Name: a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes
Uploaded: 2018-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla Shenzhen scienza e tecnologia del Consiglio programma Basic Research (JCYJ20150331142757383), programma di ricerca strategico prioritario dell'Accademia cinese delle scienze (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Consiglio tema basato su ricerca Schema (T12-705/11), programma di cooperazione del Consiglio di sovvenzioni di ricerca della regione amministrativa speciale di Hong Kong e la Fondazione nazionale di scienze naturali di Cina di (N-HKU730/12 e 81261160506), progetto di Team di ricerca di scienze naturali di Guangdong Foundation (2014A030312001), Guangzhou Science e Technology Program (201607010086) e nella provincia del Guangdong scienza e tecnologia programma (2016B030229007 e 2017B050506007).

Tutti i metodi descritti qui che implicano l'uso di animali sono stati approvati dalla Commissione per utilizzare degli animali vivono nell'insegnamento e nella ricerca (CULATR) dell'Università di Hong Kong.
1. preparazione e test fenotipici il mouse
<ol><li>
Generazione di topi knockout (KO) di Ldlr immunodeficienti.
	<ol>
<li>Utilizzare il topi ceppi Ldlr- / - Rag2- / -e Il2rg- / - (Vedi Tabella ...

<ol>
	<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor-mediated+pathway+for+cholesterol+homeostasis.">A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis.</a> Science. 232 (4746), 34-47 (1986).</li><li>Endo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+HMG-CoA+reductase+inhibitors.">The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.</a> J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).</li><li>Dubuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+upregulate+PCSK9,+the+gene+encoding+the+proprotein+convertase+neural+apoptosis-regulated+convertase-1+implicated+in+familial+hypercholesterolemia.">Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).</li><li>Robinson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+alirocumab+in+reducing+lipids+and+cardiovascular+events.">Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events.</a> N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).</li><li>Fitzgerald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+an+RNA+interference+drug+on+the+synthesis+of+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+and+the+concentration+of+serum+LDL+cholesterol+in+healthy+volunteers:+a+randomised,+single-blind,+placebo-controlled,+phase+1+trial.">Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial.</a> Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+inbreeding+of+rabbits+with+hereditary+hyperlipidemia+(WHHL-rabbit).">Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit).</a> Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).</li><li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs.">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations.">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li><li>Bissig, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+chimeric+mice+provide+a+model+for+hepatitis+B+and+C+virus+infection+and+treatment.">Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment.</a> J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).</li><li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-)+mice.">Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice.</a> Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).</li><li>Bissig-Choisat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+rescue+of+human+familial+hypercholesterolaemia+in+a+xenograft+mouse+model.">Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model.</a> Nat Commun. 6, 7339 (2015).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+liver+chimeric+mice+with+hepatocytes+from+familial+hypercholesterolemia+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).</li><li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+hyperbilirubinemia+in+gunn+rats+after+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).</li><li>Ortmann, D., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Variability of human pluripotent stem cell lines.</a> Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).</li><li>Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+regeneration+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+diverse+origins.">In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins.</a> Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).</li></ol>

Gli studi precedenti utilizzando iHeps in roditori hanno confermato che sono un modo efficace per studiare malattie ereditate del fegato17. Ulteriormente espandere l'uso di questa tecnologia e perché attuali modelli animali di FH sono suboptimali, abbiamo engrafted FH iHeps in topi LRG e ha dimostrato che il engrafted LDLR + /- o eterozigoti LDLR-mutato FH iHeps può ridurre il livello di LDL-C del plasma di topi e rispondere alla riduzione dei lipidi droga in vivo....

