Name: measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00
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Gostaríamos de agradecer seu apoio técnico Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de serviço de saúde pública dos Estados Unidos R15DK102122 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças do rim (NIDDK) e digestivo para Jonathan Fisher. O conteúdo do manuscrito é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIDDK ou o National Institutes of Health.

Nota: Consulte a Figura 1 para uma visão esquemática das principais etapas.
1. ensaio de redução WST-1
<ol><li>Crescem e se diferenciam células aderentes C2C12, usando de procedimentos de cultura de célula padrão7 em uma placa de 96 poços utilizando linhas A-F.<ol>
<li>Use um meio de diferenciação consistindo de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 2% de soro de cavalo, 100 U/mL penicilina e estreptomicin...

<ol>
	<li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell.">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li><li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li><li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+trans-plasma+membrane+electron+transport+system+in+plact+cells.">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li><li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells.">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li><li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle.">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).</li><li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane.">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li><li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells.">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li><li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport.">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li><li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. 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A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells.">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li><li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho(0)HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane.">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).</li><li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes.">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li><li>Herst, P. M., Berridge, M. 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T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation.">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li><li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome.">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li><li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2,6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase.">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li><li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells.">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2013).</li><li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+(WST-1).">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li><li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway.">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li><li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+(phenazine+methosulfate)+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level.">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li><li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase.">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li><li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol.">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+and+cellular+basis+of+cell+proliferation+assays+that+use+tetrazolium+salts.">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li><li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt,+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan:+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents.">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li><li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+(PI3K)+signaling+pathway.">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li><li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+(B-CPAP)+cells.">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li><li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase.">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li><li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen.">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li><li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases.">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li></ol>

Apresentamos dois métodos para a utilização de aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP, em ensaios espectrofotométricos para monitorar tPMET em C2C12 myotubes. Com o crescimento de linhagens celulares em procedimentos padrão de cultura e um leitor de placa de espectrofotômetro, é possível monitorar tPMET com estes aceitadores de electrões em um ensaio de microplacas simples. WST-1 redução é reprodutível de para-bem dentro de um ensaio, mas não há variabilidade do dia a dia. O dia-a-coeficiente...

