Name: measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino y Neej Patel por su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por concesión de servicio de salud pública de Estados Unidos R15DK102122 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (NIDDK) a Jonathan Fisher. El contenido del manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDDK o los institutos nacionales de salud.

Nota: Vea la figura 1 para una descripción esquemática de los pasos claves.
1. ensayo de reducción de WST-1
<ol><li>Crecer y diferenciar las células adherentes C2C12 utilizando estándar de la célula cultura procedimientos7 en una placa de 96 pozos utilizando filas A-f.<ol>
<li>Utilizar un medio de diferenciación que consta de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 2% de suero de caballo, 100 U/mL de penicilina y...

<ol>
	<li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell.">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li><li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li><li>Craig, T. A., Crane, F. 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A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells.">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li><li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt,+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan:+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents.">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li><li>Phillips, P. 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G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen.">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li><li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases.">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li></ol>

Hemos presentado dos métodos para utilizar aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP, en ensayos espectrofotométricos para controlar tPMET en miotubos C2C12. Con el crecimiento de líneas celulares en los procedimientos de cultivo estándar y un lector espectrofotómetro de placas, es posible monitorizar tPMET con estos aceptadores del electrón en un análisis simple de la microplaca. WST-1 reducción es reproducible de pozo a pozo dentro de un ensayo, pero existe variabilidad día a día. El día a día co...

La capacidad de las membranas de plasma purificadas para reducir aceptadores del electrón ha llevado a la vista que la membrana plasmática tiene una capacidad inherente de redox de1. Visto previamente en hongos, plantas y animales, tPMET es un proceso común a múltiples organismos2,3,4,5. En concreto, este proceso ha sido demostrado en Saccharomyces cerevisiae, zanahoria células, eritrocitos, linfocitos, osteosarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético y neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. en un proceso que transporta electrones a través de la membrana de plasma para reducir oxidantes extracelulares, tPMET participa en muchas funciones celulares incluyendo: célula crecimiento5,8, de la viabilidad de la célula9, hierro metabolismo10,11,12,13y la protección de especies de oxígeno reactivo12,14,15de señalización de la célula. Debido a la implicación de tPMET en muchas funciones celulares, un desequilibrio de tPMET ha presumido para contribuir al desarrollo de algunas condiciones de salud graves, incluyendo cáncer16,17de las enfermedades cardiovasculares, metabólicos y síndrome18.
Hay varias formas para controlar a la transferencia de electrones a través de la membrana del plasma, pero es la técnica más ampliamente utilizada evaluar la reducción de los aceptores de electrones extracelular a través de análisis colorimétricos. Aceptadores del electrón extracelular comúnmente utilizados son las sales de tetrazolio, DPIP, FeCN y ferricytochrome c19,20. La sal de tetrazolio más comúnmente utilizado es una segunda generación sal conocida como WST-119. Este compuesto es más fácil de utilizar en el análisis colorimétricos en comparación a las sales de tetrazolio de primera generación debido a dos grupos sulfonato, que aumentan su solubilidad de agua21. WST-1, junto con el intermedio electrón aceptador 1-metoxi-phenazine methosulfate (mPMS), se reduce en eventos de transferencia de electrones solo dos. Esta reducción cambia la forma oxidada de color débil de WST-1 a un precipitado más intenso, amarillo20,22. WST-1 tiene un coeficiente de extinción molar alta de 37 x 103 M-1cm-1, conduce a un análisis alta sensibilidad21,22. DPIP también es utilizado como un aceptor de electrones extracelular para controlar tPMET. Se ha demostrado que puede reducirse extracellularly DPIP por tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios23,24. Debido a la ausencia de aceptadores del electrón intermedio, DPIP puede directamente electrones Pick-up de la membrana del plasma, a diferencia de WST-124. Similar a la DPIP, FeCN ha visto reducirse extracelularmente a ferrocianuro, tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios19,24. A diferencia de WST-1 y DPIP, FeCN tiene un coeficiente de extinción molar baja conduce a un menor análisis sensibilidad9. Otro aceptor de electrones extracelular utilizados para monitorear tPMET es ferricytochrome c. Similar a WST-1, ferricytochrome c reducción aumenta con el uso del aceptador del electrón intermedio, mPMS22. A diferencia de WST-1 sin embargo, el método c ferricytochrome es menos sensible debido a una alta formación y un coeficiente de extinción molar baja22.
Aquí presentamos un método para el análisis en tiempo real de tPMET a través de análisis espectrofotométricos. El método utilizado los aceptadores del electrón extracelular WST-1 y DPIP, pues ambos tienen un coeficiente de extinción molar alta mientras que siendo menos costosa en comparación con los otros comúnmente utilizados aceptadores del electrón extracelular como c ferricytochrome. Utilizamos phenazine methosulfate (PMS) en lugar de multiprocesamiento tienen una composición química similar y PMS es mucho menos costoso. mPMS es fotoquímicamente estable que es una característica importante de un kit comercial que necesita una larga vida útil. Sin embargo, hacemos PMS fresca para cada ensayo, por lo que la estabilidad no debe ser un problema. También presentamos un método para evaluar posibles interacciones enzimáticas (ver figura 1) entre el aceptador del electrón extracelulares y enzimas que pueden ser utilizadas para caracterizar el proceso de tPMET. En concreto, las enzimas AO y el césped puede ser utilizado determinan la parte de tPMET es debido al transporte de ascorbato o liberación de superóxido extracelular, dos métodos comunes para los electrones que se transportará a través de la membrana plasmática.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C2C12 myoblasts</td>
			<td>American Type Culture Collection&#160;</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle&#39;s medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Plex animal serum complex</td>
			<td>Gemini Bio-Products&#160;</td>
			<td>100-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>516106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Gibco Technologies</td>
			<td>16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm culture dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)</td>
			<td>Accela ChemBio&#160; Inc</td>
			<td>SY016315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenazine methosulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate oxidase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol sodium salt&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>215011825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerwave X-I spectrophotometer</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>336001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>220299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xanthine oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Studio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC4</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes

Transporte de electrones de la membrana trans-plasma (tPMET) desempeña un papel en la protección de las células del estrés reductor intracelular, así como protección contra el daño por oxidantes extracelulares. Este proceso de transporte de electrones de reductores intracelulares a extracelulares oxidantes no está bien definida. Aquí presentamos ensayos espectrofotométricos por C2C12 miotubos para monitorear tPMET utilizando los aceptadores del electrón extracelular: 1 sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1) y 2, 6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). A través de la reducción de estos aceptadores del electrón, que son capaces de controlar este proceso en un análisis en tiempo real. Con la adición de enzimas como la ascorbato oxidasa (AO) y superóxido dismutasa (SOD) para el análisis, podemos determinar que la porción de tPMET es debido a la producción de exportación o superóxido ascorbato, respectivamente. Mientras WST-1 fue demostrada para producir resultados estables con bajo fondo, DPIP pudo ser nuevamente oxidado después de la adición de la AO y césped, que se demostró con análisis espectrofotométrico. Este método demuestra un análisis espectrofotométrico en tiempo real, multi-bien, rápido con ventajas sobre otros métodos utilizados para controlar tPMET como ferricianuro (FeCN) y reducción c ferricytochrome.

Las estadísticas se realizaron con ANOVA con medidas repetidas utilizando el software estadístico de RStudio25. Tamaños de muestra se indican en las leyendas de la figura.
Para controlar tPMET, miotubos C2C12 se utilizaron junto con aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP. AO se utilizó para determinar que porción del WST-1 y reducción de DPIP fue debido a la emanación de ascorbato y c...

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Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos

El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Investigación

Bioquímica

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Medición de la unión de proteínas a actina F por co-sedimentación

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...