Name: a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes
Uploaded: 2018-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

Эта работа была поддержана Shenzhen науки и технологии Совета основной исследовательской программы (JCYJ20150331142757383), стратегической приоритетной исследовательской программы Китайской академии наук (XDA16030502), Гонконг грант Совета темы на основе исследования Схема (T12-705/11), программа сотрудничества Фонда Национальный природный науки Китая (N-HKU730/12 и 81261160506), команда исследовательского проекта Гуандун естественных наук и научно-исследовательских грантов Совета Специального административного района Гонконг Фонд (2014A030312001), Гуанчжоу науки и технологий программы (201607010086) и провинции Гуандун науки и технологии программы (2016B030229007 и 2017B050506007).

Все описанные здесь методы, которые предполагают использование животных были утверждены Комитетом по использовать Live животных в области преподавания и научных исследований (CULATR) из университета Гонконга.
1. мышь, подготовка и фенотипические тестирования
<ol><li>
Поко?...

<ol>
	<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor-mediated+pathway+for+cholesterol+homeostasis.">A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis.</a> Science. 232 (4746), 34-47 (1986).</li><li>Endo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+HMG-CoA+reductase+inhibitors.">The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.</a> J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).</li><li>Dubuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+upregulate+PCSK9,+the+gene+encoding+the+proprotein+convertase+neural+apoptosis-regulated+convertase-1+implicated+in+familial+hypercholesterolemia.">Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).</li><li>Robinson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+alirocumab+in+reducing+lipids+and+cardiovascular+events.">Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events.</a> N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).</li><li>Fitzgerald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+an+RNA+interference+drug+on+the+synthesis+of+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+and+the+concentration+of+serum+LDL+cholesterol+in+healthy+volunteers:+a+randomised,+single-blind,+placebo-controlled,+phase+1+trial.">Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial.</a> Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+inbreeding+of+rabbits+with+hereditary+hyperlipidemia+(WHHL-rabbit).">Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit).</a> Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).</li><li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs.">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations.">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li><li>Bissig, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+chimeric+mice+provide+a+model+for+hepatitis+B+and+C+virus+infection+and+treatment.">Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment.</a> J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).</li><li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-)+mice.">Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice.</a> Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).</li><li>Bissig-Choisat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+rescue+of+human+familial+hypercholesterolaemia+in+a+xenograft+mouse+model.">Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model.</a> Nat Commun. 6, 7339 (2015).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+liver+chimeric+mice+with+hepatocytes+from+familial+hypercholesterolemia+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).</li><li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+hyperbilirubinemia+in+gunn+rats+after+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).</li><li>Ortmann, D., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Variability of human pluripotent stem cell lines.</a> Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).</li><li>Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+regeneration+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+diverse+origins.">In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins.</a> Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).</li></ol>

Предыдущие исследования с использованием iHeps грызунов подтвердили, что они являются эффективным способом для изучения наследственных заболеваний печени17. Для дальнейшего расширения использования этой технологии и потому что текущих FH Животные модели субоптимальные, мы ...

Рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR) захватывает LDL холестерина (LDL-C) в крови, чтобы модулировать синтез холестерина в печени. Мутации в гене LDLR являются наиболее частой причиной семейной гиперхолестеринемией (FH)1. Статины традиционно первая линия препаратов для лечения FH и другие виды гиперхолестеринемии (унаследованные или приобретенных). Статины препятствовать 3-гидрокси-3-methylglutaryl кофермент редуктазы снизить синтез холестерина в печени2. Кроме того статины увеличить уровень LDLR на поверхности гепатоцитов содействовать плазмы LDL-C разминирование. Однако основных предостережение лечения статинами является, что они одновременно стимулировать выражение proprotein конвертазы Субтилизин/ОА 9 (PCSK9), фермент, который привязывается к LDLR для содействия ее деградации3. Этот эффект отвечает за недостаточное или даже null ответ на статинов у многих пациентов. Изучая этот механизм неожиданно, привело к открытию альтернативный способ лечения гиперхолестеринемии. PCSK9 антитела, недавно утвержденных FDA в настоящее время используется в клинических испытаниях и показать более высокой эффективности и лучшего терпимости чем статины4. Успех PCSK9 антител также подразумевает, что могут существовать другие терапевтические возможности для модуляции путь деградации LDLR (кроме PCSK9) у больных с гиперхолестеринемией. Аналогичным образом есть интерес к разработке новых ингибиторов PCSK9 помимо антител, например, siRNA oligos5.
Для тестирования новых терапий для FH и вообще любой другой тип гиперхолестеринемии, необходимы соответствующие в естественных условиях модели. Основной проблемой текущего в естественных условиях модели, основном мышей6 и кроликов7, являются их физиологические различия с людьми. Самое главное эти проблемы включают различные липидного метаболизма профиля. Поколение человеческой печени животных химерных8 может помочь преодолеть этот нюанс. Человеческой печени химерных мышь — это тип «гуманизированные» мышь с ее печень, заселена с человека гепатоцитов, например, основного человеческого гепатоцитов (ПГГ)9. Проблема с ПГГ состоит в том, что они не могут быть расширенной ex vivo, быстро теряют свою функцию после изоляции, и ограниченным источником. Альтернативой ПГГ является использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)-производных гепатоцитов (iHeps)10. Примечательно iPSCs конкретного пациента и может выращиваться на неопределенный срок, поэтому iHeps могут быть изготовлены по требованию, которая является значительным преимуществом над свежие ПГГ. Кроме того iPSCs также может быть легко генной инженерии с конструктора nucleases исправления или вводить мутации в isogenic фон, чтобы позволить более верным сравнения11.
Человеческой печени химерных мышь с прижившимися ПГГ показать сходство с людьми в печени метаболические профили, наркотиков ответы и восприимчивость к инфекции вируса гепатита12. Это делает их хорошей моделью для изучения гиперлипидемии в естественных условиях. Наиболее широко используемый мыши модели основаны на/фа- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (ФРГ) мыши13 и УПА трансгенные мыши8, в котором до 95% мыши печени могут быть заменены ПГГ. Интересно, что недавний доклад описал человека FH печени химерных мышь (основанный на мыши ФРГ) с ПГГ от пациента, перевозящих гомозиготных мутации LDLR 14. В этой модели repopulated человека гепатоцитов без функциональных LDLR, но остаточный мыши гепатоцитов сделал, тем самым уменьшая утилита для выполнения в vivo тестирование препаратов, опираясь на LDLR пути.
Здесь мы приводим подробный протокол, основанный на наших недавно опубликованной работе15 за отлаживание FH iHeps в/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) мыши печени. Эта человеческой печени химерных мышь является полезным для моделирования FH и выполнения тестирования на наркотики в vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>B4-VW-352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>Extracellular matrix coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6625</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>IW-1100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>TrypLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10829</td>
			<td>Knockout DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td>0.5 M, PH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for cell suspension)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (for iHep differentiation)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat and high-cholesterol diet</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12079B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human hepatocyte growth factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC maintenance medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>mTeSR1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL-C detection kit</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>993-00404 and 993-00504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium&#160;chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P25108</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NADA 141-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>USB</td>
			<td>S20227</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>Calcium and magnesium-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCSK9 antibodies</td>
			<td>Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td>SAR236553/REGN727</td>
			<td>Alirocumab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenobarbital</td>
			<td>Alfamedic company</td>
			<td>013003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>RBI</td>
			<td>P-133</td>
			<td>Dissolve in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated petri dish</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simvastatin</td>
			<td>Merck Sharp &#38; Dohme</td>
			<td>ZOCOR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-46619</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16450</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAT</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0012</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALB</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A80-129</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASGPR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-28977</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4A</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-6557</td>
			<td>1:35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0020</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>09-0023</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il2rg-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>003174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ldlr-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>002077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag2-/- </td>
			<td>Jacson lab</td>
			<td>008449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Countess</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma irradiator</td>
			<td>MDS Nordion</td>
			<td>Gammacell 3000 Elan II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Model 8/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides scanning system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>Aperio scanScope system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding Microtome</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicrocope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing system</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>ASP200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire myograph</td>
			<td>DMT</td>
			<td>610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital slide viewing software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Aperio ImageScope Version 12.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.51e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CC Version 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>AxioVision LE Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a familial hypercholesterolemia human liver chimeric mouse model using induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes

