Name: a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes
Uploaded: 2018-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Shenzhen vitenskap og teknologi Council grunnleggende forskningsprogram (JCYJ20150331142757383), strategiske prioritet Research Program av det kinesiske vitenskapsakademi (XDA16030502), Hong Kong Research Grant råd tema basert forskning Ordningen (T12-705/11), Samarbeidsprogrammet av tilskudd forskningsråd Hongkong spesiell administrativ Region og National Natural Science Foundation av Kina (N-HKU730/12 og 81261160506) Team forskningsprosjekt Guangdong naturvitenskapen Foundation (2014A030312001), Guangzhou vitenskap og teknologi Program (201607010086), og Guangdong provinsen vitenskap og teknologi Program (2016B030229007 og 2017B050506007).

Alle metodene som er beskrevet her, og som involverer bruk av dyr har blitt godkjent av komiteen for bruk av bo dyrene i undervisning og forskning (CULATR) på Universitetet i Hongkong.
1. musen forberedelse og fenotypiske Testing
<ol><li>
Generering av immunodeficient Ldlr knockout (KO) mus.
	<ol>
<li>Bruke mus stammer Ldlr- / -, Rag2- /-og Il2rg- / - (se Tabell for materiale).</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor-mediated+pathway+for+cholesterol+homeostasis.">A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis.</a> Science. 232 (4746), 34-47 (1986).</li><li>Endo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+HMG-CoA+reductase+inhibitors.">The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.</a> J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).</li><li>Dubuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+upregulate+PCSK9,+the+gene+encoding+the+proprotein+convertase+neural+apoptosis-regulated+convertase-1+implicated+in+familial+hypercholesterolemia.">Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).</li><li>Robinson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+alirocumab+in+reducing+lipids+and+cardiovascular+events.">Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events.</a> N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).</li><li>Fitzgerald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+an+RNA+interference+drug+on+the+synthesis+of+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+and+the+concentration+of+serum+LDL+cholesterol+in+healthy+volunteers:+a+randomised,+single-blind,+placebo-controlled,+phase+1+trial.">Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial.</a> Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+inbreeding+of+rabbits+with+hereditary+hyperlipidemia+(WHHL-rabbit).">Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit).</a> Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).</li><li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs.">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations.">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li><li>Bissig, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+chimeric+mice+provide+a+model+for+hepatitis+B+and+C+virus+infection+and+treatment.">Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment.</a> J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).</li><li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-)+mice.">Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice.</a> Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).</li><li>Bissig-Choisat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+rescue+of+human+familial+hypercholesterolaemia+in+a+xenograft+mouse+model.">Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model.</a> Nat Commun. 6, 7339 (2015).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+liver+chimeric+mice+with+hepatocytes+from+familial+hypercholesterolemia+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).</li><li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+hyperbilirubinemia+in+gunn+rats+after+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).</li><li>Ortmann, D., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Variability of human pluripotent stem cell lines.</a> Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).</li><li>Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+regeneration+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+diverse+origins.">In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins.</a> Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).</li></ol>

Tidligere studier ved hjelp av iHeps i Red har bekreftet at de er en effektiv måte å studere arvet leversykdommer17. Ytterligere utvide bruken av denne teknologien og fordi gjeldende FH dyremodeller suboptimal, vi engrafted FH iHeps i LRG mus og viste at det engrafted LDLR +/- eller heterozygote LDLR-mutert FH iHeps kan redusere mus plasma LDL-C nivå og svare på lipidsenkende legemidler i vivo.
Det er 3 avgjørende skritt i våre protokoll...

