Name: exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Эта работа финансировалась USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS поддерживается программой стипендий аспирантов исследований NSF.

1. сбор и разделения корень Endosphere, ризосфере и образцы почвы
<ol><li>Перед входом на местах, автоклав ультрачистая вода (по крайней мере 90 мл воды на сэмпл) для стерилизации. Подготовьте эпифиты удаления буфера (по крайней мере 25 мл на сэмпл) путем добавления 6.75 g KH2PO4, 8.75 г K2HPO...

Этот протокол показывает установленные трубопровода для изучения корня endosphere, ризосфере и почвы микробных композиции, от выборки поля Образец обработки и ниже по течению последовательности. Изучение связанных корня microbiomes представляет уникальные проблемы, из-за частично трудности, п?...

Завод связанные microbiomes состоят из динамичных и сложных микробных сообществ, состоит из бактерий, археи, вирусов, грибков и других эукариотических микроорганизмов. Помимо их хорошо изучена роль в возникновении болезни растений связанных растений микробы могут также положительно повлиять здоровья растений, повышение толерантности к биотическим и абиотическим стрессовым наличия питательных веществ и поощрения повышения роста растений через производство фитогормонов. По этой причине в характеристике таксонов, которые ассоциируются с завода корень endospheres, rhizospheres и окружающий грунт существует особый интерес. Хотя некоторые микробы могут быть культивировали в изоляции на лабораторных созданный СМИ, многие нельзя отчасти потому, что они могут полагаться на симбиотические отношения с другими микробами, растут очень медленно, или требуют условий, которые не могут быть реплицированы в лабораторной среде. Потому что он обходит необходимость культивирования и относительно недорогой и высокой пропускной способности, филогенетическое профилирование на основе последовательности экологических и связанных с ними принимающей микробиологических образцов стала предпочтительным методом для assaying микробных композиция.
Выбор соответствующей последовательности технологий, предоставляемые различными следующего поколения виртуализации платформ (НГС)1 зависит от потребностей пользователей, с важными факторами, в том числе: желаемого охвата, длина ампликонами, ожидается сообщества разнообразия, а также виртуализации-погрешность, чтение Длина и стоимости за запуск/megabase. Какие Джин будет усилен и какие праймеры будет использоваться другой переменной, которая должна рассматриваться в экспериментах на базе ампликон последовательности. При создании или выборе грунты, исследователи часто вынуждены компромисс между универсальностью амплификации и таксономические резолюции достижимые из результирующей ампликонами. По этой причине эти виды исследований часто выбрал грунты и маркеры, которые выборочно целевых конкретных подмножеств микрофлора. Оценке состава бактериальных сообществ обычно осуществляется путем sequencing один или более из гипервариабельных регионов бактериальных 16S рРНК ген2,3. В этом исследовании, мы описываем ампликон на основе последовательности протокол, разработанный для платформы NGS этого региона цели 500 bp V3 V4 бактериальных 16S рРНК ген, который позволяет для широкого амплификации обеспечивая при этом достаточно изменчивости для бактериальных таксонов различие между различными таксонов. Кроме того этот протокол может быть легко адаптирована для использования с другими наборами грунт, например маркер ITS2 грибов или 18S рРНК Субблок эукариот.
В то время как другие подходы, такие, как ружье метагеномики, metatranscriptomics и одноклеточного последовательности, предлагают другие преимущества, включая решена микробных геномов и более прямого измерения функции сообщества, эти методы обычно более дорого и вычислительных ресурсов, чем филогенетических профилирования описано здесь4. Кроме того выполняя метагеномики ружье и metatranscriptomics на образцах корень дает большой процент читает, принадлежащих к принимающей генома растений, и методы, чтобы преодолеть это ограничение, по-прежнему подвергаются развитых5,6.
Как и в случае с любой экспериментальной платформы, профилирование на основе ампликон можно ввести ряд потенциальных отклонений, которые должны быть рассмотрены в ходе экспериментального проектирования и анализа данных. К ним относятся методы сбора проб, ДНК добычи, отбора праймеры PCR, и как проводится подготовка библиотеки. Различные методы может существенно снизить количество используемых данных и может также затруднить усилия чтобы сравнить результаты исследований. Например метод удаления ризосферной бактерии7 и использование методов различных извлечения или выбор ДНК извлечения комплекты8,9 было показано значительное воздействие течению анализа, что приводит к различные выводы относительно которых микробы формируют настоящее и их относительного обилия. Поскольку можно настроить профилирование на основе ампликонами, делая сравнения различных исследований может быть сложным. Проект микрофлора земли предположил, что исследователи, изучение сложных систем, таких как завод связанные микрофлора выиграют от разработки стандартизированных протоколов как средства минимизации изменчивости, вызванных применением различные методы между исследования10,11. Здесь мы обсуждаем многие из вышеуказанных тем, и предложение предложения относительно наилучшей практики, где это уместно.
Протокол демонстрирует процесс сбора почвы, ризосфере и корень образцов из Сорго зерновое и извлечения ДНК, используя налаженные ДНК изоляции комплект11. Кроме того наш протокол включает в себя подробный ампликон последовательности рабочего процесса с использованием обычно используемых NGS платформы, для определения структуры бактериальных сообществ12,,1314. Этот протокол был утвержден для использования в широком диапазоне растений хостов в недавно опубликованном исследовании корней, ризосфере и связанных почвах 18 видов растения, включая15 гаолян, Zea mays и Triticum aestivum. Этот метод также были проверены для использования с другими маркерных генов, как свидетельствует его успешное применение к изучению грибковых ITS2 маркер гена в изучении агавы микрофлора16,17 и клубники микрофлора 18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-10/20 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-3810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000027</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 100 &#181;L, and 1000 &#181;L micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000909</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000043</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1122-1830</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm soil sieve</td>
			<td>Forestry Suppliers</td>
			<td>60141009</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reservoirs</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filters (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9933872</td>
			<td>Instructions for use: 
			https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&#38;documentName=B37419AA.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Boardwalk</td>
			<td>7124</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale with 0.001 g resolution</td>
			<td>Ohaus Pioneer</td>
			<td>PA323</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus ultrasonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000908</td>
			<td>Including 50mL and 96-well plate bucket adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic gloves</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerClean kit (optional)</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12877-50</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerSoil kit</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12888-100</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Do not substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon size freezer bags</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini EM Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EM</td>
			<td>Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>Workrite</td>
			<td>J1367</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2 dewar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4150-9000</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water purification system</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SYNS0R0WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4387937</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortars</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-150</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19167032B</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BWK6212</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate sealing film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9684493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-166</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatulas</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNAs - chloroplast and mitochondrial</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure to verify sequence bioinformatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z759015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mallet (optional)</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2258622</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shears or scissors</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89259-936</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shovel</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>2597400</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil core collector (small diameter: &#60;1 inch)</td>
			<td>Ben Meadows</td>
			<td>221700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray bottles</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-395278</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard desalted barcoded primers (10 &#181;M) (Table 1)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E950040015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>B6001W</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere

Интимные взаимодействие между растение хост и связанные микроорганизмов имеет решающее значение в определении фитнес завод и может способствовать повышение толерантности к абиотическим стрессам и болезням. Как завод микрофлора может быть весьма сложным, лоу кост, высок объём методы, такие как на основе ампликон секвенирование гена 16S рРНК часто являются предпочтительными для характеризующие его микробный состав и разнообразия. Однако выбор соответствующей методологии при проведении таких экспериментов имеет решающее значение для снижения отклонений, которые может затруднить анализ и сравнение образцов и исследования. Этот протокол описывает подробно стандартизированной методологии для сбора и извлечения ДНК из почвы, ризосфере и корень. Кроме того мы выделите устоявшихся 16S рРНК ампликон последовательности конвейера, который позволяет для изучения состава бактериальной общин в этих образцах и может быть легко адаптирована для других маркерных генов. Этот трубопровод был одобрен для различных видов растений, в том числе сорго, кукурузы, пшеницы, клубника и агавы и может помочь преодолеть проблемы, связанные с загрязнением от завода органеллы.

Выполнение рекомендуемых протокола должно привести к набор индексированных паре конец чтений, которые могут быть сопоставлены обратно каждый образец и назначен либо бактериальной оперативной таксономических единиц (ОТУ) или точную последовательность вариант (ESV, та...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Здесь мы описываем протокол для получения данных последовательности ампликон почвы, ризосфере и корня endosphere microbiomes. Эта информация может использоваться для изучения состава и разнообразие растений связанные микробных сообществ и подходит для использования с широким спектром видов растений.

Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Ecology

Biodiversity and Conservation

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Транскриптомный Анализ<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; Элеганс</em&gt; РНК Секвенирование данных через Tuxedo люкс по проекту Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Информатики анализ последовательности данных из пакетного дрожжи 2-гибрид экраны

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform

Изучение воздействия космических полетов по физиологии мыши, с помощью платформы GeneLab НАСА открытого доступа

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Томатный корень Преобразование После прививки с Ralstonia Solanacearum для straightforward генетического анализа бактериальной болезни Wilt

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...