Name: exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS understøttes af NSF Graduate Research Fellowship Program.

1. samling og adskillelse af rod Endosphere, rhizosfære og jordprøver
<ol><li>Forudgående at ind i feltet, autoklave ultrarent vand (mindst 90 mL vand pr. prøve) at sterilisere. Forberede epifyt fjernelse buffer (mindst 25 mL pr. sample) ved at tilføje 6,75 g KH2PO4, 8,75 g K2HPO4og 1 mL Triton X-100, 1 L af sterilt vand. Sterilisere bufferen ved hjælp af et vakuum filter med 0,2 µm porestørrelse.<ol>
<li>Til trin 1,2 til 1,5, slid rene handsker steriliseret med ethan...

Denne protokol viser en etableret rørledningen for at udforske rod endosphere, rhizosfære og jord mikrobielle samfund kompositioner, fra feltet prøveudtagning til prøve behandling og downstream sekventering. Studere root-associerede microbiomes præsenterer unikke udfordringer, skyldes dels de iboende vanskeligheder i prøvetagning fra jord. Jord er meget variabel i form af fysiske og kemiske egenskaber og forskellige jordbundsforhold kan være adskilt af så lidt som et par millimeter28,...

Plante-forbundet microbiomes består af dynamiske og komplekse mikrobielle samfund består af bakterier, archaea, vira, svampe og andre mikroorganismer i eukaryote. Ud over deres velundersøgte rolle i forårsager plantesygdomme, kan plante-forbundet mikrober også positivt påvirke plantesundhed ved at forbedre tolerance over for biotisk og abiotisk understreger, at fremme næringsstoftilgængelighed og forbedring af planternes vækst gennem produktion af Phytohormoner. Af denne grund findes særlig interesse i kendetegner de taxa, som forbinder med anlægget rod endospheres, rhizospheres og den omgivende jord. Mens nogle mikrober kan være kulturperler i isolation på laboratoriet genererede medier, mange ikke, dels fordi de kan stole på symbiotiske relationer med andre mikrober, vokser meget langsomt, eller kræver betingelser, der ikke kan genskabes i et laboratoriemiljø. Fordi det omgår behovet for dyrkning og er relativt billig og høj overførselshastighed, er sekvens-baserede fylogenetiske profilering af miljømæssige og vært-associerede mikrobielle prøver blevet en foretrukne metode til paavisning mikrobielle samfund sammensætning.
Udvælgelse af passende sekventering teknologier fra forskellige næste generation sequencing (NGS) platforme1 er afhængig af brugernes behov, med vigtige faktorer herunder: ønskede dækning, amplikon længde, forventes EF mangfoldighed, samt sekventering fejlprocenten, læse-længde og cost-per-run/megabase. En anden variabel, der skal overvejes i amplikon-baserede sekventering eksperimenter er hvad gen vil blive forstærket og hvad primere vil blive brugt. Når designe eller vælge primere, er forskere ofte tvunget til at indgå kompromiser mellem universelle forstærkning af og den taksonomiske opløsning opnåelige fra den resulterende amplikoner. Derfor valgte disse typer af undersøgelser ofte primere og markører, der selektivt målrette specifikke delmængder af microbiome. Evaluering af sammensætningen af bakterielle samfund er almindeligt opnås ved sekventering en eller flere af hypervariable regionerne af bakteriel 16S rRNA gen2,3. I denne undersøgelse, vi beskriver en amplikon baseret sekventering protokol udviklet til en NGS platform mål 500 bp V3-V4 regionen af bakteriel 16S rRNA gen, som giver mulighed for bred forstærkning af bakteriel taxa samtidig også give tilstrækkelig variation til skelne mellem forskellige taxa. Derudover kan denne protokol nemt tilpasses til brug med andre primer sæt, såsom rettet mod ITS2 markøren af svampe eller 18S rRNA underenhed af eukaryoter.
Mens andre tilgange såsom shotgun metagenomics, metatranscriptomics og encellede sekventering, tilbyder andre fordele, herunder løst mikrobielle genomer og mere direkte måling af Fællesskabets funktion, er disse teknikker typisk mere dyrt og beregningskrævende end den fylogenetiske profilering beskrevet her4. Derudover udfører shotgun metagenomics og metatranscriptomics på rod prøver giver en stor procentdel af læser tilhører værten plante genom, og metoder til at overvinde denne begrænsning er stadig at blive udviklet5,6.
Som med enhver eksperimentelle platform, kan amplikon-baserede profilering indføre en række potentielle afvigelser, som bør overvejes under den eksperimentelle design og data analyse. Disse omfatter metoder til prøvetagning, DNA udvinding, udvalg af PCR-primere, og hvordan bibliotek forberedelse udføres. Forskellige metoder kan markant indflydelse på mængden af brugbare data genereret, og kan også hæmme bestræbelserne på at sammenligne resultater mellem undersøgelser. For eksempel, metoden til at fjerne rhizosfære bakterier7 og brugen af forskellige udvinding teknikker eller valg af DNA udvinding kits8,9 har vist sig at betydeligt påvirke downstream analyse, hvilket fører til forskellige konklusioner vedrørende som mikrober er nutid og deres relative mængder. Da amplikon-baserede profilanalyse kan være tilpasset, kan foretage sammenligninger på tværs af undersøgelser være udfordrende. Jorden Microbiome projekt har foreslået, at forskere studerer komplekse systemer som plante-forbundet microbiome ville drage fordel af udviklingen af standardiserede protokoller som et middel til minimering af variation forårsaget af anvendelsen af forskellige metoder mellem undersøgelser10,11. Her vi diskutere mange af de ovennævnte emner, og tilbud forslag til bedste praksis, hvor det er relevant.
Protokollen viser processen med at indsamle jord, rhizosfære og rod prøver fra Sorghum bicolor og uddrager DNA ved hjælp af en veletableret DNA isolering kit11. Vores protokol indeholder desuden en detaljeret amplikon sekventering arbejdsproces, ved hjælp af et almindeligt udnyttede NGS platform, for at bestemme strukturen af den bakterielle samfund12,13,14. Denne protokol er blevet valideret til brug i en bred vifte af plante værter i en nylig offentliggjort undersøgelse af rødder, rhizosfære og tilknyttede jord af 18 monocot arter herunder Sorghum bicolor, Zea mays, og Triticum aestivum15. Denne metode er også blevet valideret til brug sammen med andre markørgener, som det fremgår af dens vellykkede program til at studere de svampe ITS2 markørgen i undersøgelser af agave microbiome16,17 og jordbær microbiome 18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-10/20 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-3810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000027</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 100 &#181;L, and 1000 &#181;L micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000909</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000043</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1122-1830</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm soil sieve</td>
			<td>Forestry Suppliers</td>
			<td>60141009</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reservoirs</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filters (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9933872</td>
			<td>Instructions for use: 
			https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&#38;documentName=B37419AA.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Boardwalk</td>
			<td>7124</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale with 0.001 g resolution</td>
			<td>Ohaus Pioneer</td>
			<td>PA323</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus ultrasonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000908</td>
			<td>Including 50mL and 96-well plate bucket adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic gloves</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerClean kit (optional)</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12877-50</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerSoil kit</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12888-100</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Do not substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon size freezer bags</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini EM Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EM</td>
			<td>Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>Workrite</td>
			<td>J1367</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2 dewar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4150-9000</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water purification system</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SYNS0R0WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4387937</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortars</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-150</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19167032B</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BWK6212</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate sealing film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9684493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-166</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatulas</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNAs - chloroplast and mitochondrial</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure to verify sequence bioinformatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z759015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mallet (optional)</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2258622</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shears or scissors</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89259-936</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shovel</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>2597400</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil core collector (small diameter: &#60;1 inch)</td>
			<td>Ben Meadows</td>
			<td>221700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray bottles</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-395278</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard desalted barcoded primers (10 &#181;M) (Table 1)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E950040015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>B6001W</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere

Det intime samspil mellem plante vært og tilknyttede mikroorganismer er afgørende betydning for anlægget fitness, og kan fremme forbedrede tolerance over for abiotisk understreger og sygdomme. Som plante microbiome kan være meget komplekse, lave omkostninger, er høj overførselshastighed metoder såsom amplikon-baserede sekventering af 16S rRNA-genet ofte at foretrække for kendetegner dets mikrobielle sammensætning og mangfoldighed. Udvælgelse af passende metode når gennemføre sådanne eksperimenter er imidlertid afgørende for at mindske skævheder, der kan vanskeliggøre analyse og sammenligninger mellem prøver og undersøgelser. Denne protokol beskriver i detaljer en standardiseret metode til indsamling og udvinding af DNA fra jord, rhizosfære og rod prøver. Derudover vi fremhæve en veletableret 16S rRNA-amplikon sekventering rørledning, der giver mulighed for udforskning af sammensætningen af bakterielle samfund i disse prøver, og kan nemt tilpasses til andre markørgener. Denne rørledning er blevet valideret for en række plantearter, herunder sorghum, majs, hvede, jordbær og agave, og kan hjælpe med at overvinde problemer forbundet med forurening fra anlægget organeller.

Udfører de anbefalede protokollen bør resultere i et datasæt af indekserede parret ende læser, der kan matches tilbage til hver prøve og tildelt enten en bakteriel operationelle taksonomiske enheder (OTU) eller nøjagtige rækkefølge variant (ESV, også benævnt amplikon sekvens variant (ASV) og sub-operational taksonomisk enhed (sOTU)), afhængigt af downstream analyse. For at opnå høj kvalitet sekvens data, skal der udvises forsigtighed på hvert trin at bevare sammenhængen mel...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Her, beskriver vi en protokol for at opnå amplikon sekvens data af jord, rhizosfære og roden endosphere microbiomes. Denne information kan bruges til at undersøge sammensætningen og mangfoldighed af plante-forbundet mikrobielle samfund, og er velegnet til brug med en bred vifte af plantearter.

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Ecology

Biodiversity and Conservation

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugering Parring Analyser for Sekvens-specifik analyse af Transfer proteiner involveret i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transkriptom Analyse af<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA sekventering data via Tuxedo Suite på Galaxy-projektet

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tovejs Retroviral Integration Site PCR Metode og Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse af Optimal kromosomale placering for en DNA Element i Escherichia coli ved hjælp af en roman Transposon-medieret tilgang

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Forberedelse af prøver og analyser af RNASeq-baseret genekspression Data fra zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

IT analyse af sekvens Data fra Batch gær 2-Hybrid skærme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform

At udforske effekter rumflyvninger på musen fysiologi ved hjælp af den åbne adgang NASA GeneLab Platform

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, sekventering og analysere ekstracellulære MicroRNA fra humane mesenkymale stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomatrod Transformation Efterfulgt af podning med Ralstonia Solanacearum for ligetil genetisk analyse af bakteriel visnesygdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...