Lav tetthet lipoprotein reseptor (LDLR) fanger LDL kolesterol (LDL-C) i blodet å modulere syntesen av kolesterol i leveren. Mutasjoner i genet LDLR er den hyppigste årsaken til familiær hyperkolesterolemi (FH)1. Statiner har tradisjonelt vært den første linjen i medisiner til å behandle FH og andre typer hyperkolesterolemi (arvet eller ervervet). Statiner hemme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym en reduktase å senke kolesterol syntese i leveren2. I tillegg øke statiner LDLR nivåene på hepatocyte overflaten å markedsføre plasma LDL-C klaring. En stor påminnelse behandling med statiner er imidlertid at de samtidig induserer uttrykk for proprotein konvertasene subtilisin/hexin 9 (PCSK9), et enzym som binder til LDLR å fremme sin fornedrelse3. Denne effekten er ansvarlig for tilstrekkelig eller selv null svaret statiner observert i mange pasienter. Studere denne mekanismen har uventet førte til oppdagelsen av en alternativ måte å behandle hyperkolesterolemi. PCSK9 antistoffer nylig godkjent av FDA for tiden blir brukt i kliniske forsøk og vise høyere effekt og bedre toleranse enn statiner4. Suksessen til PCSK9 antistoffer innebærer også at det kan være andre terapeutiske muligheter å modulere LDLR fornedrelse veien (foruten PCSK9) hos pasienter med hyperkolesterolemi. Tilsvarende er det interesse i å utvikle nye hemmere av PCSK9 enn antistoffer, for eksempel siRNA oligos5.
For å teste nye behandlingsformer for FH og generelt andre typen hyperkolesterolemi, er riktig i vivo modeller nødvendig. Et stort problem for gjeldende i vivo modeller, hovedsakelig mus6 og kaniner7, deres fysiologiske forskjeller med mennesker. Avgjørende, inkluderer disse problemene en annen lipid metabolske profil. Generering av menneskelig leveren chimeric dyr8 kan bidra til å overvinne denne påminnelse. Menneskelige leveren chimeric musen er en "humanized" mus med sin lever på nytt med menneskelige hepatocytter, for eksempel primære menneskelige hepatocytter (pHH)9. Et problem med pHH er at de ikke kan utvidet ex vivo, raskt mister sin funksjon på isolasjon, og er en begrenset kilde. Et alternativ til pHH er bruk av indusert pluripotent stamceller (iPSC)-avledet hepatocytter (iHeps)10. Spesielt iPSCs er pasient-spesifikk og kan dyrkes på ubestemt tid, slik at iHeps kan produseres på forespørsel, som er en betydelig fordel over ferske pHH. Videre kan iPSCs også være enkelt genetisk konstruert med designer nucleases eller introdusere mutasjoner i en isogenic bakgrunn å tillate mer trofast sammenligninger11.
Menneskelige leveren chimeric mus med engrafted pHH vise likheter til mennesker i leveren metabolske profiler, narkotika svar og mottakelighet for hepatitt virus infeksjon12. Dette gjør dem en god modell å studere hyperlipidemi i vivo. Den mest brukte musen modeller er basert på/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (FRG) musen13 og uPA transgene musen8, i opptil 95% av musen leveren kan erstattes av pHH. Interessant beskrevet en fersk rapport en menneskelig FH leveren chimeric mus (basert på FRG musen) med pHH fra en pasient med en homozygous LDLR mutasjon14. I denne modellen, de repopulated menneskelige hepatocytter hadde ingen funksjonell LDLR, men gjenværende musen hepatocytter, dermed redusere verktøyet til å utføre i vivo testing av narkotika stole på den LDLR sti.
Vi rapporterer her en detaljert protokoll basert på våre nylig publisert arbeid15 for engrafting FH iHeps inn i/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) musen leveren. Denne menneskelige leveren chimeric musen er nyttig for modellering FH og utføre narkotikatesting i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>B4-VW-352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>Extracellular matrix coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6625</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>IW-1100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>TrypLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10829</td>
			<td>Knockout DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td>0.5 M, PH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for cell suspension)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for iHep differentiation)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat and high-cholesterol diet</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12079B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human hepatocyte growth factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC maintenance medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>mTeSR1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL-C detection kit</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>993-00404 and 993-00504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium&#160;chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P25108</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NADA 141-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>USB</td>
			<td>S20227</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>Calcium and magnesium-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCSK9 antibodies</td>
			<td>Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td>SAR236553/REGN727</td>
			<td>Alirocumab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenobarbital</td>
			<td>Alfamedic company</td>
			<td>013003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>RBI</td>
			<td>P-133</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated petri dish</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simvastatin</td>
			<td>Merck Sharp &#38; Dohme</td>
			<td>ZOCOR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-46619</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16450</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAT</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0012</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALB</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A80-129</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASGPR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-28977</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4A</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-6557</td>
			<td>1:35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0020</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0023</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il2rg-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>003174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ldlr-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>002077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag2-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>008449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Countess</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma irradiator</td>
			<td>MDS Nordion</td>
			<td>Gammacell 3000 Elan II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Model 8/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides scanning system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>Aperio scanScope system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding Microtome</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicrocope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>ASP200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire myograph</td>
			<td>DMT</td>
			<td>610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital slide viewing software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Aperio ImageScope Version 12.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.51e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CC Version 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>AxioVision LE Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes

Familiær hyperkolesterolemi (FH) er hovedsakelig forårsaket av lav tetthet lipoprotein reseptor (LDLR) mutasjoner og resulterer i en økt risiko for tidlig kardiovaskulær sykdom på grunn av merket heving av LDL kolesterol (LDL-C) i blodet. Statiner er den første linjen i lipidsenkende legemidler for behandling av FH og andre typer hyperkolesterolemi, men nye tilnærminger er nye, i bestemt PCSK9 antistoffer, som nå blir testet i kliniske forsøk. For å utforske nye behandlingsmetoder for FH, nye stoffer eller nye formuleringer, trenger vi passende i vivo modeller. Forskjeller i lipid metabolske profiler i forhold til mennesker er imidlertid et viktig problem av tilgjengelige dyr modeller av FH. For å løse dette problemet, vi har generert en menneskelig leveren chimeric musemodell med FH indusert pluripotent stilk cellen (iPSC)-avledet hepatocytter (iHeps). Vi brukte/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) mus å unngå uimottakelig avvisning av transplantert menneskelige celler og å vurdere effekten av LDLR-mangelfull iHeps i en LDLR null bakgrunn. Transplantert FH iHeps kunne gjenbefolke 5-10% av LRG musen leveren basert på menneskelige albumin flekker. Videre engrafted iHeps svart lipidsenkende legemidler og recapitulated kliniske observasjoner av økt effekt av PCSK9 antistoffer sammenlignet statiner. Våre menneskelige leveren chimeric modellen kan dermed være nyttig for prekliniske testing av nye behandlingsformer å FH. Bruke samme protokoll, ligner menneskelige leveren chimeric mus for andre FH genetisk varianter eller mutasjoner tilsvarer andre arvede leversykdom kan også genereres.

Rettet differensiering av menneskelig iPSCs i iHeps Når nå 70% samløpet, skilles menneskelige iPSCs i iHeps med en 3-trinns protokollen16 (figur 1 øvre panel). Etter 3 dager for endoderm differensiering, blir iPSC kolonier løsnet og spres til hele samløpet (figur 1 nedre panel). Deretter med 2nd scenen medium, hepatoblasts vises og sprer. Disse cellene er overfylt, men ...

Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

En familiær hyperkolesterolemi menneskelige leveren Chimeric musemodell med indusert Pluripotent Stamcelle-avledet hepatocytter

Her presenterer vi en protokoll for å generere en menneskelig leveren chimeric musemodell familiær hyperkolesterolemi med menneskelige indusert pluripotent Stamcelle-avledet hepatocytter. Dette er en verdifull modell for å teste nye behandlingsformer for hyperkolesterolemi.