Del ricevitore della lipoproteina a bassa densità (LDLR) acquisisce il colesterolo di LDL (LDL-C) nel sangue di modulare la sintesi del colesterolo nel fegato. Le mutazioni nel gene LDLR sono la causa più frequente di ipercolesterolemia familiare (FH)1. Le statine sono state tradizionalmente la prima linea del farmaco per il trattamento di FH e altri tipi di ipercolesterolemia (ereditato o acquisito). Le statine inibiscono 3-idrossi-3-methylglutaryl-coenzyme una riduttasi per abbassare la sintesi del colesterolo nel fegato2. Inoltre, le statine aumentano i livelli LDLR sulla superficie dell'epatocita per promuovere del plasma LDL-C liquidazione. Tuttavia, un avvertimento importante del trattamento con statine è che simultaneamente inducono l'espressione di proteina convertasi subtilisin/hexin 9 (PCSK9), un enzima che si lega al LDLR per promuovere la sua degradazione3. Questo effetto è responsabile per la risposta insufficiente o anche null alle statine osservate in molti pazienti. Studiando questo meccanismo ha, inaspettatamente, ha portato alla scoperta di un modo alternativo per il trattamento di ipercolesterolemia. PCSK9 anticorpi recentemente approvati dalla FDA sono attualmente utilizzati negli studi clinici e mostrano più alta efficacia e migliore tolleranza quanto le statine4. Il successo di PCSK9 anticorpi implica anche che ci possono essere altre possibilità terapeutiche di modulare la via di degradazione di LDLR (oltre PCSK9) in pazienti con ipercolesterolemia. Allo stesso modo, c'è interesse nello sviluppo di nuovi inibitori di PCSK9 diverso da anticorpi, ad esempio, siRNA oligos5.
Per testare nuove terapie per FH e in generale qualsiasi altro tipo di ipercolesterolemia, appropriato in vivo modelli sono necessari. Un grave problema di corrente in vivo modelli, per lo più topi6 ed i conigli7, sono loro differenze fisiologiche con gli esseri umani. Fondamentalmente, questi problemi includono un profilo metabolico dei lipidi differenti. La generazione di animali chimerici del fegato umano8 potrebbe aiutare a superare questo avvertimento. Il mouse chimerico del fegato umano è un tipo di mouse "umanizzato" con il suo fegato ripopolato con epatociti umani, ad esempio, epatociti umani primari (pHH)9. Un problema con pHH è che non possono essere espanse ex vivo, rapidamente perdono la loro funzione all'isolamento, e sono una fonte limitata. Un'alternativa a pHH è l'uso di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)-derivato di epatociti (iHeps)10. In particolare, iPSCs sono paziente-specifici e possono essere coltivate all'infinito, così iHeps può essere prodotta su richiesta, che è un vantaggio significativo rispetto pHH fresco. Inoltre, iPSCs può anche essere facilmente geneticamente con design nucleasi di correggere o introdurre mutazioni in un background isogeniche per consentire più fedele confronti11.
Umano del fegato mouse chimerici con engrafted pHH mostrano somiglianze agli esseri umani in profili metabolici del fegato, le risposte farmacologiche e suscettibilità all' infezione di epatite virus12. Questo li rende un buon modello per studiare iperlipidemia in vivo. I modelli di mouse più ampiamente usati sono basati il/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (RFG) del mouse13 e l'uPA topo transgenico8, in cui fino al 95% del mouse fegato può essere sostituito da pHH. È interessante notare che, un recente rapporto descritto un umano FH del fegato chimerico topo (basato sul mouse RFG) con pHH da un paziente che trasporta una mutazione di omozigoti LDLR 14. In questo modello, gli epatociti umani ripopolati non avevano nessun LDLR funzionale, ma gli epatociti residua del mouse fatto, riducendo così l'utilità per l'esecuzione di test in vivo di farmaci basandosi sulla via di LDLR.
Qui, segnaliamo un protocollo dettagliato basato sul nostro lavoro recentemente pubblicato15 per capacità di integrazione iHeps FH in fegato del topo/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG). Questo mouse chimerico del fegato umano è utile per la modellazione FH ed esecuzione di test anti-droga in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>B4-VW-352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>Extracellular matrix coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6625</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>IW-1100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>TrypLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10829</td>
			<td>Knockout DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td>0.5 M, PH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for cell suspension)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for iHep differentiation)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat and high-cholesterol diet</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12079B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human hepatocyte growth factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC maintenance medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>mTeSR1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL-C detection kit</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>993-00404 and 993-00504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium&#160;chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P25108</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NADA 141-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>USB</td>
			<td>S20227</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>Calcium and magnesium-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCSK9 antibodies</td>
			<td>Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td>SAR236553/REGN727</td>
			<td>Alirocumab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenobarbital</td>
			<td>Alfamedic company</td>
			<td>013003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>RBI</td>
			<td>P-133</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated petri dish</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simvastatin</td>
			<td>Merck Sharp &#38; Dohme</td>
			<td>ZOCOR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-46619</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16450</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAT</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0012</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALB</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A80-129</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASGPR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-28977</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4A</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-6557</td>
			<td>1:35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0020</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0023</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il2rg-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>003174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ldlr-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>002077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag2-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>008449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Countess</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma irradiator</td>
			<td>MDS Nordion</td>
			<td>Gammacell 3000 Elan II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Model 8/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides scanning system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>Aperio scanScope system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding Microtome</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicrocope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>ASP200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire myograph</td>
			<td>DMT</td>
			<td>610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital slide viewing software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Aperio ImageScope Version 12.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.51e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CC Version 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>AxioVision LE Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes

Ipercolesterolemia familiare (FH) è principalmente causata da mutazioni del recettore (LDLR) di lipoproteina a bassa densità e si traduce in un aumentato rischio di malattia cardiovascolare precoce a causa di profonda elevazione del colesterolo LDL (LDL-C) nel sangue. Le statine sono la prima linea di farmaci ipolipemizzanti per il trattamento di altri tipi di ipercolesterolemia e FH, ma stanno emergendo nuovi approcci, in particolari anticorpi di PCSK9, che sono ora in fase di sperimentazione in studi clinici. Per esplorare nuovi approcci terapeutici per FH, nuovi farmaci o nuove formulazioni, abbiamo bisogno del caso in vivo modelli. Tuttavia, le differenze nei profili del lipido metabolica rispetto agli esseri umani sono un problema chiave dei modelli animali disponibili di FH. Per risolvere questo problema, abbiamo generato un modello di topo chimerico del fegato umano utilizzando cellule staminali pluripotenti FH indotta (iPSC)-derivato epatociti (iHeps). Abbiamo usato i topi/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) per evitare il rigetto immunitario delle cellule umane trapiantate e per valutare l'effetto di LDLR-iHeps carente in un LDLR null sfondo. IHeps FH trapiantati potrebbe ripopolare 5-10% del fegato del topo LRG basato sulla macchiatura di albumina umana. Inoltre, la iHeps engrafted ha risposto ai farmaci ipolipemizzanti e ricapitolato osservazioni cliniche di efficacia aumentata di PCSK9 anticorpi rispetto alle statine. Nostro modello chimerico del fegato umano potrebbe così essere utile per i test preclinici di nuove terapie per FH. Utilizzando il protocollo stesso, topi chimerici del fegato umani simili per altre varianti genetiche FH, o mutazioni corrispondenti alle altre malattie ereditarie del fegato, può essere generato anche.

Differenziazione di umano diretto iPSCs in iHeps Quando si raggiunge il 70% confluenza, iPSCs umane sono differenziati in iHeps con un protocollo 3-passo16 (Figura 1 pannello superiore). Dopo 3 giorni di differenziazione endoderma, iPSC colonie diventano allentati e diffusa in piena confluenza (Figura 1 pannello inferiore). Poi, con 2nd stage medio, hepatoblasts apparire e pr...

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A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Un modello di Mouse chimerici del fegato umano di ipercolesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello del mouse chimerici del fegato umano di hypercholesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Si tratta di un modello valido per testare nuove terapie per ipercolesterolemia.

