefsel te ontleden zonder de vaatwand te beschadigen. Snijd vervolgens elke aorta in anderhalve tot twee millimeter lengte segmenten.Snijd vervolgens een twee centimeter lang stuk van 40 micron dikke roestvrijdraad en steek voorzichtig in het aortalumen. Houd de draad om het segment over te brengen naar de draad myograaf kamer, gevuld met zuurstofrijke Krebs oplossing. Om de lengte van de aortaesegmenten te meten bij het bestuderen van contractiliteit, plaatst u elk segment loodrecht tussen de kaken en registreert u de D1-meting op de micrometer.Verwijder vervolgens het segment en beweeg de kaken samen. Noteer de D0-meting en bereken de lengte van het segment. Klem vervolgens de draad en zet deze vast met de schroevendraaier terwijl u het niet-gestrekte segment tussen de kaken plaatst.Voor normalisatie vóór het experiment, stel de myograaf op nul in de niet-uitgestrekte positie. Beweeg vervolgens langzaam de kaken uit elkaar en observeer de aortaspanningsverandering tot het bereiken van drie millinewton. Na 15 minuten giet u de oplossing uit de myograafkamer en vervang u deze door een verse Krebs-oplossing.Na het wachten voor nog eens 15 minuten, opnieuw aanpassen van de spanning tot drie millinewton. Verander vervolgens de standaard Krebs-oplossing naar Krebs-oplossing aangevuld met 60 millimolar kaliumchloride, om gedurende ten minste vijftien minuten contractie te veroorzaken. Spoel met verse Krebs-oplossing drie keer en voeg vervolgens steeds hogere concentraties fenylephrine toe.Bijvoorbeeld, 10 nanomolar tot 100 micromolar. Voeg vervolgens, na het uitwassen met standaard Krebs-oplossing, een enkele concentratie fenylephrine toe, bij ongeveer 70 procent van de maximale contractie. Wanneer de contractie stabiel is, voeg dan met tussenpozen van twee minuten de concentraties acetylcholine toe.Bijvoorbeeld, een tot drie nanomolar tot tien tot dertig micromolar om vasodilatatie te induceren. Dit beeld toont een representatief geheel-sectie gescand beeld van menselijke albumin het bevlekken in een muislever opnieuw bevolkt met low-density lipoprotein receptor-deficiënte iHeps. Pijlen geven clusters van menselijke iHeps gegraveerd in de muislever.De clusters van geënteerde menselijke iHeps worden hier in meer detail gezien. Deze scatterplot grafiek toont het percentage van herbevolkte menselijke albumin positieve cellen die overeenkomen met iHep met gebieden in de muislever, van verschillende donor-iPSCs. Dit is een representatief beeld van immunohistochemische kleuring voor menselijke kernen in een muislever, met geënteerde familiale hypercholesterolemie iHeps.De staafgrafiek toont het percentage herbevolkte menselijke kernen positieve iHeps van verschillende donor-iPSCs in LRG-muizenlevers. Dit zijn representatieve beelden van menselijke albumine en menselijke kernen vlekken op twee opeenvolgende delen van een muis lever, opnieuw bevolkt met wild-type iHeps. Ten slotte toont dit beeld endotheelafhankelijke vaatverwijding van de aorta in familiale hypercholesterolemie menselijke leverluismumerische muizen, in reactie op toenemende concentraties acetylcholine.Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe de menselijke lever chimeric muizen te genereren, met behulp van menselijke iPSC-afgeleide hepatocyten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide Hepatocyte-achtige cellen voor drugontdekking

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic Assay voor de beoordeling van leukocyten hechting op menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide endotheliale cellen (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...