A visão de que a membrana plasmática tem uma capacidade inerente redox1levou a capacidade das membranas de plasma purificadas de reduzir aceitadores de electrões. Visto anteriormente em fungos, plantas e animais, o tPMET é um processo comum a vários organismos2,3,4,5. Especificamente, este processo tem sido demonstrado em Saccharomyces cerevisiae, cenoura células, hemácias, linfócitos, osteossarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético e neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. em um processo que transporta elétrons através da membrana de plasma para reduzir oxidantes extracelulares, tPMET está envolvido em muitas funções celulares, incluindo: célula crescimento5,8, de viabilidade celular9, ferro metabolismo10, sinalização11,12,13e proteção de1514,12,do espécies reactivas de oxigénio celular. Devido ao envolvimento do tPMET em muitas funções celulares, um desequilíbrio de tPMET tem sido hypothesized para contribuir para o desenvolvimento de algumas condições graves de saúde, incluindo câncer16, doença cardiovascular,17e metabólica Síndrome de18.
Existem várias maneiras de monitorar a transferência de electrões através da membrana de plasma, mas a técnica mais utilizada é avaliar a redução de aceitadores de electrões extracelular através de ensaios colorimétricos. Aceitadores de electrões extracelular comumente usados são sais de tetrazólio, DPIP, BECN e ferricytochrome c19,20. O sal de tetrazólio mais comumente usado é um conhecido sal da segunda geração como WST-119. Este composto é mais fácil de utilizar em ensaios colorimétricos comparados com sais de tetrazólio primeira geração devido a dois grupos sulfonato, que aumentam sua solubilidade de água21. WST-1, em conjunto com o methosulfate de 1-metoxi-Fenazina aceitador elétrons intermediários (mPMS), é reduzido em eventos de transferência de elétron dois. Esta redução altera a forma oxidada fraca-colorido do WST-1 para um mais intenso, amarelo formazan20,22. WST-1 possui um coeficiente de extinção molar elevada de 37 x 103 M-1cm-1, levando a um ensaio de alta sensibilidade21,22. DPIP é também utilizado como um aceitador do elétron extracelular para monitorar tPMET. Tem sido demonstrado que DPIP pode ser diminuído extracelularmente tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário23,24. Devido à falta de aceitadores de electrões intermediário, DPIP pode diretamente a pick-up os elétrons da membrana plasmática, ao contrário do WST-124. Semelhante a DPIP, BECN foi mostrado para ser diminuído extracelularmente para ferrocianeto de tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário19,24. Ao contrário do WST-1 e DPIP, BECN tem um coeficiente de extinção molar baixa, levando a uma baixa de sensibilidade de ensaio9. Outra aceitador de electrões extracelular comumente usados para monitorar tPMET é c ferricytochrome semelhante a WST-1, ferricytochrome c redução aumenta com o uso do aceptor de elétrons intermediários, mPMS22. Ao contrário do WST-1, o método de ferricytochrome c é menos sensível devido a um fundo elevado e um coeficiente de extinção molar baixa22.
Aqui nós apresentamos um método de análise em tempo real de tPMET através de ensaios espectrofotométricos. O método utilizado os aceitadores de electrões extracelular WST-1 e DPIP, que tenham um coeficiente de extinção molar alta enquanto ser menos caro em comparação com o outro comumente usado aceitadores de electrões extracelular como ferricytochrome c. Utilizamos o methosulfate Fenazina (PMS) em vez de mPMS têm uma composição química semelhante e PMS é muito menos dispendioso. mPMS fotoquimicamente estável que é uma característica importante para um kit comercial que tem uma vida útil longa. No entanto, fazemos PMS fresco para cada ensaio, por estabilidade não deve ser um problema. Também apresentamos um método para avaliar possíveis interações enzimáticas (ver Figura 1) entre o aceitador de electrões extracelular e enzimas que podem ser utilizadas para caracterizar ainda mais o processo de tPMET. Especificamente, as enzimas AO e SOD podem ser usado determinam qual parte do tPMET é devido ao transporte de ascorbato ou liberação de superóxido extracelular, dois métodos comuns para elétrons ser transportado através da membrana plasmática.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C2C12 myoblasts</td>
			<td>American Type Culture Collection&#160;</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle&#39;s medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Plex animal serum complex</td>
			<td>Gemini Bio-Products&#160;</td>
			<td>100-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>516106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Gibco Technologies</td>
			<td>16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm culture dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)</td>
			<td>Accela ChemBio&#160; Inc</td>
			<td>SY016315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenazine methosulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate oxidase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol sodium salt&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>215011825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerwave X-I spectrophotometer</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>336001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>220299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xanthine oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Studio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC4</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes

Transporte de elétrons da membrana trans-plasma (tPMET) desempenha um papel na proteção das células do stress redutivo intracelular, bem como a proteção contra danos por oxidantes extracelulares. Este processo de transporte de elétrons do redutores intracelulares para o extracelulares oxidantes não é bem definido. Aqui apresentamos os ensaios espectrofotométricos por C2C12 myotubes para monitorar tPMET utilizando os aceitadores de electrões extracelular: sal de tetrazólio solúvel em água-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP ou DCIP). Através da redução destes aceitadores de electrões, somos capazes de monitorar este processo em uma análise em tempo real. Com a adição de enzimas como ascorbato oxidase (AO) e superóxido dismutase (SOD) para os ensaios, podemos determinar qual parte do tPMET é devido à produção de exportação ou superóxido de ascorbato, respectivamente. Enquanto WST-1 foi mostrado para produzir resultados estáveis com baixo fundo, DPIP era capaz de ser re-oxidado após a adição do AO e SOD, que foi demonstrado com análise espectrofotométrica. Este método demonstra um ensaio espectrofotométrico em tempo real, multi bem, rápido, com vantagens sobre outros métodos usados para monitorar tPMET, tais como o ferricianeto (BECN) e redução de c ferricytochrome.

As estatísticas foram realizadas com ANOVA com medidas repetidas utilizando RStudio software estatístico25. Tamanhos de amostra são indicados nas lendas figura.
Para monitorar tPMET, C2C12 myotubes foram utilizados juntamente com aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP. AO foi usado para determinar qual parte do WST-1 e redução de DPIP foi devido ao efluxo de ascorbato e SOD foi usada pa...

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Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Bioquímica

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...