Name: exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Detta arbete finansierades av USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS stöds av NSF Graduate Research Fellowship-programmet.

1. insamling och Separation av roten Endosphere, odlingsbädden och jordprover
<ol><li>Innan fältet, autoklav ultrarent vatten (minst 90 mL vatten per prov) för att sterilisera. Förbereda epifyt borttagning buffert (minst 25 mL per prov) genom att lägga till 6,75 g KH2PO4, 8.75 g K2HPO4och 1 mL av Triton x-100, 1 L sterilt vatten. Sterilisera bufferten med ett vakuum filter med 0,2 µm porstorlek.<ol>
<li>För steg 1,2 till 1,5, Använd rena handskar steriliseras med etan...

Detta protokoll visar en etablerad rörledning för att utforska rot endosphere, odlingsbädden och jord mikrobiell gemenskapen kompositioner, från fältprovtagning prov bearbetning och efterföljande sekvensering. Studerar rot-associerad microbiomes presenterar unika utmaningar, vederbörlig delvis inneboende svårigheterna att provtagning från marken. Jordar är mycket variabel i form av fysiska och kemiska egenskaper och olika markförhållanden kan separeras från så lite som några millimeter28<...

Växt-associerad microbiomes består av dynamiska och komplexa mikrobiella samhällen består av bakterier, arkéer, virus, svampar och andra eukaryota mikroorganismer. Utöver deras väl studerat roll i orsakar växtsjukdomar, kan växt-associerade mikrober också positivt påverka växtskydd genom att förbättra tolerans mot biotiska och abiotiska påfrestningar, främja näringsämnen tillgänglighet och förbättra växternas tillväxt genom produktionen av fytohormoner. Av denna anledning finns särskilt intresse i karaktärisera de taxa som förknippar med växt rot endospheres, rhizospheres och den omgivande marken. Medan vissa mikrober kan vara odlade i isolering på laboratoriet genererade media, många inte, delvis eftersom de kan lita på symbiotiska relationer med andra mikrober, växer mycket långsamt, eller kräva villkor som inte kan replikeras i en labbmiljö. Eftersom det kringgår behovet av odling och är relativt billig och hög genomströmning, har sekvens-baserade fylogenetiska profilering av miljö- och host-associerade mikrobiell prover blivit en rekommenderad metod för testmetoder mikrobiell gemenskapen sammansättning.
Valet av lämpliga sekvensering teknik som tillhandahålls av olika nästa generation sequencing (NGS) plattformar1 är beroende av användarnas behov, med viktiga faktorer inklusive: önskad täckning, amplikon längd, förväntat gemenskapen mångfald, samt sekvensering felprocenten, Läs-längd och den kostnad-per-kör/megabase. En annan variabel som måste beaktas i amplikon-baserade sekvensering experiment är vilken gen kommer att förstärkas och vilken grundfärg ska användas. När du designar eller välja primers, tvingas forskare ofta göra kompromisser mellan amplifiering universalitet och taxonomisk upplösning kan uppnås från den resulterande amplikoner. Av denna anledning valde dessa typer av studier ofta primers och markörer för att selektivt riktar specifika delmängder av mikrobiomet. Utvärdera sammansättningen av bakteriella samhällen sker vanligen genom sekvensering en eller flera av de bakteriella 16S rRNA gen2,3hypervariabel regioner. I denna studie, beskriver vi en amplikon baserat sekvensering protokoll som utvecklats för en NGS plattform mål 500 bp V3-V4 regionen av bakteriell 16S rRNA genen, vilket möjliggör bred förstärkning av bakteriell taxa samtidigt ge tillräcklig variation till skilja mellan olika taxa. Detta protokoll kan dessutom enkelt anpassas för användning med andra primer uppsättningar, som riktar sig till den ITS2 markören av svampar eller den 18S rRNA subuniten av eukaryotes.
Medan andra metoder såsom hagelgevär metagenomik, metatranscriptomics och encelliga sekvensering, erbjuder andra fördelar inklusive löst mikrobiell genomen och mer direkt mätning av gemenskapens funktion, är dessa tekniker vanligtvis mer dyrt och arbetsintensivt än fylogenetiska profilering beskrivs här4. Dessutom utför hagelgevär metagenomik och metatranscriptomics på roten prover ger en stor andel av läsningar som hör till den mottagande anläggning arvsmassan, och metoder för att övervinna denna begränsning fortfarande är utvecklade5,6.
Som med alla experimentell plattform, kan amplikon-baserade profilering införa ett antal potentiella fördomar som bör övervägas under den experimentella design och dataanalys. Dessa inkluderar metoder för provtagning, DNA extraktion, urval av PCR primers och hur biblioteket beredning utförs. Olika metoder kan avsevärt påverka mängden användbara data som genereras, och kan också hindra ansträngningarna att jämföra resultat mellan studierna. Till exempel metoden för att avlägsna odlingsbädden bakterier7 och användningen av olika utvinning tekniker eller val av DNA extraktion kit8,9 har visat sig signifikant inverkan nedströms analys, vilket leder till olika slutsatser om vilka mikrober är närvarande och deras relativa förekomsten. Eftersom amplikon-baserade profilering kan anpassas, kan det vara svårt att göra jämförelser mellan studierna. Jorden mikrobiomet projektet har föreslagit att forskare studerar komplexa system som den växt-associerade mikrobiomet skulle gynnas utvecklingen av standardiserade protokoll som ett medel för att minimera variabiliteten orsakas av tillämpningen av olika metoder mellan studier10,11. Här diskuterar vi många av de ovanstående ämnena och ge förslag om bästa praxis där så är lämpligt.
Protokollet visar processen för samlande jord, odlingsbädden och rot prover från Sorghum bicolor och utvinna DNA med en väletablerad DNA isolering kit11. Våra protokoll innehåller dessutom en detaljerad amplikon sekvensering arbetsflöde, med en ofta utnyttjad NGS platform, för att bestämma strukturen av bakteriesamhällen12,13,14. Detta protokoll har validerats för användning i ett brett utbud av växten varar värd i en nyligen publicerad studie av rötter, odlingsbädden och associerade-smutsar av 18 enhjärtbladiga arter inklusive Sorghum bicolor, Zea mays, och Triticum aestivum15. Denna metod har också validerats för användning med andra markörgener, vilket framgår av dess framgångsrika för att studera genen svamp ITS2 markör i studier av agave mikrobiomet16,17 och strawberry mikrobiomet 18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-10/20 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-3810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000027</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 100 &#181;L, and 1000 &#181;L micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000909</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000043</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1122-1830</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm soil sieve</td>
			<td>Forestry Suppliers</td>
			<td>60141009</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered micropipette tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reservoirs</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filters (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9933872</td>
			<td>Instructions for use: 
			https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&#38;documentName=B37419AA.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Boardwalk</td>
			<td>7124</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale with 0.001 g resolution</td>
			<td>Ohaus Pioneer</td>
			<td>PA323</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus ultrasonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000908</td>
			<td>Including 50mL and 96-well plate bucket adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic gloves</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerClean kit (optional)</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12877-50</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerSoil kit</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>12888-100</td>
			<td>Previously MoBio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Do not substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon size freezer bags</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini EM Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EM</td>
			<td>Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>Workrite</td>
			<td>J1367</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid N2 dewar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4150-9000</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water purification system</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SYNS0R0WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4387937</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortars</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-150</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19167032B</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BWK6212</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate sealing film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9684493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89038-166</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatulas</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNAs - chloroplast and mitochondrial</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure to verify sequence bioinformatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z759015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mallet (optional)</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2258622</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shears or scissors</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>89259-936</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shovel</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>2597400</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil core collector (small diameter: &#60;1 inch)</td>
			<td>Ben Meadows</td>
			<td>221700</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray bottles</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-395278</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard desalted barcoded primers (10 &#181;M) (Table 1)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E950040015</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>B6001W</td>
			<td>Can substitute with equivalent from other suppliers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the root microbiome: extracting bacterial community data from the soil, rhizosphere, and root endosphere

