Name: a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes
Uploaded: 2018-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Shenzhen Science and Technology Rat Basic Research Program (JCYJ20150331142757383), strategische Priorität Forschungsprogramm der chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Rates Theme Based Research unterstützt. Schema (T12-705/11), Kooperationsprogramm von Zuschüssen Forschungsrat der Sonderverwaltungsregion Hongkong und die National Natural Science Foundation von China (N-HKU730/12 und 81261160506), Team Forschungsprojekt der Guangdong-Naturwissenschaft Stiftung (2014A030312001), Guangzhou Wissenschaft und Technologie-Programm (201607010086), Provinz Guangdong Wissenschaft und Technologieprogramm (2016B030229007 und 2017B050506007).

Alle hier beschriebene Methoden, bei denen die Verwendung von Tieren wurden vom Ausschuss für Verwendung von Leben Tiere in Lehre und Forschung (CULATR) von der University of Hong Kong genehmigt.
1. Vorbereitung und phänotypische Tests Maus
<ol><li>
Generation von immungeschwächte Ldlr -Knockout (KO)-Mäusen.
	<ol>
<li>Verwenden Sie die Mäuse Stämme Ldlr- / -, Rag2- /-und Il2rg- / - (siehe Tabe...

<ol>
	<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor-mediated+pathway+for+cholesterol+homeostasis.">A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis.</a> Science. 232 (4746), 34-47 (1986).</li><li>Endo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+HMG-CoA+reductase+inhibitors.">The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.</a> J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).</li><li>Dubuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+upregulate+PCSK9,+the+gene+encoding+the+proprotein+convertase+neural+apoptosis-regulated+convertase-1+implicated+in+familial+hypercholesterolemia.">Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).</li><li>Robinson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+alirocumab+in+reducing+lipids+and+cardiovascular+events.">Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events.</a> N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).</li><li>Fitzgerald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+an+RNA+interference+drug+on+the+synthesis+of+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+and+the+concentration+of+serum+LDL+cholesterol+in+healthy+volunteers:+a+randomised,+single-blind,+placebo-controlled,+phase+1+trial.">Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial.</a> Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+inbreeding+of+rabbits+with+hereditary+hyperlipidemia+(WHHL-rabbit).">Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit).</a> Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).</li><li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs.">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations.">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li><li>Bissig, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+chimeric+mice+provide+a+model+for+hepatitis+B+and+C+virus+infection+and+treatment.">Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment.</a> J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).</li><li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-)+mice.">Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice.</a> Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).</li><li>Bissig-Choisat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+rescue+of+human+familial+hypercholesterolaemia+in+a+xenograft+mouse+model.">Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model.</a> Nat Commun. 6, 7339 (2015).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+liver+chimeric+mice+with+hepatocytes+from+familial+hypercholesterolemia+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).</li><li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+hyperbilirubinemia+in+gunn+rats+after+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).</li><li>Ortmann, D., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Variability of human pluripotent stem cell lines.</a> Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).</li><li>Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+regeneration+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+diverse+origins.">In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins.</a> Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).</li></ol>

Frühere Studien mit iHeps bei Nagetieren haben bestätigt, dass sie ein wirksames Mittel zur Leber Erbkrankheiten17zu studieren sind. Weiter erweitern den Einsatz dieser Technologie und weil aktuelle FH Tiermodelle suboptimal sind, wir pfropfte FH iHeps in LRG Mäuse und zeigte, dass die eingepflanzt LDLR + / oder heterozygot LDLR-mutierte FH iHeps können Mäuse Plasma LDL-C Ebene reduzieren und reagieren auf Lipid-senkende Medikamente in Vivo.
<p class="jove_conte...