Семейной гиперхолестеринемией (FH) в основном вызвано мутациями липопротеинов низкой плотности рецептора (LDLR) и приводит к повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний раннего начала из-за заметное повышение ЛПНП в крови холестерина (LDL-C). Статины являются первой линией гиполипидемические препараты для лечения FH и другие виды гиперхолестеринемии, но появляются новые подходы, в частности PCSK9 антител, которые в настоящее время проходит испытания в клинических испытаниях. Изучить новые терапевтические подходы для FH, новых лекарств или новых формулировок, мы должны надлежащим в естественных условиях модели. Однако различия в метаболические профили липидов, по сравнению с людьми являются ключевой проблемой доступных животных моделей FH. Для решения этой проблемы, мы породили модель человеческой печени химерных мыши, с помощью FH индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)-производных гепатоцитов (iHeps). Мы использовали/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) мышах, чтобы избежать иммунной неприятие трансплантированных человеческих клеток и для оценки эффекта LDLR-дефицит iHeps в LDLR null фон. Пересаженные FH iHeps может населить 5-10% печени мыши LRG основе человеческого альбумина пятнать. Кроме того прижившимися iHeps ответил гиполипидемические препараты и резюмировалась клинические наблюдения повышенной эффективности PCSK9 антител, по сравнению с статины. Наши человеческой печени химерных модель таким образом может быть полезным для доклинических испытаний новых терапий для FH. Используя тот же протокол, аналогичных человеческой печени химерных мышей для других генетических вариантов FH или мутации, соответствующий других наследственных заболеваний печени, также могут быть созданы.

Направленного дифференцирования человека iPSCs в iHeps При достижении 70% слияния, человеческие iPSCs дифференцированы в iHeps с 3-х ступенчатая протокол16 (рис. 1 верхняя группа). После 3 дней дифференцировки энтодермы iPSC колонии становятся ...

Watch this Scientific Journal Video about A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes at JoVE.com

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Модель человека печени химерных мыши семейной гиперхолестеринемией, с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов

Здесь мы представляем протокол для создания человеческой печени химерных мыши модели семейной гиперхолестеринемией, используя человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов. Это является полезной моделью для тестирования новых терапий для гиперхолестеринемии.