Intima samspelet mellan anläggning värd och associerade mikroorganismer är avgörande för att fastställa växt fitness, och kan främja förbättrad tolerans mot abiotisk stress och sjukdomar. Den växten mikrobiomet kan vara mycket komplexa, låg kostnad, är hög genomströmning metoder såsom amplikon-baserade sekvensering av 16S rRNA-genen ofta föredra för att karakterisera dess mikrobiell komposition och mångfald. Valet av lämplig metodik när genomföra sådana experiment är dock avgörande för att minska fördomar som kan försvåra analys och jämförelser mellan prover och undersökningar. Det här protokollet beskriver i detalj en standardiserad metod för insamling och extraktion av DNA från jord, odlingsbädden och rot prover. Dessutom, vi lyfter fram en väletablerad 16S rRNA amplikon sekvensering pipeline som möjliggör utforskandet av sammansättningen av bakteriella samhällen i dessa prover, och kan enkelt anpassas för andra markörgener. Denna pipeline har validerats för en mängd växtarter, inklusive sorghum, majs, vete, jordgubb och agave, och kan bidra till att lösa frågor i samband med föroreningen från växten organeller.

Utföra det rekommenderade protokollet bör resultera i en datamängd av indexerade Parade-end läser som kan matchas till varje prov och tilldelats antingen en bakteriell operativa taxonomiska enheter (OTU) eller exakta sekvens variant (ESV, även kallad amplikon sekvens variant (ASV) och sub-operational taxonomiska enheten (sOTU)), beroende på efterföljande analys. För att få hög kvalitet sekvensdata, måste försiktighet iakttas vid varje steg att behålla överensstämmelsen mell...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere at JoVE.com

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla amplikon sekvensdata av jord, odlingsbädden och rot endosphere microbiomes. Denna information kan användas för att undersöka den sammansättning och mångfalden av växt-associerade mikrobiella samhällen, och är lämplig för användning med ett brett utbud av växtarter.

Utforska den roten mikrobiomet: extrahera bakteriell gemenskapen Data från jord, odlingsbädden och rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Ecology

Biodiversity and Conservation

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analys av<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing data via Tuxedo Suite på Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tvåriktad retroviral integrationsplats PCR-metodik och kvantitativ dataanalys arbetsflöde

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestämning av optimala kromosomala belägenheten för ett DNA-Element i Escherichia coli använder en ny metod för Transposon-medierad

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Provberedning och analys av RNASeq-baserade gen uttryck Data från zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Datoriserad analys av sekvensdata från Batch jäst 2-Hybrid skärmar

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform

Utforska den effekter av rymdfarkosten på mus fysiologi med hjälp av Open Access NASA GeneLab plattformen

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolera, sekvensering och analysera extracellulära mikroRNA från humana mesenkymala stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomat rotomvandling följt av inokulering med Ralstonia Solanacearum för enkel genetisk analys av bakteriell vissna sjukdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...