Low density Lipoprotein-Rezeptor (LDLR) fängt LDL-Cholesterin (LDL-C) im Blut, Cholesterinsynthese in der Leber zu modulieren. Mutationen im LDLR-Gen sind die häufigste Ursache für Familiäre Hypercholesterinämie (FH)1. Statine wurden traditionell die erste Zeile von Medikamenten zur Behandlung von FH und andere Arten von Hypercholesterinämie (vererbt oder erworben). Statine hemmen 3-hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym eine Reduktase Cholesterinsynthese in der Leber2zu senken. Darüber hinaus erhöht die Statine LDLR-Ebenen auf der Oberfläche der Hepatozyten, Plasma LDL-C-Abstand zu fördern. Eine große Einschränkung der Behandlung mit Statinen ist jedoch, dass sie gleichzeitig induzieren die Expression von proprotein Konvertase Subtilisin/hexin 9 (PCSK9), ein Enzym, das LDLR bindet seinen Abbau3zu fördern. Dieser Effekt ist verantwortlich für die unzureichende oder sogar null Reaktion auf Statine bei vielen Patienten beobachtet. Dieser Mechanismus zu studieren, unerwartet, zur Entdeckung der eine alternative Möglichkeit zur Behandlung von Hypercholesterinämie führte. PCSK9-Antikörper, die kürzlich von der FDA zugelassen sind derzeit in klinischen Studien eingesetzt und zeigen höhere Wirksamkeit und bessere Verträglichkeit als Statine4. Der Erfolg von PCSK9 Antikörpern impliziert auch, dass möglicherweise gibt es andere Therapiemöglichkeiten den LDLR-Abbau-Weg (neben PCSK9) bei Patienten mit Hypercholesterinämie zu modulieren. Ebenso gibt es Interesse an der Entwicklung neuer Inhibitoren des PCSK9 als Antikörper, z. B. SiRNA Oligos5.
Um zu testen, neue Therapien für FH und im Allgemeinen jede andere Art von Hypercholesterinämie, sind geeignete in-Vivo -Modelle notwendig. Ein Hauptproblem der aktuellen in-Vivo -Modelle, meist Mäuse6 und7, Kaninchen sind ihre physiologische Unterschiede mit den Menschen. Entscheidend ist, gehören diese Probleme eine unterschiedliche metabolische Lipidprofil. Die Generation der menschlichen Leber Chimären Tiere8 könnte helfen, diese Einschränkung zu überwinden. Die menschliche Leber Chimäre Maus ist eine Art von "humanisierte" Maus mit seiner Leber aufgefüllt mit humanen Hepatozyten, z. B. primären humanen Hepatozyten (pHH)9. Ein Problem mit pHH ist, dass sie schnell erweiterte Ex Vivo, nicht verlieren ihre Funktion bei der Isolierung und eine begrenzte Quelle sind. Eine Alternative zu pHH ist die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleitet von Hepatozyten (iHeps)10. Vor allem iPSCs sind patientenspezifischen und auf unbestimmte Zeit, so dass iHeps on Demand produziert werden kann, ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber frischen pHH angebaut werden können. Darüber hinaus können iPSCs auch leicht gentechnisch werden mit Designer Nukleasen zu korrigieren oder Mutationen in einem isogenen Hintergrund erlauben mehr Treue Vergleiche11vorstellen.
Menschlichen Leber chimärer Maus mit eingepflanzt pHH zeigen Ähnlichkeiten zu den Menschen in der Leber Stoffwechselprofile, Medikament Antworten und Anfälligkeit für Hepatitis-Virus-Infektion-12. Dadurch haben sie ein gutes Modell, Hyperlipidämie in Vivozu studieren. Die am häufigsten verwendete Mausmodelle basieren auf der/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (BRD) Maus13 und der uPA transgenen Maus8, in dem bis zu 95 % der Maus Leber durch pHH ersetzt werden kann. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschriebenen Interessanterweise eine menschliche Leber FH Chimäre Maus (bezogen auf die BRD-Maus) mit pHH von einem Patienten mit einem homozygot LDLR Mutation14. In diesem Modell Waldlandschaften humanen Hepatozyten hatte keine funktionale LDLR, aber die restlichen Maus Hepatozyten haben, wodurch das Dienstprogramm für die Durchführung von in-Vivo Tests von Medikamenten unter Berufung auf die LDLR-Weg.
Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll basierend auf unserer kürzlich veröffentlichtes Werk15 für FH-iHeps in die/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) Maus Leber Einpflanzen. Diese menschlichen Leber chimärer Maus eignet sich für die FH Modellierung und Durchführung von Drogentests in-vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>B4-VW-352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>Extracellular matrix coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6625</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>IW-1100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>TrypLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10829</td>
			<td>Knockout DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td>0.5 M, PH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for cell suspension)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for iHep differentiation)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat and high-cholesterol diet</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12079B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human hepatocyte growth factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC maintenance medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>mTeSR1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL-C detection kit</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>993-00404 and 993-00504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium&#160;chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P25108</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NADA 141-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>USB</td>
			<td>S20227</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>Calcium and magnesium-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCSK9 antibodies</td>
			<td>Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td>SAR236553/REGN727</td>
			<td>Alirocumab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenobarbital</td>
			<td>Alfamedic company</td>
			<td>013003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>RBI</td>
			<td>P-133</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated petri dish</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simvastatin</td>
			<td>Merck Sharp &#38; Dohme</td>
			<td>ZOCOR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-46619</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16450</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAT</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0012</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALB</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A80-129</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASGPR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-28977</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4A</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-6557</td>
			<td>1:35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0020</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0023</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il2rg-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>003174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ldlr-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>002077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag2-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>008449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Countess</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma irradiator</td>
			<td>MDS Nordion</td>
			<td>Gammacell 3000 Elan II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Model 8/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides scanning system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>Aperio scanScope system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding Microtome</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicrocope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>ASP200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire myograph</td>
			<td>DMT</td>
			<td>610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital slide viewing software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Aperio ImageScope Version 12.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.51e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CC Version 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>AxioVision LE Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes

Familiäre Hypercholesterinämie (FH) wird meist von geringer Dichte Lipoprotein (LDLR)-Rezeptor-Mutationen verursacht und führt zu einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen früh einsetzende durch deutliche Erhöhung von LDL-Cholesterin (LDL-C) im Blut. Statine sind die erste Zeile von lipidsenkenden Medikamenten zur Behandlung von FH und andere Arten von Hypercholesterinämie, aber neue Ansätze entstehen in bestimmten PCSK9-Antikörpern, die nun in klinischen Studien getestet werden. Um neue therapeutische Ansätze für FH, neue Medikamente oder neue Rezepturen erforschen müssen wir in Vivo Modelle geeignet. Bestehen jedoch Unterschiede in der Lipid-Stoffwechselprofile im Vergleich zu Menschen ein zentrales Problem der verfügbaren Tiermodellen der FH. Um dieses Problem zu beheben, haben wir eine menschliche Leber chimärer Mausmodell mit FH induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) erzeugt-Hepatozyten (iHeps) abgeleitet. Wir verwendeten/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) Mäuse Immunabwehr von transplantierten menschlichen Zellen zu vermeiden und Beurteilung der Wirkung des LDLR-mangelhafte iHeps in ein LDLR null Hintergrund. Transplantierten FH iHeps könnte wieder zu bevölkern ca. 5-10 % der LRG Maus Leber basierend auf menschliches Albumin-Färbung. Darüber hinaus die eingepflanzt iHeps reagierte auf Lipidsenker und rekapitulierte klinische Beobachtungen der erhöhte Wirksamkeit der PCSK9 Antikörper gegenüber Statinen. Unsere menschlichen Leber Chimäre Modell könnte somit für präklinischen Erprobung neuer Therapien zur FH nützlich sein. Mit dem dasselbe Protokoll, ähnlich wie menschliche Leber chimeric Mäuse für andere FH genetische Varianten oder Mutationen, die entsprechend andere erblichen Erkrankungen der Leber kann auch generiert werden.

