Name: measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes at JoVE.com

Nous tenons à remercier Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino et Neej Patel pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par l’award de l’United States Public Health Service R15DK102122 de l’Institut National du diabète et l’appareil digestif et la Kidney Diseases (NIDDK) à Jonathan Fisher. Le contenu du manuscrit est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NIDDK ou le National Institutes of Health.

Remarque : Voir la Figure 1 pour un aperçu schématique des étapes clés.
1. WST-1 réduction dosage
<ol><li>Croître et se différencier C2C12 cellules adhérentes à l’aide de procédures standard cell culture7 dans une plaque à 96 puits utilisant des lignes A-F.<ol>
<li>Utiliser un moyen de différenciation composé de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 2 % de sérum de cheval, 100 U/mL de péni...

<ol>
	<li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell.">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li><li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li><li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+trans-plasma+membrane+electron+transport+system+in+plact+cells.">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li><li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells.">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li><li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma-membrane+redox+systems+in+growth+and+development.">Transplasma-membrane redox systems in growth and development.</a> Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport:+a+cellular+assay+for+NADH-+and+NADPH-oxidase+based+on+extracellular,+superoxide-mediated+reduction+of+the+sulfonated+tetrazolium+salt+WST-1.">Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1.</a> Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).</li><li>Eccardt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle.">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).</li><li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane.">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li><li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells.">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li><li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport.">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li><li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ehrlich+cell+plasma+membrane+redox+system+is+modulated+through+signal+transduction+pathways+involving+cGMP+and+Ca2++as+second+messengers.">Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).</li><li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+plasma+membrane+redox+systems.">Multifunctional plasma membrane redox systems.</a> Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).</li><li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells.">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li><li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho(0)HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane.">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).</li><li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes.">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li><li>Herst, P. M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+oxygen+consumption:+a+major+contributor+to+cellular+oxygen+consumption+in+glycolytic+cancer+cell+lines.">Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).</li><li>Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation.">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li><li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome.">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li><li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+in+mammals:+functional+significance+in+health+and+disease.">Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Capacity+Redox+Control+at+the+Plasma+Membrane+of+Mammalian+Cells+Trans-Membrane,+Cell+Surface,+and+Serum+NADH-Oxidases.">High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).</li><li>Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Sulfonated+Tetrazolium+Salt+That+Produces+a+Highly+Water-Soluble+Formazan+Dye.">A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+New+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Gurtoo, H. L., Johns, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2,6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase.">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li><li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells.">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2013).</li><li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+(WST-1).">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li><li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway.">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li><li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+(phenazine+methosulfate)+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level.">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li><li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase.">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li><li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol.">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+and+cellular+basis+of+cell+proliferation+assays+that+use+tetrazolium+salts.">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li><li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt,+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan:+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents.">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li><li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+(PI3K)+signaling+pathway.">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li><li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+(B-CPAP)+cells.">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li><li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase.">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li><li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen.">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li><li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases.">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li></ol>

Nous avons présenté deux méthodes d’utilisation d’accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP, dans des dosages spectrophotométriques pour surveiller les tPMET dans les myotubes C2C12. Avec la croissance de lignées cellulaires dans les méthodes de culture standard et d’un lecteur de spectrophotomètre, il est possible de surveiller tPMET avec ces accepteurs d’électrons dans un essai simple microplaque. WST-1 réduction est reproductible de puits à puits dans un essai, mais il existe une varia...

