Name: measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes at JoVE.com

우리는 그들의 기술 지원에 대 한 토마스 벨, 린 Mattathil, 마크 Mannino, 및 Neej 파 텔에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 조나단 피셔 국립 연구소의 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 (NIDDK)에서 미국 공중 보건 봉사 상 R15DK102122에 의해 지원 되었다. 원고 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시는 NIDDK 또는 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

참고:에 대 한 주요 단계 도식 개요 그림 1 을 참조 하십시오.
1. 서 부 표준시-1 감소 분석 결과
<ol><li>성장 하 고 96 잘 접시 행 A-f.를 활용 하 여 표준 셀 문화 절차7 을 사용 하 여 C2C12 부착 세포 분화<ol>
<li>구성 된 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 2% 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스 보충 차별화 매체를 사용 합니다. 5% CO2<...

<ol>
	<li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell.">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li><li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li><li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+trans-plasma+membrane+electron+transport+system+in+plact+cells.">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li><li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells.">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li><li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle.">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).</li><li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane.">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li><li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells.">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li><li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport.">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li><li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ehrlich+cell+plasma+membrane+redox+system+is+modulated+through+signal+transduction+pathways+involving+cGMP+and+Ca2++as+second+messengers.">Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).</li><li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+plasma+membrane+redox+systems.">Multifunctional plasma membrane redox systems.</a> Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).</li><li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells.">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li><li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho(0)HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane.">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).</li><li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes.">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li><li>Herst, P. M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+oxygen+consumption:+a+major+contributor+to+cellular+oxygen+consumption+in+glycolytic+cancer+cell+lines.">Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).</li><li>Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation.">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li><li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome.">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li><li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+in+mammals:+functional+significance+in+health+and+disease.">Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Capacity+Redox+Control+at+the+Plasma+Membrane+of+Mammalian+Cells+Trans-Membrane,+Cell+Surface,+and+Serum+NADH-Oxidases.">High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).</li><li>Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Sulfonated+Tetrazolium+Salt+That+Produces+a+Highly+Water-Soluble+Formazan+Dye.">A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+New+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Gurtoo, H. L., Johns, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2,6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase.">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li><li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells.">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2013).</li><li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+(WST-1).">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li><li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway.">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li><li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+(phenazine+methosulfate)+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level.">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li><li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase.">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li><li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol.">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+and+cellular+basis+of+cell+proliferation+assays+that+use+tetrazolium+salts.">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li><li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt,+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan:+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents.">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li><li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+(PI3K)+signaling+pathway.">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li><li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+(B-CPAP)+cells.">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li><li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase.">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li><li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen.">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li><li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases.">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li></ol>

우리는 세포 외 전자 수락자, DPIP, 및 서 부 표준시-1 tPMET C2C12 myotubes에서 모니터링 하는 spectrophotometric 분석 실험에 활용 하는 두 가지 방법 제시. 표준 문화 절차에 셀 라인의 성장과 플레이트 리더를 분 광 광도 계 분석 결과 간단한 microplate에에서 이러한 전자 수락자와 tPMET 모니터링 가능 하다. 서 부 표준시-1 감소는 잘-투-잘 분석 결과, 내에서 재현할 수 이지만 일상적인 변화. PBS는 버퍼를 활용 ...

