Name: exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS é suportado pelo NSF Research Fellowship graduação.

1. recolha e separação de raiz Endosphere, rizosfera e amostras de solo
<ol><li>Antes de entrar em campo, água ultrapura autoclave (pelo menos 90 mL de água por exemplo) para esterilizar. Prepare o buffer de remoção de epífitas (pelo menos 25 mL por amostra), acrescentando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4e 1 mL de Triton X-100, para 1 L de água estéril. Esterilize o buffer usando um filtro de vácuo com tamanho de poro 0,2 µm.<ol>
<li>Para etapas de 1.2 a 1.5, des...

Este protocolo demonstra um pipeline estabelecido para explorar a raiz endosphere, rizosfera e composições de comunidade microbiana do solo, de amostragem de campo de processamento de amostra e sequenciamento a jusante. Estou estudando microbiomes associada a raiz apresenta desafios únicos, devido em parte às dificuldades inerentes em amostragem do solo. Os solos são altamente variável em termos de propriedades físicas e químicas, e as condições do solo diferentes podem ser separadas por tão pouco quanto algun...

Microbiomes planta-associado consistem em comunidades microbianas dinâmicas e complexas, compostas de archaea, bactérias, vírus, fungos e outros microorganismos eucarióticos. Além de seu papel bem estudado em causar doença de planta, planta associada micróbios também positivamente podem influenciar fitossanidade, melhorando a tolerância a estresses bióticos e abióticos, promovendo a disponibilidade de nutrientes e realçando o crescimento das plantas através de a produção de fitohormônios. Por esta razão, particular interesse existe em caracterizar os táxons que associam a planta raiz endospheres, rhizospheres e o solo circundante. Enquanto alguns micróbios podem ser cultivados em isolamento no laboratório de mídia gerado, muitos não podem, em parte porque eles podem confiar em relações simbióticas com outros micróbios, crescem muito lentamente, ou exigem condições que não podem ser replicadas em um ambiente de laboratório. Porque evita a necessidade de cultivo e é relativamente barato e de alta produtividade, baseada em sequência filogenética caracterização das amostras microbianas ambientais e associado anfitrião tornou-se um método preferido para análise do comunidade microbiana composição.
A seleção de tecnologias de sequenciamento apropriados fornecidos por vários próxima geração (NGS) plataformas1 de sequenciamento é dependente de necessidades dos usuários, com importantes fatores incluindo: cobertura desejada, comprimento de amplicons, espera-se comunidade diversidade, bem como taxa de erro, leia-comprimento e o custo-por-gerência/megabase de sequenciamento. Outra variável que precisa ser considerado em experimentos de sequenciamento baseado em amplicon é que gene vai ser amplificado e que as primeiras demão serão usadas. Quando projetando ou escolhendo as primeiras demão, pesquisadores muitas vezes são forçados a fazer compensações entre a universalidade da amplificação e a resolução taxonômica realizáveis dos amplicons resultante. Por esta razão, estes tipos de estudos muitas vezes escolheram primers e marcadores que alvejar seletivamente subconjuntos específicos da microbiome. Avaliando a composição das comunidades bacterianas é comumente realizado por sequenciamento de uma ou mais das regiões hipervariáveis do bacteriana 16S rRNA gene2,3. Neste estudo, descrevemos um amplicon baseado sequenciamento protocolo desenvolvido para uma plataforma NGS região alvos a 500 bp V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA, que permite ampla amplificação de táxons bacterianas, proporcionando também variabilidade suficiente para distingui entre diferentes táxons. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para o uso com outros conjuntos de cartilha, tais como os alvos o marcador ITS2 de fungos ou a subunidade de rRNA 18S de eucariotas.
Enquanto outras abordagens tais como espingarda metagenômica, metatranscriptomics e sequenciamento de célula única, oferecem outras vantagens, incluindo genomas microbianas resolvidas e medida mais direta da função da Comunidade, estas técnicas são normalmente mais caro e computacionais do que os perfis filogenética descrevem aqui4. Além disso, realizando metagenomics espingarda e metatranscriptomics em amostras de raiz produz uma grande percentagem de leituras pertencentes ao genoma vegetal hospedeiro, e métodos para superar esta limitação ainda estão sendo desenvolvidos5,6.
Tal como acontece com qualquer plataforma experimental, criação de perfil baseada em amplicon pode introduzir um número de possíveis enviesamentos que devem ser considerados durante a análise de dados e projeto experimental. Estes incluem os métodos de coleta de amostra, DNA extração, seleção de primers PCR e como é realizada a preparação da biblioteca. Diferentes métodos podem significativamente afetar a quantidade de dados utilizáveis gerados e podem também prejudicar os esforços para comparar os resultados entre os estudos. Por exemplo, o método de remoção de bactérias rizosfera7 e a utilização de técnicas diferentes de extração ou escolha de extração de DNA a kits8,9 foram mostrados para impacto a jusante análise, que leva a conclusões diferentes sobre os quais os micróbios são presente e suas abundâncias relativas. Desde a criação de perfil baseada em amplicon pode ser personalizada, fazer comparações entre estudos pode ser um desafio. O projeto de Microbiome terra sugeriu que pesquisadores estudando sistemas complexos tais como a planta associada microbiome beneficiaria o desenvolvimento de protocolos padronizados como um meio de minimizar a variabilidade causada pela aplicação de diferentes métodos entre estudos10,11. Aqui, discutimos muitos dos tópicos acima e oferecer sugestões sobre as melhores práticas onde apropriado.
O protocolo demonstra o processo de coleta de solo rizosfera e amostras de raiz de Sorghum bicolor e extrair DNA usando uma bem-estabelecida kit isolamento de DNA11. Além disso, o nosso protocolo inclui um fluxo de trabalho sequenciamento detalhado amplicon, usando uma plataforma NGS comumente utilizada, para determinar a estrutura das comunidades bacterianas12,13,14. Este protocolo foi validado para o uso em uma ampla gama de hospedeiros de planta em um recente estudo publicado das raízes e rizosfera associado-solos de 18 espécies de plantas, incluindo Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum15. Este método também foi validado para uso com outros genes marcadores, como demonstrado pela sua aplicação bem sucedida para estudar o gene marcador ITS2 fúngico em estudos do agave microbiome16,17 e microbiome morango 18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-10/20 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-3810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000027</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 100 &#181;L, and 1000 &#181;L micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000909</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000043</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1122-1830</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm soil sieve</td>
			<td>Forestry Suppliers</td>
			<td>60141009</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reservoirs</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filters (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9933872</td>
			<td>Instructions for use: 
			https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&#38;documentName=B37419AA.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Boardwalk</td>
			<td>7124</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale with 0.001 g resolution</td>
			<td>Ohaus Pioneer</td>
			<td>PA323</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus ultrasonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000908</td>
			<td>Including 50mL and 96-well plate bucket adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic gloves</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerClean kit (optional)</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12877-50</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerSoil kit</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12888-100</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Do not substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon size freezer bags</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini EM Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EM</td>
			<td>Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>Workrite</td>
			<td>J1367</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2 dewar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4150-9000</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water purification system</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SYNS0R0WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4387937</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortars</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-150</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19167032B</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BWK6212</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate sealing film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9684493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-166</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatulas</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNAs - chloroplast and mitochondrial</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure to verify sequence bioinformatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z759015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mallet (optional)</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2258622</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shears or scissors</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89259-936</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shovel</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>2597400</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil core collector (small diameter: &#60;1 inch)</td>
			<td>Ben Meadows</td>
			<td>221700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray bottles</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-395278</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard desalted barcoded primers (10 &#181;M) (Table 1)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E950040015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>B6001W</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere

A relação íntima entre a planta hospedeira e microorganismos associados é crucial para determinar a adequação de planta e pode promover maior tolerância a estresses abióticos e doenças. Como a planta microbiome pode ser altamente complexos e de baixo custo, métodos de alta produtividade como baseados em amplicon sequenciamento do gene 16S rRNA frequentemente são preferidos para caracterizar sua composição microbiana e diversidade. No entanto, a seleção de metodologia apropriada na condução de tais experiências é fundamental para reduzir preconceitos, o que podem dificultar a análise e comparações entre estudos e amostras. Este protocolo descreve detalhadamente uma metodologia padronizada para a coleta e a extração de DNA de rizosfera, solo e amostras de raiz. Além disso, podemos destacar um pipeline de sequenciamento de amplicons do rRNA 16S bem estabelecida que permite a exploração da composição das comunidades bacterianas nestas amostras e pode ser facilmente adaptados para outros genes marcadores. Esse pipeline foi validado para uma variedade de espécies de plantas, incluindo o sorgo, milho, trigo, morango e agave e pode ajudar a superar os problemas associados com a contaminação de organelas vegetais.

Executar o protocolo recomendado deve resultar em um conjunto de dados de leituras de emparelhado-final indexados que podem ser combinados para cada amostra e atribuído a qualquer um bacteriano unidades taxonômicas operacionais (OTU) ou sequência exata variante (ESV, também conhecido como amplicon variante de sequência (ASV) e sub-operational unidade taxonômica (sOTU)), dependendo de análise a jusante. A fim de obter dados de sequência de alta qualidade, deve ter-se cuidado em cad...

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Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

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