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Denne metoden har besvart viktige spørsmål i feltet, for eksempel hvordan å generere en menneskelig lever chimeric mus modell, familiær hyperkolesterolemi. Den største fordelen med denne teknikken er at den gjør det mulig å utføre narkotikatester in in vivo. Denne teknikken har syndikering for behandlinger av familiær hyperkolesterolemi.Som en ny terapi for denne sykdommen, kan den testes ved hjelp av slike kimeriske dyremodeller. Selv om denne metoden kan gi innsikt i familiær hyperkolesterolemi, kan den også brukes på andre arvelige leversykdommer. 24 timer før engraftment, tine 40 mikroliter ekstracellulær matrise per mus, ved å plassere i en isboks, i et kaldt rom.Chill en insulinsprøyte for hver mus som skal injiseres og en boks med 200 mikroliter tips i en fire graders Celsius kjøleskap. En time før engraftment varmer du celledissosiasjonsenzymet, supplert med 50 mikrogram per milliliter DNAase 1, til romtemperatur og plasser RPMI 1640 medium, supplert med 20 prosent serumerstatning på is. Ta fasekontrastbilder av iHeps for å registrere sin status, inkludert cellemorfologi, vekst og celletetthet.Deretter vasker du hver brønn av iHeps med 2 milliliter romtemperatur kalsium og magnesiumionfri PBS to ganger og legger deretter til en milliliter av det forvarmede celledissosiasjonsenzymet til hver brønn. Returner cellene til inkubatoren i åtte til ti minutter. Overvåk cellemorfologien under mikroskopet.Når de fleste cellene blir runde, legg til like volum kaldt medium per brønn, pipette cellene forsiktig for å løsne fra platen, og overføre cellesuspensjonen til et nytt 15 milliliter rør. Dette trinnet er avgjørende for hepatocytes pålitelighet. Hvis cellene er vanskelige å løsne fra platen, kan noen stå på platen.Og hvis cellene løsner, deretter pipette forsiktig etter sentrifugering, for å få en encellede suspensjon. Gjenta celleavløsningsprosedyren for hver brønn til nesten alle vedlagte celler samles inn. Deretter sentrifuge på 200 g i tre minutter ved fire grader celsius.Etter sentrifugering fjerner du de overnaturante og suspenderer cellene på igjen med to milliliter kald PBS i det femten milliliter røret. Pipette cellene forsiktig for å få en encellede suspensjon. Deretter passerer cellene gjennom en 40 mikron celle sil for å fjerne aggregater.Normalt kan en til to millioner celler om høstes etter få-ter-ing. Deretter legger mikroliter på 0,4 prosent Trypan blå oppløsning til 20 mikroliter cellefjæring. Telle cellene og registrere konsentrasjonen av celle suspensjon som C.Beregn det nødvendige volumet av celle suspensjon å injisere en million celler per mus.Deretter fordele det nødvendige volumet av cellesuspensjon i 15 milliliter rør og sentrifuge ved 200 g i tre minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha fjernet det overnaturante, må cellene suspenderes på en re-suspenderes i 27,5 mikroliter kald PBS per mus. Og legg deretter til et likt volum ekstracellulær matrise for et endelig volum på 55 mikroliter per mus.Legg en av de kalde insulinsprøytene på is. Koble fra stempelet, overfør 55 mikroliter cellefjæring i sprøyten og sett stempelet tilbake. Utslipp bobler nøye, og sette sprøyten tilbake på isen.Sørg for at LRG-mus er riktig bedøvet før injeksjonsprosedyren startes. Påfør veterinær salve over øynene for å forhindre tørrhet under anestesiprosedyren. Når musen har mistet muskelrefleks til stimulering, plasser den til høyre, lateral, decubitus posisjon.Påfør et tykt lag med hårfjerningskrem til snittområdet i venstre flanke, og la stå i fem til åtte minutter. Fjern hårfjerningskrem og hår ved å tørke området med en vannfuktet gasbindpute. Skrubb venstre flanke med 70 prosent etanol tre ganger.Deretter lokaliserer milten, som kan sees i venstre flanke. Etterfulgt av en siste soaking med betadin for desinfeksjon. Etter å ha brukt saks for å lage et 0,5 til en centimeter snitt i hud og bukvegg, bruk tang for å eksteriere milten ved å forsiktig trekke det omkringliggende fettvevet.Stabiliser milten forsiktig ved hjelp av en vattpinne. Sett nålen på insulinsprøyten tre til fire millimeter inn i miltens parenchyma, og injiser forsiktig ca. 50 mikroliter cellefjæring. Trekk nålen tilbake og plasser en bomullspinne over injeksjonen i ett minutt for å forhindre blødning og søl av materiale.Returner milten til bukhinnen, og lukk såret med fem-oh nylon suturer. Etter suturering, legg musen i et rent bur med lett tilgang til mat og vann. Begynn med å fjerne de indre organene fra den nylig eutaniserte musen slik at den synkende aorta, parallelt med ryggraden, er synlig.Deretter dissekere bort det tilstøtende vevet, og fjern hjertet. Bruk fin saks til å dissekere