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Questo metodo ha risposto a domande chiave sul campo, come come generare un modello di topo chimerico epatico umano, ipercolesterolemia familiare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di eseguire test antidroga in vivo. Questa tecnica ha syndication per i trattamenti dell'ipercolesterolemia familiare.Come nuova terapia per questa malattia, può essere testato utilizzando tali modelli animali chimerici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'ipercolesterolemia familiare, può anche essere applicato ad altre malattie epatiche ereditarie. 24 ore prima dell'innesto, scongelare 40 microlitri di matrice extracellulare per topo, posizionandoli in una ghiacciaia, in una stanza fredda.Raffreddare una siringa per insulina per ogni topo da iniettare e una scatola di 200 punte di microliter in un frigorifero di quattro gradi Celsius. Un'ora prima dell'innesto, riscaldare l'enzima di dissociazione cellulare, integrato con 50 microgrammi per millilitro di DNAasi 1, a temperatura ambiente e posizionare RPMI 1640 medium, integrato con sostituzione del siero al 20% sul ghiaccio. Scatta immagini di contrasto di fase di iHeps per registrarne lo stato, tra cui morfologia cellulare, crescita e densità cellulare.Successivamente, lavare ogni pozzo di iHeps con 2 millilitri di PBS privo di ioni di calcio e magnesio a temperatura ambiente due volte e quindi aggiungere un millilitro dell'enzima di dissociazione cellulare preriscaldato ad ogni pozzo. Riportare le cellule nell'incubatrice per otto o dieci minuti. Monitorare la morfologia cellulare al microscopio.Quando la maggior parte delle cellule diventa rotonda, aggiungere lo stesso volume di mezzo freddo per pozzo, pipettare delicatamente le celle per staccarsi dalla piastra e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 15 millilitri. Questo passaggio è fondamentale per l'affidabilità degli epatociti. Se le cellule sono difficili da staccare dalla piastra, alcune possono essere lasciate sul piatto.E se le cellule si staccano, quindi pipettare delicatamente dopo la centrifugazione, per ottenere una sospensione a cella singola. Ripetere la procedura di distacco cellulare per ogni pozzo fino a quando non vengono raccolte quasi tutte le cellule attaccate. Quindi centrifugare a 200 g per tre minuti a quattro gradi celsius.Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le cellule con due millilitri di PBS freddo nel tubo dei quindici millilitri. Pipettare delicatamente le celle per ottenere una sospensione a cella singola. Quindi, passare le cellule attraverso un colino cellulare da 40 micron per rimuovere gli aggregati.Normalmente, da uno a due milioni di cellule circa possono essere raccolte dopo pochi ter-ing. Aggiungere quindi microlitri dello 0,4% di soluzione blu Trypan a 20 microlitri di sospensione cellulare. Contare le celle e registrare la concentrazione della sospensione cellulare come C.Calcolare il volume richiesto di sospensione cellulare per iniettare un milione di celle per topo.Quindi allocare il volume richiesto di sospensione cellulare in tubi da 15 millilitri e centrifugare a 200 g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il supernatante, sospendere di nuovo le celle in 27,5 microlitri di PBS freddo per mouse. E poi aggiungere un volume uguale di matrice extracellulare per un volume finale di 55 microlitri per mouse.Ora, metti una delle siringhe per insulina fredda sul ghiaccio. Scollegare il pistone, trasferire 55 microlitri di sospensione cellulare nella siringa e quindi rimettere il pistone indietro. Scaricare le bolle con attenzione e rimettere la siringa sul ghiaccio.Assicurarsi che i topi LRG siano adeguatamente anestetizzati prima di iniziare la procedura di iniezione. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura di anestesia. Una volta che il topo ha perso il riflesso muscolare alla stimolazione, posizionarlo nella posizione destra, laterale e decubito.Applicare uno spesso strato di crema depilatoria sull'area di incisione nel fianco sinistro e lasciare per cinque o otto minuti. Rimuovere la crema depilatoria e i capelli pulendo l'area con un cuscinetto di garza inumidito dall'acqua. Strofinare il fianco sinistro con il 70% di etanolo tre volte.Quindi individuare la milza, che può essere vista nel fianco sinistro. Seguito da un'immersione finale con betadina per la disinfezione. Dopo aver usato le forbici per fare un'incisione da 0,5 a un centimetro nella pelle e nella parete addominale, utilizzare le forcelle per esternalizzare la milza tirando delicatamente il tessuto adiposo circostante.Stabilizzare delicatamente la milza usando un tampone. Inserire l'ago della siringa per insulina da tre a quattro millimetri nel parenchima