Gerichtete Differenzierung der menschlichen iPSCs in iHeps Beim Zusammenfluss von 70 % zu erreichen, werden menschliche iPSCs in iHeps mit einem 3-Stufen-Protokoll16 (Abbildung 1 obere Leiste) unterschieden. Nach 3 Tagen Entoderm Differenzierung werden iPSC Kolonien gelockert und breitete sich auf volle Zusammenfluss (Abbildung 1 untere Leiste). Dann mit 2Nd Stufe Mittel, Hep...

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A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine menschliche Leber chimärer Maus-Modell der Familiäre Hypercholesterinämie mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten zu generieren. Dies ist ein wertvolles Modell zum Testen neuer Therapien für Hypercholesterinämie.

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Diese Methode hat wichtige Fragen auf dem Gebiet beantwortet, wie ein menschliches Leber chimer Mausmodell zu generieren, familiäre Hypercholesterinämie. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Durchführung von Drogentests in in vivo ermöglicht. Diese Technik hat Syndizierung für die Behandlung von familiärer Hypercholesterinämie.Als neue Therapie für diese Krankheit, Kann es mit solchen chimer Tiermodellen getestet werden. Obwohl diese Methode Einblick in familiäre Hypercholesterinämie bieten kann, Es kann auch auf andere vererbte Lebererkrankungen angewendet werden. 24 Stunden vor der Transplantation 40 Mikroliter extrazelluläre Matrix pro Maus auftauen, indem Sie sie in einer Eisbox in einem kalten Raum aufstellen.Kühlen Sie eine Insulinspritze für jede zu injizierende Maus und eine Box mit 200 Mikroliter Spitzen in einem Vier-Grad-Kühlschrank Celsius. Eine Stunde vor der Engraftment, erwärmen Sie das Zelldissoziationsenzym, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter DNAase 1, auf Raumtemperatur und platzieren RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 20 Prozent Serumersatz auf Eis. Nehmen Sie Phasenkontrastbilder von iHeps, um ihren Status aufzuzeichnen, einschließlich Zellmorphologie, Wachstum und Zelldichte.Als nächstes waschen Sie jeden Brunnen von iHeps mit 2 Milliliter Raumtemperatur Kalzium und Magnesium ionfreie PBS zweimal und fügen Sie dann einen Milliliter des vorgewärmten Zelldissoziationsenzyms zu jedem Brunnen hinzu. Geben Sie die Zellen für acht bis zehn Minuten in den Inkubator zurück. Überwachen Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop.Wenn die meisten Zellen rund werden, fügen Sie in gleichem Volumen des kalten Mediums pro Brunnen, Pipette die Zellen sanft von der Platte zu lösen, und übertragen Sie die Zellsuspension zu einem neuen 15 Milliliter Rohr. Dieser Schritt ist entscheidend für die Zuverlässigkeit der Hepatozyten. Wenn die Zellen schwer von der Platte zu lösen sind, können einige auf der Platte gelassen werden.Und wenn sich die Zellen lösen, dann Pipette sanft nach der Zentrifugation, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Wiederholen Sie den Zellablösungsvorgang für jeden Brunnen, bis fast alle angeschlossenen Zellen gesammelt sind. Dann Zentrifuge bei 200 g für drei Minuten bei vier Grad Celsius.Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit zwei Milliliterkaltem PBS in der 15 Milliliter-Röhre wieder auf. Pipette die Zellen sanft, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Übergeben Sie dann die Zellen durch ein 40-Mikron-Zellsieb, um Aggregate zu entfernen.Normalerweise können ein bis zwei Millionen Zellen nach wenigen Minuten geerntet werden. Als nächstes fügen Sie Mikroliter von 0,4 Prozent Trypan blue Lösung zu 20 Mikroliter Zellsuspension hinzu. Zählen Sie die Zellen und zeichnen Sie die Konzentration der Zellsuspension als C.Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension, um eine Million Zellen pro Maus zu injizieren.Dann das benötigte Volumen der Zellsuspension in 15 Milliliter-Röhren und Zentrifuge bei 200 g für drei Minuten bei vier Grad Celsius zuordnen. Nach dem Entfernen des Überstandes, setzen Sie die Zellen in 27,5 Mikroliter kalte PBS pro Maus wieder auf. Und dann fügen Sie ein gleiches Volumen der extrazellulären Matrix für ein endgültiges Volumen von 55 Mikroliter pro Maus hinzu.Legen Sie nun eine der kalten Insulinspritzen auf Eis. Ziehen Sie den Kolben ab, übertragen Sie 55 Mikroliter Zellaufhängung in die Spritze und legen Sie den Kolben zurück. Blasen vorsichtig entladen und die Spritze wieder auf Eis legen.Stellen Sie sicher, dass LRG-Mäuse ordnungsgemäß anästhesien, bevor Sie mit der Injektion beginnen. Tragen Sie die tierärztliche Salbe über die Augen auf, um Trockenheit während des Anästhesieverfahrens zu verhindern. Sobald die Maus den Muskelreflex zur Stimulation verloren hat, legen Sie sie in die rechte, seitliche, dekubitus Position.Tragen Sie eine dicke Schicht Enthaarungscreme auf den Schnittbereich in der linken Flanke auf und lassen Sie sie fünf bis acht Minuten lang stehen. Entfernen Sie die Enthaarungscreme und das Haar, indem Sie den Bereich mit einem wasserbefeuchteten Gazepad abwischen. Scheuern Sie die linke Flanke mit 70 Prozent Ethanol dreimal.Dann finden Sie die Milz, die in der linken Flanke zu sehen ist. Gefolgt von einem abschließenden Einweichen mit Betadine zur Desinfektion. Nach der Verwendung der Schere, um einen 0,5 bis 1 Zentimeter Schnitt in der Haut und Bauchwand zu machen, verwenden Sie Zangen, um die Milz zu exteriorisieren, indem Sie das umgebende Fettgewebe sanft ziehen.Die Milz mit einem Tupfer vorsichtig stabilisieren. Setzen Sie die Nadel der Insulinspritze drei bis vier Millimeter in das Parenchym der Milz ein und injizieren Sie vorsichtig etwa 50 Mikroliter Zellsuspension. Ziehen Sie die Nadel ein und legen Sie einen Wattestäbchen eine Minute lang über die Injektion, um Blutungen und Verschüttungen von Material zu verhindern.Geben Sie die Milz in das Peritoneum zurück und schließen Sie die Wunde mit fünf-oh Nylon Nähten. Nach dem Nähen, legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig mit einfachem Zugang zu Nahrung und Wasser. Beginnen Sie, indem Sie die inneren Organe von der frisch eingeschläferten Maus entfernen, so dass die absteigende Aorta, parallel zur Wirbelsäule, sichtbar ist.Dann sezieren Sie das benachbarte Gewebe, und entfernen Sie das Herz. Verwenden Sie eine feine Schere, um die Aortae zu sezieren, indem Sie jede einzelne in kalte, sauerstoffhaltige Krebslösung setzen. Nach der Entnahme die Aortae in Krebs-Lösung auf eine silikonbeschichtete Petrischale übertragen.Pin das Bindegewebe, um die Aorta-Position zu fixieren, ohne sie zu dehnen. Unter einem sterilen Mikroskop, verwenden Sie feine Zangen und Federschere, um die Aorta frei von dem umgebenden Fett und adventlichem Gewebe zu sezieren, ohne die Gefäßwand zu beschädigen. Schneiden Sie dann jede Aorta in