전자 수락자를 줄이기 위해 순화 된 플라즈마 막 수 플라즈마 멤브레인 고유의 redox 용량1는 보기를 주도하 고 있다. 이전에 곰 팡이, 식물, 그리고 동물에서 본, tPMET는 여러 생물2,3,,45에 공통 프로세스입니다. 특히,이 과정은 Saccharomyces cerevisiae, 당근 세포, 적혈구, 림프 톨, 다리, 흑색 종, 대 식 세포, 골격 근육, 및 호 중구2,3, 에서 입증 되었습니다. 4 , 5 , 6 , 7. extracellular oxidants를 줄이기 위해 플라즈마 막에 걸쳐 전자를 수송 하는 과정에서 tPMET는 포함 하는 많은 세포 기능에 관여: 세포 성장5,8, 세포 생존 능력9, 철 대사10,11,,1213, 반응성 산소 종12,,1415보호를 신호 하는 세포입니다. 많은 세포질 기능에 tPMET의 개입으로 인해 tPMET의 불균형은 암16,17, 심혈 관 질환 포함 한 몇 가지 심각한 건강 상태의 발전에 기여할 가설 되었습니다 및 대사 증후군18.
원형질 막의 전자 전송을 모니터링 하는 여러 가지 하지만 가장 널리 사용 되는 기술 색도계 분석 실험을 통해 세포 외 전자 수락자의 감소를 평가 하는 것입니다. 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자 tetrazolium 소금, DPIP, FeCN, 그리고 ferricytochrome c19,20있습니다. 가장 일반적으로 사용 되는 tetrazolium 소금은 2 세대 소금 알려진 서 부 표준시-119. 이 화합물은 1 세대 tetrazolium 소금 두 된 그룹,21의 물 가용성 증가 하는 때문에 비해 색도계 분석 실험에 활용 하기가 쉽습니다. 중간 전자 수락자 1-methoxy-phenazine methosulfate (Mpm)와 함께에서 서 부 표준시-1, 2 단 전자 전송 이벤트에서 감소 된다. 이 감소는 더 강렬한, 노란색 formazan20,22에 약하게 색 산화 형태의 서 부 표준시-1을 변경합니다. 서 부 표준시-1 높은 분석 결과 감도21,22로 이어지는 37 x 103 M-1c m-1의 높은 어 금 니 소 광 계수가 있다. DPIP는 또한 tPMET를 모니터링 하는 extracellular 전자 수락자로 이용 된다. 그것은 그 DPIP 감소 될 수 있다 extracellularly 중간 전자 수락자23,24의 도움 없이 tPMET에 의해 표시 되었습니다. 중간 전자 수락자의 부족, DPIP 픽업 전자를 서 부 표준시-124달리 플라즈마 막에서 직접 수 있습니다. DPIP와 마찬가지로 FeCN 줄어들 extracellularly ferrocyanide 중간 전자 수락자19,24의 도움 없이 tPMET에 의해에 표시 되었습니다. 서 부 표준시-1, DPIP와 달리 FeCN 낮은 분석 결과 감도9로 이어지는 낮은 어 금 니 소멸 계수가 있다. TPMET 모니터를 또 다른 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자는 ferricytochrome c. 서 부 표준시-1, ferricytochrome c 감소 증가 중간 전자 수락자, Mpm22의 사용과 비슷합니다. 서 부 표준시-1과는 달리, ferricytochrome c 방법은 높은 배경 및 낮은 분자량 소멸 계수22덜 민감한.
여기 우리 spectrophotometric 분석 실험을 통해 tPMET의 실시간 분석을 위한 방법 제시. 메서드 활용 서 부 표준시-1 및 DPIP, extracellular 전자 수락자로 그들은 둘 다 높은 어 금 니 소멸 계수 되 고 일반적으로 다른에 비해 덜 비싼 사용 ferricytochrome c 등 세포 외 전자 수락자. 우리는 phenazine methosulfate (PMS) 활용 Mpm 대신 그들은 유사한 화학 메이크업 및 PMS 있다 훨씬 덜 비싼. Mpm은 photochemically 안정 긴 수명이 필요로 하는 상용 키트에 대 한 중요 한 특성입니다. 그러나, 우리가 있도록 PMS 신선한 각 분석 결과 대 한 안정성 문제 해서는 안됩니다. 우리는 또한 가능한 효소 사이 상호 작용 ( 그림 1참조) extracellular 전자 수락자와 더 tPMET의 과정을 특성화 하기 위해 활용 될 수 있습니다 효소를 평가 하는 방법을 제시. 특히, 효소 AO와 잔디를 사용할 수 있습니다 어떤의 tPMET 부분은 하는데 전송 또는 extracellular superoxide 릴리스, 원형질 막에 걸쳐 수송 될 전자에 대 한 두 가지 일반적인 방법 결정 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C2C12 myoblasts</td>
			<td>American Type Culture Collection&#160;</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle&#39;s medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Plex animal serum complex</td>
			<td>Gemini Bio-Products&#160;</td>
			<td>100-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>516106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Gibco Technologies</td>
			<td>16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm culture dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)</td>
			<td>Accela ChemBio&#160; Inc</td>
			<td>SY016315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenazine methosulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate oxidase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol sodium salt&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>215011825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerwave X-I spectrophotometer</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>336001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>220299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xanthine oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Studio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC4</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes

Trans 플라스마 막 전자 전송 (tPMET) extracellular oxidants에 의해 세포내 감소 스트레스 로부터 세포의 보호 뿐만 아니라 손상 으로부터 보호 역할을 하고있다. Extracellular oxidants 세포내 reductants에서 전자 수송의이 과정은 잘 정의 된. 여기 우리 C2C12 myotubes tPMET 세포 외 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 여 spectrophotometric 분석 실험을 제시: 수용 성 tetrazolium 소금-1 (서 부 표준시-1)과 2, 6-dichlorophenolindophenol DPIP (DCIP). 이러한 전자 수락자의 감소, 통해 우리는 실시간 분석에이 과정을 모니터 할 수 있습니다. 효소 superoxide dismutase (SOD)는 분석 실험을 하는데 산화 효소 (AO) 등의 추가 함께 우리 tPMET의 부분 각각 하는데 수출 또는 초과 생산 때문입니다 확인할 수 있습니다. 서 부 표준시-1 낮은 배경 가진 안정적인 결과를 표시 했다, 그러나 DPIP AO와 spectrophotometric 분석 시연 했다 잔디의 추가 후 다시 산화 될 수 있었다. 이 메서드는 실시간, 빠른 멀티 잘 spectrophotometric 분석 결과 tPMET, ferricyanide (FeCN) ferricytochrome c 감소 등을 모니터링 하는 데 사용 하는 다른 방법을 통해 장점 보여 줍니다.

통계는 RStudio 통계 소프트웨어25를 사용 하 여 반복된 측정 ANOVA와 수행 했다. 샘플 크기는 그림 범례에 표시 됩니다.
모니터 tPMET, C2C12 myotubes extracellular 전자 수락자, 서 부 표준시-1 및 DPIP 함께 활용 했다. AO는 서 부 표준시-1의 부분을 결정 하는 데 사용 되었다, DPIP 감소 하는데 경과 예정 이었습니다 그리고 ?...

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Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...