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Этот метод ответил на ключевые вопросы в этой области, такие как, как генерировать человека печени химерик модели мыши, семейная гиперхолестеринемия. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет проводить тесты на наркотики in vivo. Этот метод имеет синдикации для лечения семейной гиперхолестеринемии.В качестве новой терапии этого заболевания, он может быть протестирован с помощью таких химерных моделей животных. Хотя этот метод может обеспечить понимание семейной гиперхолестеринемии, он также может быть применен к другим наследственным заболеваниям печени. За 24 часа до engraftment, оттепель 40 микролитров внеклеточной матрицы на мышь, поместив в холодильник, в холодной комнате.Охладите инсулиновый шприц для каждой мыши, которая будет введена и коробку 200 микролитров советы в четыре градуса по Цельсию холодильник. За час до engraftment, тепло фермента диссоциации клеток, дополненный 50 микрограммов на миллилитр DNAase 1, к комнатной температуре и место RPMI 1640 среды, дополненный 20 процентов замены сыворотки на льду. Возьмите фазы контрастные изображения iHeps для записи их статуса, в том числе морфологии клеток, роста и плотности клеток.Далее, мыть каждый колодец iHeps с 2 миллилитров комнатной температуры кальция и магния ион-бесплатно PBS в два раза, а затем добавить один миллилитр предварительно разогретого фермента диссоциации клеток к каждому хорошо. Верните клетки в инкубатор на 8-10 минут. Мониторинг морфологии клеток под микроскопом.Когда большинство клеток становятся круглыми, добавить в равном объеме холодной среды на колодец, пипетки клетки осторожно отделить от пластины, и передать клеточной подвески в новую трубку 15 миллилитров. Этот шаг имеет решающее значение для надежности гепатоцитов. Если клетки трудно отделить от пластины, некоторые из них могут быть оставлены на пластине.А если клетки отсоединяются, то пипетка аккуратно после центрифугации, чтобы получить одноклеточную подвеску. Повторите процедуру отслоения клеток для каждой хорошо, пока почти все прилагаемые клетки не будут собраны. Затем центрифуга при 200 г в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию.После центрифугации удалите супернатант и повторно приостановив клетки двумя миллилитров холодного PBS в пятнадцати миллилитровой трубке. Пипетт клетки мягко, чтобы получить одноклеточную подвеску. Затем перейдите клетки через 40 микрон-клеточный ситечко для удаления агрегатов.Как правило, от одного до двух миллионов клеток о могут быть собраны после нескольких тер-ING. Далее добавьте микролитеры 0,4 процента trypan синий раствор 20 микролитров клеточной подвески. Подсчитайте клетки и замечите концентрацию клеточной подвески как C.Calculate необходимый объем клеточной подвески, чтобы ввести один миллион клеток на мышь.Затем выделите необходимый объем клеточной суспензии на 15 миллилитровых трубок и центрифуг при 200 г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта, повторно приостановить клетки в 27,5 микролитров холодного PBS на мышь. А затем добавить равный объем внеклеточной матрицы для конечного объема 55 микролитров на мышь.Теперь поместите один из холодных инсулиновых шприцев на лед. Отключите поршень, перенесите 55 микролитров клеточной подвески в шприц, а затем положите поршень обратно. Разгрузить пузырьки осторожно, и положить шприц обратно на лед.Убедитесь, что мышей LRG должным образом анестезировали перед началом процедуры инъекции. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время процедуры анестезии. После того, как мышь потеряла мышечный рефлекс для стимуляции, поместите его в правильном, боковом, decubitus позиции.Нанесите толстый слой депиляативного крема на область разреза на левом фланге и оставьте на пять-восемь минут. Удалите крем для депиляния и волосы, вытирая область с увлажненной водой марлевой площадкой. Скраб левый фланг с 70 процентов этанола в три раза.Затем найдите селезенку, которую можно увидеть на левом фланге. Затем окончательное замачивания с бетадином для дезинфекции. После использования ножниц, чтобы сделать 0,5 до одного сантиметра разрез в коже и брюшной стенке, использовать миппы для экстерьеризации селезенки, осторожно потянув окружающих жировой ткани.Аккуратно стабилизировать селезенку с помощью тампона. Вставьте иглу инсулинового шприца три-четыре миллиметра в паренхиму селезенки и аккуратно ввишите около 50 микролитров клеточной суспензии. Убирать иглу и поместить ватный тампон над инъекцией в течение одной минуты, чтобы предотвратить кровотечение и утечку материала.Верните селезенку в брюшовую, и закройте рану пятиох нейлоновыми швами. После за шва поместите мышь в чистую клетку с легким доступом к пище и воде. Начните с удаления внутренних органов из свежеухватанной мыши так, чтобы была видна нисходящая аорта, параллельная позвоночнику.