eineinhalb bis zwei Millimeter lange Segmente.Als nächstes schneiden Sie ein zwei Zentimeter langes Stück mit 40 Mikrometer dickem Edelstahldraht und legen Sie es vorsichtig in das Aorta-Lumen ein. Halten Sie den Draht, um das Segment in die drahtige Myographenkammer zu übertragen, die mit sauerstoffhaltiger Krebslösung gefüllt ist. Um die Länge der Aortaesegmente beim Studium der Kontraktilität zu messen, platzieren Sie jedes Segment senkrecht zwischen den Kiefern, und notieren Sie den D1-Wert auf dem Mikrometer.Entfernen Sie dann das Segment und bewegen Sie die Backen zusammen. Zeichnen Sie den D0-Wert auf und berechnen Sie die Länge des Segments. Als nächstes klemmen Sie den Draht ein und befestigen Sie ihn mit dem Schraubendreher, während Sie das ungestreckte Segment zwischen den Backen platzieren.Für die Normalisierung vor dem Experiment, setzen Sie den Myographen auf Null in der ungestreckten Position. Dann bewegen Sie langsam die Kiefer auseinander und beobachten Sie die Aorta-Spannung ändern, bis drei Millinewton erreichen. Nach 15 Minuten die Lösung aus der Myographenkammer abtropfen lassen und durch eine frische Krebslösung ersetzen.Nachdem Sie weitere 15 Minuten gewartet haben, stellen Sie die Spannung erneut auf drei Millinewton ein. Dann ändern Sie die Standard-Krebs-Lösung auf Krebs-Lösung mit 60 Millimolaren Kaliumchlorid ergänzt, um Kontraktion für mindestens fünfzehn Minuten zu induzieren. Spülen Sie mit frischer Krebs-Lösung dreimal, dann fügen Sie steigende Konzentrationen von Phenylephrin.Zum Beispiel 10 Nanomolar bis 100 Mikromolar. Dann, nach dem Waschen mit Standard-Krebs-Lösung, fügen Sie eine einzige Konzentration von Phenylephrin, bei etwa 70 Prozent der maximalen Kontraktion. Wenn die Kontraktion stabil ist, fügen Sie steigende Konzentrationen von Acetylcholin in Zwei-Minuten-Intervallen.Zum Beispiel ein bis drei Nanomolar bis zehn bis dreißig Mikromolar, um Vasodilatation zu induzieren. Dieses Bild zeigt ein repräsentatives, ganzteiliges gescanntes Bild der menschlichen Albuminfärbung in einer Mausleber, die mit lipoprotein-mangelhaften iHeps mit geringer Dichte wiederbefüllt ist. Pfeile zeigen Cluster von menschlichen iHeps in die Mausleber eingepfropft.Die Cluster von transplantierten menschlichen iHeps sind hier genauer zu sehen. Dieses Streudiagramm zeigt den Prozentsatz der neu bevölkerten menschlichen Albumin-positiven Zellen, die iHep-haltigen Bereichen in der Mausleber aus verschiedenen Spender-iPSCs entsprechen. Dies ist ein repräsentatives Bild der immunhistochemischen Färbung für menschliche Kerne in einer Mausleber, mit transplantierter familiärer Hypercholesterinämie iHeps.Die Balkengrafik zeigt den Prozentsatz der neu bevölkerten menschlichen Kerne positive iHeps von verschiedenen Spender-iPSCs in LRG-Mauslebern. Dies sind repräsentative Bilder von menschlichem Albumin und menschlichen Kernen Färbung auf zwei aufeinander folgenden Abschnitten einer Mausleber, wieder bevölkert mit wilden Typ iHeps. Schließlich zeigt dieses Bild endothelabhängige Vasodilatation der Aorta bei familiärer Hypercholesterinämie menschlicher Leber-Chimermäuse, als Reaktion auf die erhöhungen Konzentrationen von Acetylcholin.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche Leber-Chimermäuse mit menschlichen iPSC-abgeleiteten Hepatozyten erzeugt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...