Name: exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS støttes av NSF Graduate Fellowship forskningsprogrammet.

1. innsamling og separasjon av roten Endosphere, Rhizosphere og jordprøver
<ol><li>Før inn feltet autoklav ultrapure vann (minst 90 mL vann per eksempel) å sterilisere. Forberede epiphyte fjerning buffer (minst 25 mL per prøve) ved å legge 6.75 g KH2PO4, 8.75 g K2HPO4og 1 mL av Triton X-100, 1 L sterilt vann. Sterilisere bufferen med et vakuum filter med 0,2 µm porestørrelse.<ol>
<li>Hva 1.2 til 1,5, bruk ren hansker sterilisert med etanol hele tiden og erstatte hanske...

Denne protokollen demonstrerer en etablert rørledning for å utforske roten endosphere, rhizosphere og jord mikrobiell samfunnet komposisjoner, fra feltet prøvetaking prøve behandling og nedstrøms sekvensering. Studere rot-assosiert microbiomes gir unike utfordringer, skyldes delvis til iboende vanskeligheter i prøvetaking fra jord. Jordsmonnet er svært variabel i form av fysiske og kjemiske egenskaper, og ulike jordbunnsforhold kan skilles med så lite som noen få millimeter28,<...

Plante-assosiert microbiomes består av dynamisk og komplekse mikrobielle samfunn som består av bakterier, archaea, virus, sopp og andre eukaryotic mikroorganismer. I tillegg til sine godt studert rolle i forårsaker plante sykdom, kan plante-assosiert mikrober positivt påvirke plante helse forbedre toleranse biotiske og abiotiske påkjenninger, fremmer nærings tilgjengelighet og styrke plantevekst gjennom produksjon av phyto-hormoner. Derfor finnes særlig interesse i karakteriserer taxa som knytter plante rot endospheres, rhizospheres og det omkringliggende jorden. Mens noen mikrober kan kultivert isolert på laboratoriet generert media, kan mange delvis fordi de kan stole på symbiotiske forholdet med andre mikrober, vokser svært sakte, eller krever betingelser som ikke kan bli kopiert i et laboratoriemiljø. Fordi det omgår behovet for dyrking og er relativt billig og høy gjennomstrømming, blitt sekvens-baserte Fylogenetiske profilering av environmental og verts-assosiert mikrobiell prøver foretrukket metode for assaying mikrobielle samfunn komposisjon.
Valg av aktuell sekvensering teknologi fra ulike neste generasjons sekvensering (NGS) plattformer1 er avhengig av brukernes behov, med viktige faktorer inkludert: ønsket dekning, amplicon lengde, forventet samfunnet mangfold, samt sekvensering feil, lese-lengde og kostnad-per-run/megabase. En annen variabel som må vurderes i amplicon-baserte sekvensering eksperimenter er hva gene vil bli forsterket og hva primere skal brukes. Når du utformer eller velge primere, er forskere ofte tvunget foreta avveininger mellom universalitet forsterkning og taksonomisk oppløsningen oppnåelige fra den resulterende amplicons. Derfor valgte slike studier ofte primere og markører som selektivt målrette bestemte delsett av microbiome. Evaluere sammensetningen av bakteriell samfunn oppnås vanligvis ved sekvensering ett eller flere av regionene hypervariable bakteriell 16S rRNA gen2,3. I denne studien, beskriver vi en amplicon basert sekvensering protokoll utviklet for en NGS plattform mål 500 bp V3 V4 regionen av bakteriell 16S rRNA genet, som gir bred forsterkning av bakteriell taxa gir nok variasjon til skille mellom forskjellige taxa. I tillegg kan denne protokollen lett tilpasses for bruk med andre primer sett, som de målretting ITS2 markør for sopp eller 18S rRNA delenhet i eukaryoter.
Mens andre tilnærminger som hagle metagenomics, metatranscriptomics og encellede sekvensering, tilbyr andre fordeler inkludert løst mikrobiell genomes og mer direkte måling av samfunnet funksjonen, er disse teknikkene vanligvis mer dyrt og beregningsmessig intensiv enn Fylogenetiske profilering beskrevet her4. I tillegg utfører hagle metagenomics og metatranscriptomics på roten prøver gir en stor del av leser tilhører verten anlegget genomet, og metoder for å overkomme denne begrensningen er stadig utviklet5,6.
Som med alle eksperimentelle plattformer, kan amplicon-baserte profilering introdusere en rekke potensielle skjevheter som bør vurderes under eksperimentell design og data analysen. Disse omfatter metoder for prøvetaking, DNA ekstrahering, utvalg av PCR primere, og hvordan biblioteket forberedelse utføres. Metoder kan betydelig påvirke mengden brukbare data generert, og kan også hindre innsatsen sammenligne resultater mellom studier. For eksempel metoden å fjerne rhizosphere bakterier7 og bruk av ulike utvinning teknikker eller valg av DNA utvinning kits8,9 har vist betydelig innvirkning nedstrøms analyse, som fører til ulike konklusjoner om som mikrober er tilstede og deres relative antall. Siden amplicon-baserte profilering kan tilpasses, kan foreta sammenligninger over studier være utfordrende. Den jorden Project Microbiome har foreslått at forskere studere komplekse systemer som plante-assosiert microbiome ville ha nytte av utviklingen av standardiserte protokoller som en måte å minimere variasjon forårsaket av anvendelsen av ulike metoder mellom studier10,11. Her diskuterer vi mange av emnene over og tilby forslag til best praksis hvor hensiktsmessig.
Protokoll viser prosessen med å samle jord, rhizosphere og roten prøver fra endringer og utdrager DNA ved hjelp av en veletablert DNA isolering kit11. I tillegg inneholder våre protokollen en detaljert amplicon sekvensering arbeidsflyt, bruker en vanligvis benyttet NGS plattform, til å bestemme strukturen av bakteriell samfunn12,13,14. Denne protokollen er validert for bruk i en rekke anlegget verter i en nylig publisert studie av røtter, rhizosphere og tilknyttet jord av 18 monocot arter inkludert endringer, Zea mays, og Triticum aestivum15. Denne metoden har også blitt godkjent for bruk med andre markør gener, som demonstrert av vellykkede programmet å studere fungal ITS2 markør genet i studier av agave microbiome16,17 og jordbær microbiome 18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-10/20 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-3810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000027</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 100 &#181;L, and 1000 &#181;L micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000909</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000043</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1122-1830</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm soil sieve</td>
			<td>Forestry Suppliers</td>
			<td>60141009</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reservoirs</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filters (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9933872</td>
			<td>Instructions for use: 
			https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&#38;documentName=B37419AA.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Boardwalk</td>
			<td>7124</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale with 0.001 g resolution</td>
			<td>Ohaus Pioneer</td>
			<td>PA323</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus ultrasonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000908</td>
			<td>Including 50mL and 96-well plate bucket adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic gloves</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerClean kit (optional)</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12877-50</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerSoil kit</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12888-100</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Do not substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon size freezer bags</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini EM Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EM</td>
			<td>Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>Workrite</td>
			<td>J1367</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2 dewar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4150-9000</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water purification system</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SYNS0R0WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4387937</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortars</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-150</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19167032B</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BWK6212</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate sealing film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9684493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-166</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatulas</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNAs - chloroplast and mitochondrial</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure to verify sequence bioinformatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z759015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mallet (optional)</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2258622</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shears or scissors</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89259-936</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shovel</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>2597400</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil core collector (small diameter: &#60;1 inch)</td>
			<td>Ben Meadows</td>
			<td>221700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray bottles</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-395278</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard desalted barcoded primers (10 &#181;M) (Table 1)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E950040015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>B6001W</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere

Intime samspillet mellom anlegget vert og tilknyttede mikroorganismer er avgjørende anlegget fitness, og kan fremme forbedret toleranse til abiotiske stress og sykdommer. Som anlegg microbiome kan være svært komplekse, lave kostnader, er høy gjennomstrømming metoder som amplicon-baserte sekvensering av 16S rRNA genet ofte foretrukket for karakteriserer sin mikrobiell sammensetning og mangfold. Valg av riktig metode når du utfører slike eksperimenter er imidlertid avgjørende for å redusere fordommer som kan gjøre analyse og sammenligninger mellom prøver og studier vanskelig. Denne protokollen beskriver i detalj en standardisert metode for innsamling og utvinning av DNA fra jord, rhizosphere og roten prøver. I tillegg vi markere en veletablert 16S rRNA amplicon sekvensering rørledning som gjør utforskning av sammensetningen av bakteriell samfunn i prøvene, og kan lett tilpasses for andre markør gener. Denne rørledningen er validert for forskjellige plantearter, inkludert sorghum, mais, hvete, jordbær og agave, og kan bidra til overvinne problemer forbundet med forurensning fra anlegget organeller.

Utføre det anbefalte protokollen skal resultere i et dataset indekserte sammen-end lyder som kan matchet tilbake til hvert utvalg og tilordnet enten en bakteriell taksonomisk driftsenheter (OTU) eller eksakte sekvensen variant (ESV, også referert til som amplicon sekvensen variant (ASV) og sub-operational taksonomisk enhet (sOTU)), avhengig av nedstrøms. For å få høy kvalitet sekvens databehandling, må utvises på hvert trinn å opprettholde konsekvensen mellom prøvene og minimere...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Her beskriver vi en protokoll for å få amplicon sekvens databehandling jord, rhizosphere og rot endosphere microbiomes. Denne informasjonen kan brukes til å undersøke komposisjon og mangfoldet av plante-assosiert mikrobielle samfunn, og er egnet for bruk med en rekke forskjellige plantearter.

Utforske rot Microbiome: utpakking bakterielle samfunnet Data fra jord, Rhizosphere og rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Ecology

Biodiversity and Conservation

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugerbare Mating Analyser for sekvens-spesifikk analyse av Transfer proteiner involvert i Konjugasjon

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Analyse av Transcriptomic<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA sekvenseringsdata Gjennom Tuxedo Suite på Galaxy-prosjektet

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Toveis retroviral integrasjonssted PCR-metodikk og kvantitativ dataanalyse arbeidsflyt

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Eksempel forberedelse og analyse av RNASeq-baserte genuttrykk Data fra sebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse av sekvens Data fra satsvis gjær 2-Hybrid-skjermer

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform

Utforske romfart effekter på musen fysiologi ved hjelp av Open Access NASA GeneLab plattformen

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia Solanacearum for enkel genetisk analyse av bakteriell wiltsykdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...