Затем вскрыть соседние ткани, и удалить сердце. Используйте тонкие ножницы, чтобы вскрыть аорты, поместив каждый из них в холодный, кислородом Krebs раствор. После сбора перенесите аорты в раствор кребса в силиконовую чашку Петри.Прикрепите соединительной ткани, чтобы исправить положение аорты, не растягивая его. Под стерильным микроскопом используйте тонкие типсы и пружинные ножницы, чтобы вскрыть аорту, свободную от окружающего жира и приключенческой ткани, не повреждая стенку сосуда. Затем разрежьте каждую аорту на сегменты длиной от полутора до двух миллиметров.Затем вырежьте двухметровый кусок 40 микрон толщиной нержавеющей проволоки, и аккуратно вставьте в люмен аорты. Держите провод для переноса сегмента в проволочную миографическую камеру, наполненную кислородным раствором Кребса. Чтобы измерить длину сегментов аорты при изучении контрактности, поместите каждый сегмент перпендикулярно между челюстями и запикаете показания D1 на микрометре.Затем удалите сегмент и переместить челюсти вместе. Запись чтения D0 и рассчитать длину сегмента. Затем зажим провода и закрепте его отверткой, поместив неимовеченный сегмент между челюстями.Для нормализации перед экспериментом установите миограф до нуля в непротянутом положении. Затем медленно перемещать челюсти друг от друга и наблюдать аорты изменения напряжения до достижения трех millinewton. Через 15 минут вылейте раствор из миографической камеры и замените свежим раствором Кребса.Прожгев еще 15 минут, снова отрегулируйте напряжение до трех миллиньютонов. Затем измените стандартный раствор Кребса на раствор Кребса, дополненный хлоридом калия 60 миллимолярия, чтобы вызвать сокращение в течение не менее пятнадцати минут. Промыть свежим раствором Кребса три раза, затем добавить увеличение концентрации фенилэфрина.Например, от 10 наномолярных до 100 микромолеров. Затем, после промывания стандартным раствором Кребса, добавьте одну концентрацию фенилэфрина, около 70 процентов максимального сокращения. Когда сокращение является стабильным, добавить увеличение концентрации ацетилхолина с двухминутными интервалами.Например, от одного до трех наномолярных до десяти до тридцати микромолеров, чтобы вызвать вазодилатации. На этом снимке показано репрезентативное цельное сканирование изображения окрашивания человеческого альбумин в печени мыши, заселенной липопротеиновыми рецепторами низкой плотности. Стрелки указывают на скопления человеческих iHeps, присвятанные в печень мыши.Кластеры engrafted человека iHeps видны более подробно здесь. На этом графике рассеяния показан процент заселенных человеческих альбуминовых положительных клеток, соответствующих iHep, содержащим участки в печени мыши, от различных донорских iPSCs. Это репрезентативное изображение иммуногистохимического окрашивания для ядер человека в печени мыши, с приписки семейной гиперхолестеринемии iHeps.График бара показывает процент заселенных человеческих ядер положительные iHeps от различных донорских iPSCs в печени мыши LRG. Это репрезентативные изображения человеческого альбумин и человеческих ядер окрашивания на двух последовательных участках печени мыши, заселенных диким типом iHeps. Наконец, это изображение показывает эндотелий-зависимых вазодилатации аорты в семейной гиперхолестеринемии печени человека химерных мышей, в ответ на увеличение концентрации ацетилхолина.После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать человека печени химерных мышей, используя человека iPSC полученных гепатоцитов.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из замороженных Баффи пальто с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Генерация Интеграция-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, используя волос производный Кератиноциты

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток сердца для инфарктом Ремонт

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Электрофизиологический анализ кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC-CMs) с использованием многоэлектродных массивов (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Дифференцирование хондроцитов из периферических кроветворных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Интеграция свободной деривации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием матрицы Laminin 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

С помощью человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток получены гепатоцито как клетки для обнаружения наркотиков

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic Assay для оценки лейкоцитарной адгезии к человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных эндотелиальных клеток (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...