Name: exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

이 작업은 농 무부-ARS (CRI 2030-21430-008-00D)에 의해 투자 되었다. TS는 NSF 대학원 연구 친교 프로그램에 의해 지원 됩니다.

1. 수집 및 루트 Endosphere, Rhizosphere, 및 토양 샘플의 분리
<ol><li>이전에 소독을 필드, 압력솥 초순 (샘플 당 물 90 mL 이상)를 입력 합니다. KH2포46.75 g, 8.75 g의 K2HPO4, 살 균 물 1 l 트라이 톤 X-100의 1 mL를 추가 하 여 epiphyte 제거 버퍼 (샘플 당 적어도 25 mL)를 준비 합니다. 0.2 µ m 기 공 크기와 진공 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독.<ol>
<li>1.2 ~ 1.5 단계, 모든 에탄올 소독 깨끗 ...

이 프로토콜에서는 루트 endosphere, rhizosphere, 및 샘플 처리 및 다운스트림 시퀀싱 필드 샘플링에서 토양 미생물 지역 사회 구성에 대 한 설립된 파이프라인을 보여 줍니다. 공부 루트 관련 microbiomes 선물 독특한 도전, 인해 일부 샘플링에서 고유한 어려움에 토양에서. 토양은 매우 변수 육체 및 화학 재산의 점에서 그리고 다른 토양 조건 만큼 약간 몇 밀리미터28,<sup class="xre...

역동적이 고 복잡 한 미생물 지역 사회 박테리아, archaea, 바이러스, 곰 팡이, 그리고 다른 진 핵 미생물의 구성 식물 관련 된 microbiomes에 의하여 이루어져 있다. 식물 질병의 원인에 그들의 잘 공부 역할, 식물 관련 미생물도 긍정적인 영향을 미칠 수 식물 건강 biotic 및 abiotic 스트레스에 내성 개선 하 고, 양분 가용성, 홍보 강화 통해 식물 성장 여 phytohormones의 생산입니다. 이러한 이유로, 특정 관심 taxa 식물 루트 endospheres, rhizospheres, 및 주위 토양 연관 특성화에 존재 합니다. 일부 미생물 실험실 생성 된 미디어에 고립에서 경작 될 수 있다, 하는 동안 많은 수 없습니다, 그들은 다른 미생물과 공생 관계에 따라 달라질 수 있기 때문에 일부 매우 느리게 성장 또는 랩 환경에서 복제 될 수 없는 조건을 요구. 때문에 재배에 대 한 필요를 circumvents 상대적으로 저렴 하 고 높은 처리량, 되었다 환경 및 호스트 관련 미생물 샘플 프로 파일링 계통 발생 시퀀스 기반 미생물 커뮤니티 시 금 선호 하는 방법 구성입니다.
차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼1 다양 한에서 제공 하는 적절 한 시퀀싱 기술의 선택은 사용자의 요구에 따라 포함 하는 중요 한 요소: 원하는 범위, amplicon 길이, 예상 커뮤니티 다양성, 뿐만 아니라 오류 속도, 읽기-길이, 그리고는 비용-당-실행/megabase 시퀀싱. Amplicon 기반 시퀀싱 실험에서 고려 되어야 또 다른 변수 어떤 유전자 증폭 될 것 이며 어떤 뇌관을 사용 됩니다. 때 설계 또는 뇌관을 선택, 연구 결과 amplicons에서 달성 증폭의 보편성과 분류학 해상도 간의 절충이 종종 밖에 없습니다. 이러한 이유로 이러한 유형의 연구는 자주 뇌관 및 마커는 미생물의 특정 하위 집합을 대상으로 선택적으로 선택 했다. 세균성 지역 사회 구성 평가 연속 하나 이상의 세균의 16S rRNA 유전자2,3의 하이퍼 지역 일반적으로 수행 됩니다. 이 연구에서 설명 하는 기반 하는 amplicon 시퀀싱 프로토콜 NGS 플랫폼에 대 한 충분 한 다양성을 제공 하는 동안 세균 taxa의 넓은 확대를 위한 수 있는 세균의 16S rRNA 유전자의 그 대상 500 bp V3-V4 지역 개발 다른 taxa 사이 구별. 또한,이 프로토콜을 쉽게 다른 뇌관 집합, 버섯의 ITS2 마커 나 진핵생물의 18S rRNA 소 단위를 대상으로 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.
다른 접근 같은 샷건 metagenomics, metatranscriptomics, 및 단일 셀 시퀀싱, 이점이 다른 해결된 미생물 게놈 및 커뮤니티 기능의 더 직접적인 측정을 포함 하 여, 이러한 기술은 일반적으로 더는 비싸고 계통 발생 프로 파일링 보다 계산 집중4여기 설명합니다. 또한, 루트 샘플에 샷건 metagenomics 및 metatranscriptomics을 수행 호스트 식물 게놈에 속하는 읽기의 큰 비율 수 있고이 한계를 극복 하는 방법을 여전히 개발된5,6되 고 있습니다.
어떤 실험 플랫폼와 마찬가지로 amplicon 기반 프로 파일링 하는 것은 실험적인 디자인 및 데이터 분석 하는 동안 고려 되어야 하는 잠재적인 편견의 수를 발생할 수 있습니다. 샘플 수집, DNA 추출, PCR 뇌관의 선택 및 라이브러리 준비를 수행 하는 방법을 방법을 포함 됩니다. 다른 방법을 생성 하 고, 사용 가능한 데이터의 양을 크게 영향을 미칠 수 고 또한 연구 사이 결과 비교 하는 노력을 방해 수 있습니다. 예를 들어 rhizosphere 박테리아7 와 다른 추출 기술의 사용 또는 DNA 추출 키트8,9 의 선택 제거 하는 방법 표시 되었습니다 크게 영향을 다운스트림 분석에 이르게 이 관한 미생물은 현재와 그들의 상대 나타났는데 되는 다른 결론 프로 파일링 amplicon 기반 사용자 지정할 수 있습니다, 이후 연구에서 비교를 만드는 전하실 수 있습니다. 지구 Microbiome 프로젝트 공장 관련 미생물 같은 복잡 한 시스템을 공부 하는 연구자의 응용 프로그램에 의해 발생 하는 변화를 최소화 하는 수단으로 표준화 된 프로토콜의 개발에서 도움이 될 것 이라고 제안 했다 연구10,11사이 다른 방법. 여기, 우리가 위의 주제의 대부분을 토론 하 고 어디 유용한 제안을 제공 적절 한.
프로토콜 색 사탕수수 에서 추출 DNA 기초가 DNA 분리 키트11를 사용 하 여 수집, rhizosphere, 토양과 루트 샘플 과정을 보여 줍니다. 또한, 우리의 프로토콜 세균성 지역 사회12,,1314의 구조를 결정 하는 일반적으로 이용한 NGS 플랫폼을 사용 하 여 자세한 amplicon 시퀀싱 워크플로 포함 합니다. 이 프로토콜 식물 뿌리, rhizosphere, 및 사탕수수 색, 지 시 메이 스, 그리고 Triticum aestivum15를 포함 하 여 18 monocot 종의 관련 된 토양의 최근 출판된 연구에 호스트의 넓은 범위에서 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 메서드는 또한 검증 된 다른 마커 유전자와 함께 사용 하기 위해 agave 미생물16,17 및 딸기 미생물 의 연구에 곰 팡이 ITS2 마커 유전자를 공부 하 고 그것의 성공적인 응용 프로그램에서와 같이 18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-10/20 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-3810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000027</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 100 &#181;L, and 1000 &#181;L micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000909</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000043</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1122-1830</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm soil sieve</td>
			<td>Forestry Suppliers</td>
			<td>60141009</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reservoirs</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filters (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9933872</td>
			<td>Instructions for use: 
			https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&#38;documentName=B37419AA.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Boardwalk</td>
			<td>7124</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale with 0.001 g resolution</td>
			<td>Ohaus Pioneer</td>
			<td>PA323</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus ultrasonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000908</td>
			<td>Including 50mL and 96-well plate bucket adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic gloves</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerClean kit (optional)</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12877-50</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerSoil kit</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12888-100</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Do not substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon size freezer bags</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini EM Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EM</td>
			<td>Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>Workrite</td>
			<td>J1367</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2 dewar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4150-9000</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water purification system</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SYNS0R0WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4387937</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortars</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-150</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19167032B</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BWK6212</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate sealing film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9684493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-166</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatulas</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNAs - chloroplast and mitochondrial</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure to verify sequence bioinformatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z759015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mallet (optional)</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2258622</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shears or scissors</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89259-936</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shovel</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>2597400</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil core collector (small diameter: &#60;1 inch)</td>
			<td>Ben Meadows</td>
			<td>221700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray bottles</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-395278</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard desalted barcoded primers (10 &#181;M) (Table 1)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E950040015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>B6001W</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere

공장 호스트와 관련 된 미생물의 친밀 한 상호작용 공장 피트 니스, 결정에 중요 한 이며 abiotic 스트레스와 질병을 향상 된 공차를 육성 하실 수 있습니다. 매우 복잡 한, 낮은-비용 식물 미생물 수, 16S rRNA 유전자의 amplicon 기반 시퀀싱 등 높은 처리량 방법의 미생물 조성과 다양성 특성화에 대 한 선호 많습니다. 그러나, 이러한 실험을 실시 하는 경우 적절 한 방법론의 선택이 어려운 분석 및 샘플 연구 사이의 비교를 만들 수 있는 편견을 감소 시키기를 위해 중요 합니다. 이 프로토콜 수집 및 토양, rhizosphere, 및 루트 샘플에서 DNA 추출에 대 한 표준화 된 방법론을 세부 사항에 설명합니다. 또한, 우리이 샘플에서 세균성 지역 사회 구성의 탐사를 허용 하는 기초가 튼튼한 16S rRNA amplicon 시퀀싱 파이프라인을 선택 하 고 다른 마커 유전자에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 파이프라인 식물 종, 사탕수수, 옥수수, 밀, 딸기, 그리고 용 설 란, 등의 다양 한 검증 되었습니다 그리고 식물 세포에서 오염과 관련 된 문제를 극복 하는 것을 도울 수 있다.

일치 하는 각 샘플을 다시 하 고 어느 박테리아에 할당 될 수 있는 인덱싱된 쌍 간 읽기의 데이터 집합에서 발생 해야 권장된 프로토콜을 수행 조작 상 분류학 단위 (OTU) 또는 정확한 시퀀스 변종 (ESV, amplicon 라고도 시퀀스 변종 (ASV) 및 sub-operational 분류학 단위 (sOTU)), 다운스트림 분석에 따라. 높은-품질 시퀀스 데이터를 얻으려면 해야 합니다 주의 샘플 간에 일관성을 유지 ...

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Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

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