della milza e iniettare delicatamente circa 50 microlitri di sospensione cellulare. Ritrarre l'ago e posizionare un batuffolo di cotone sopra l'iniezione per un minuto per evitare sanguinamenti e fuoriuscite di materiale.Riportare la milza al peritoneo e chiudere la ferita con suture di nylon a cinque ore. Dopo aver suturato, posizionare il mouse in una gabbia pulita con facile accesso a cibo e acqua. Inizia rimuovendo gli organi interni dal topo appena eutanasiato in modo che l'aorta discendente, parallela alla colonna vertebrale, sia visibile.Quindi sezionare il tessuto adiacente e rimuovere il cuore. Utilizzare forbici fini per sezionare le aortae, mettendole in soluzione Krebs fredda e ossigenata. Dopo la raccolta, trasferire l'aortae in soluzione Krebs in una piastra di Petri rivestita in silicone.Fissare il tessuto connettivo per fissare la posizione dell'aorta senza allungarla. Al microscopio sterile, utilizzare forcelle fini e forbici a molla per sezionare l'aorta libera dal grasso circostante e dal tessuto accidentale senza danneggiare la parete del vaso. Quindi tagliare ogni aorta in un segmento di lunghezza da un millimetro e mezzo a due millimetri.Quindi, tagliare un pezzo lungo due centimetri di filo inossidabile spesso 40 micron e inserire delicatamente nell'aorta lumen. Tenere il filo per trasferire il segmento nella camera del miografo del filo, riempita con soluzione krebs ossigenata. Per misurare la lunghezza dei segmenti aortae quando si studia la contrattilità, posizionare ogni segmento perpendicolarmente tra le ganasce e registrare la lettura D1 sul micrometro.Quindi rimuovere il segmento e spostare le mascelle insieme. Registrare la lettura D0 e calcolare la lunghezza del segmento. Quindi, bloccare il filo e fissarlo con il cacciavite mentre si posiziona il segmento non teso tra le ganasce.Per la normalizzazione prima dell'esperimento, impostate il miografo su zero nella posizione non tesa. Quindi spostare lentamente le mascelle a parte e osservare il cambiamento della tensione dell'aorta fino a raggiungere tre millinewton. Dopo 15 minuti, scolare la soluzione dalla camera del miografo e sostituirla con una fresca soluzione Krebs.Dopo aver aspettato altri 15 minuti, regolare nuovamente la tensione a tre millinewton. Quindi cambiare la soluzione Krebs standard in soluzione Krebs integrata con cloruro di potassio da 60 millimolare, per indurre la contrazione per almeno quindici minuti. Risciacquare con soluzione di Krebs fresca tre volte, quindi aggiungere concentrazioni crescenti di fenilefrina.Ad esempio, da 10 nanomolari a 100 micromolari. Quindi, dopo aver lavato con la soluzione di Krebs standard, aggiungere una singola concentrazione di fenilefrina, a circa il 70% della contrazione massima. Quando la contrazione è stabile, aggiungere concentrazioni crescenti di acetilcolina a intervalli di due minuti.Per esempio, da uno a tre nanomolari a dieci-trenta micromolari per indurre la vasodilatazione. Questa immagine mostra un'immagine rappresentativa scansionata a sezione intera della colorazione dell'albumina umana in un fegato di topo ripopolato con iHeps carenti di lipoproteina a bassa densità. Le frecce indicano gruppi di iHeps umani innestati nel fegato del topo.I gruppi di iHeps umani innestati sono visti più in dettaglio qui. Questo grafico scatterplot mostra la percentuale di cellule positive di albumina umana ripopolate corrispondenti a iHep contenenti aree nel fegato di topo, da diversi iPSC donatori. Questa è un'immagine rappresentativa della colorazione immunoistochimica per i nuclei umani in un fegato di topo, con ipercolesterolemia familiare inchiostrata iHeps.Il grafico a barre mostra la percentuale di iHeps positivi dei nuclei umani ripopolati provenienti da diversi iPSC donatori nei fegati di topo LRG. Si tratta di immagini rappresentative dell'albumina umana e dei nuclei umani che si macchiano su due sezioni consecutive di un fegato di topo, ripopolate con iHeps di tipo selvaggio. Infine, questa immagine mostra vasodilatazione dipendente dall'endotelio dell'aorta nei topi chimerici epatici umani ipercolesterolemia familiare, in risposta alle crescenti concentrazioni di acetilcolina.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare topi chimerici epatici umani, usando epatociti derivati dall'iPSC umano.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Pluripotenti cellule staminali derivate cellule cardiache per la riparazione del miocardio

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Analisi elettrofisiologica dei cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CMs) Utilizzando matrici multi-elettrodo (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo derivato dal sangue

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...