La capacité des membranes de plasma épurés de réduire les accepteurs d’électrons a conduit à l’idée que la membrane plasmique a une capacité inhérente redox1. Vu précédemment dans les champignons, les plantes et animaux, tPMET est un processus commun à plusieurs organismes2,3,4,5. Plus précisément, ce processus a été démontré chez Saccharomyces cerevisiae, cellules de carotte, érythrocytes, lymphocytes, ostéosarcome, mélanome, macrophages, le muscle squelettique et neutrophiles2,3, 4 , 5 , 6 , 7. dans un processus qui transporte les électrons à travers la membrane de plasma pour réduire les oxydants extracellulaires, tPMET est impliqué dans nombreuses fonctions cellulaires, y compris : cellule croissance5,8, de la viabilité cellulaire9, fer métabolisme des10,11,12,13et protection contre l’oxygène réactif espèces12,14,15de signalisation cellulaire. En raison de l’implication de tPMET dans de nombreuses fonctions cellulaires, un déséquilibre de tPMET a émis l’hypothèse pour contribuer au développement de certains troubles de santé graves, y compris le cancer16,17de maladies cardiovasculaires, métaboliques et le syndrome18.
Il y a plusieurs façons de contrôler le transfert des électrons à travers la membrane de plasma, mais la technique la plus largement utilisée est d’évaluer la réduction des accepteurs d’électrons extracellulaire par dosages colorimétriques. Accepteurs d’électrons extracellulaire couramment utilisés sont les sels de tétrazolium, DPIP, FeCN et ferricytochrome c19,20. Le sel de tetrazolium plus couramment utilisé est un deuxième génération connu sel comme WST-119. Ce composé est plus facile à utiliser dans les essais colorimétriques par rapport aux sels de tétrazolium de première génération en raison de deux groupes de sulfonate de perfluorooctane, qui augmentent sa solubilité de l’eau21. WST-1, en liaison avec l’intermédiaire électron accepteur 1-méthoxy-phénazine méthosulfate (mPMS), est réduite dans les événements de transfert d’électron deux. Cette réduction change la forme oxydée de faiblement couleur du WST-1 à une plus intense, jaune de formazan20,22. WST-1 a un coefficient d’extinction molaire élevée de 37 x 103 M-1cm-1, conduisant à un dosage haute sensibilité21,22. DPIP est également utilisé comme un accepteur d’électrons extracellulaire pour surveiller tPMET. Il a été démontré que DPIP peut être réduit extracellulaire par tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs23,24. En raison de l’absence d’accepteurs d’électrons intermédiaire, DPIP peut directement électrons pick-up de la membrane plasmique, contrairement à WST-124. Semblable à DPIP, FeCN s’est avéré extracellulaire réduit à ferrocyanure de tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs19,24. Contrairement à WST-1 et DPIP, FeCN a un coefficient d’extinction molaire bas menant à un plus faible dosage sensibilité9. Un autre accepteur d’électron d’extracellulaire couramment utilisés pour surveiller les tPMET est ferricytochrome c. semblable à WST-1, ferricytochrome c réduction augmente avec l’utilisation d’accepteur d’électrons intermédiaire, mPMS22. Contrairement à WST-1, la méthode de ferricytochrome c est moins sensible en raison d’un haut fond et une extinction molaire faible coefficient22.
Nous présentons ici une méthode d’analyse en temps réel de tPMET par le biais de dosages par spectrophotométrie. La méthode utilisée les accepteurs d’électrons extracellulaire WST-1 et DPIP, car ils ont un coefficient d’extinction molaire élevée tout en étant moins cher par rapport à l’autre couramment utilisé accepteurs d’électrons extracellulaire comme ferricytochrome c. Nous avons utilisé la phénazine méthosulfate (PMS) au lieu de MPM, ils ont une composition chimique similaire et PMS est beaucoup moins cher. mPMS photochimiquement stable qui est une caractéristique importante pour une trousse commerciale qui a besoin d’une longue durée de vie. Toutefois, nous faisons PMS frais pour chaque dosage, donc stabilité ne devrait pas être un problème. Nous présentons aussi une méthode pour évaluer les possibles interactions enzymatiques (voir Figure 1) entre l’accepteur d’électron extracellulaire et des enzymes qui peuvent être utilisés afin de caractériser le processus de tPMET. Plus précisément, les enzymes AO et SOD peuvent servir déterminent quelle partie du tPMET est due à transport ascorbate ou communiqué de superoxyde extracellulaire, deux méthodes courantes pour les électrons d’être transporté à travers la membrane plasmique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C2C12 myoblasts</td>
			<td>American Type Culture Collection&#160;</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle&#39;s medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Plex animal serum complex</td>
			<td>Gemini Bio-Products&#160;</td>
			<td>100-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>516106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Gibco Technologies</td>
			<td>16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm culture dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)</td>
			<td>Accela ChemBio&#160; Inc</td>
			<td>SY016315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenazine methosulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate oxidase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol sodium salt&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>215011825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerwave X-I spectrophotometer</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>336001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>220299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xanthine oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Studio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC4</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes

TRANS-plasma membrane transport d’électrons (tPMET) joue un rôle dans la protection des cellules du stress réductrice intracellulaire ainsi que la protection contre les dommages causés par les oxydants extracellulaires. Ce processus de transport des électrons de réducteurs intracellulaires extracellulaire oxydants n’est pas bien défini. Nous présentons des analyses spectrophotométriques de myotubes C2C12 pour surveiller tPMET utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire : tétrazolium soluble dans l’eau sel-1 WST-1 et 2, 6-dichlorophénolindophénol (DPIP ou DCIP). Grâce à la réduction de ces accepteurs d’électrons, nous sommes en mesure de contrôler ce processus dans une analyse en temps réel. Avec l’ajout d’enzymes telles que l’ascorbate oxydase (AO) et de la superoxyde dismutase (SOD) pour les essais, nous pouvons déterminer quelle partie du tPMET est due à la production de superoxyde ou de l’exportation d’ascorbate, respectivement. WST-1 a montré des résultats stables avec faible bruit de fond, DPIP a pu être ré-oxydé après l’ajout des AO et des mottes de terre, qui a été démontrée avec l’analyse spectrophotométrique. Cette méthode montre un dosage spectrophotométrique multipuit, rapide, en temps réel avec les avantages par rapport aux autres méthodes utilisées pour surveiller les tPMET, tels que ferricyanure (FeCN) et ferricytochrome c réduction.

Statistiques ont été réalisées avec ANOVA à mesures répétées à l’aide de logiciels statistiques RStudio25. Tailles d’échantillon sont indiqués dans les légendes de la figure.
Pour surveiller les tPMET, les myotubes C2C12 étaient utilisés parallèlement accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP. AO a été utilisée pour déterminer quelle partie du WST-1 réduction DPIP r?...

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Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-Plasma Membrane Transport des électrons par les Myotubes C2C12 de mesure

Ce protocole vise à surveiller par spectrophotométrie trans-plasma membrane transport d’électrons utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire et d’analyser les interactions enzymatiques qui peuvent survenir avec ces accepteurs d’électrons extracellulaire.

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

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