aortae, plassere hver og en i kald, oksygenert Krebs løsning. Etter innsamling, overfør aortae i Krebs løsning til en silikonbelagt petriskål.Fest bindevevet for å fikse aortaposisjonen uten å strekke det. Under et sterilt mikroskop, bruk fine tang og vårsaks for å dissekere aortaen fri fra det omkringliggende fett- og adventitialvevet uten å skade karveggen. Skjær deretter hver aorta i ett og en halv til to millimeter lengde segmenter.Deretter kutter du et to centimeter langt stykke 40 mikron tykk rustfritt ledning, og setter forsiktig inn i aortalumen. Hold ledningen for å overføre segmentet til wire myograph kammeret, fylt med oksygenert Krebs løsning. For å måle lengden på aortaesegmentene når du studerer kontraktilitet, plasserer du hvert segment vinkelrett mellom kjevene og registrerer D1-avlesningen på mikrometeret.Fjern deretter segmentet og flytt kjevene sammen. Registrer D0-lesingen, og beregn lengden på segmentet. Deretter klemmer du ledningen og fester den med skrutrekkeren mens du plasserer det ustretchede segmentet mellom kjevene.For normalisering før eksperimentet, sett myografen til null i ustrukket posisjon. Deretter sakte flytte kjevene fra hverandre og observere aorta spenning endring til nå tre millinewton. Etter 15 minutter, tøm løsningen fra myograph kammeret og erstatte med fersk Krebs løsning.Etter å ha ventet i ytterligere 15 minutter, juster igjen spenningen til tre millinewton. Deretter endrer du standard Krebs-løsning til Krebs-løsning supplert med 60 millimolar kaliumklorid, for å indusere sammentrekning i minst femten minutter. Skyll med fersk Krebs løsning tre ganger, og tilsett deretter økende konsentrasjoner av fenylefrin.For eksempel 10 nanomolar til 100 mikromos. Deretter, etter å ha vasket ut med standard Krebs-løsning, legg til en enkelt konsentrasjon av fenylefrin, på omtrent 70 prosent av maksimal sammentrekning. Når sammentrekningen er stabil, legg til økende konsentrasjoner av acetylkolin med to minutters intervaller.For eksempel, en til tre nanomolar til ti til tretti mikromos for å indusere vasodilatasjon. Dette bildet viser et representativt hele-seksjon skannet bilde av menneskelig albumin farging i en muslever befolket med lav tetthet lipoprotein reseptor-mangelfull iHeps. Piler indikerer klynger av menneskelige iHeps engrafted inn i museleveren.Klyngene av engrafted menneskelige iHeps er sett mer detaljert her. Denne scatterplot grafen viser prosentandelen av repopulated menneskelige albumin positive celler som tilsvarer iHep som inneholder områder i museleveren, fra forskjellige donor iPSCer. Dette er et representativt bilde av immunohistokjemisk farging for menneskelig kjerner i en muselever, med engrafted familiær hyperkolesterolemi iHeps.Stolpediagrammet viser prosentandelen av repopulerte humane kjerner positive iHeps fra forskjellige donor iPSCer i LRG muslevere. Dette er representative bilder av menneskelig albumin og menneskelige kjerner flekker på to påfølgende deler av en muslever, befolket med vill-type iHeps. Til slutt viser dette bildet endotelavhengig vasodilatasjon av aorta i familiær hyperkolesterolemi humane lever chimeric mus, som svar på økende konsentrasjoner av acetylkolin.Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du genererer menneskelige lever chimeric mus, ved hjelp av menneskelige iPSC-avledede hepatocytter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra Frozen Buffy Coats bruker Non-integrere episomal Plasmider

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generasjon Integrerings- fritt menneskeskapte Pluripotent stamceller Bruke Hair-avledet Keratinocytter

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensjonal Kvantifisering av dendrittutløperne fra Pyramideformet Nevroner Avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Pluripotente stamcelle Avledet hjerteceller for Hjerteinfarkt Repair

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Elektrofysiologisk analyse av humane pluripotente stamceller-avledede kardiomyocytter (hPSC-CMer) ved bruk av flere elektrodearrayer (MEA)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differensiering av kondrocytter fra perifert blod-avledede humane inducerte pluripotente stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Integreringsfri avledning av humane inducerte pluripotente stamceller ved bruk av Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Bruker Human indusert Pluripotent Stamcelle-avledet Hepatocyte-lignende celler for medisiner

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic analysen for vurdering av leukocytter vedheft til menneskelig indusert Pluripotent Stamcelle-avledet endotelceller (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...