Name: measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes at JoVE.com

Vi skulle vilja tacka Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino och Neej Patel för deras tekniska support. Detta arbete stöds av United States Public Health Service award R15DK102122 från nationella institutet för Diabetes och mag- och njur sjukdomar (NIDDK) till Jonathan Fisher. Manuskriptet innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella åsikter NIDDK eller National Institutes of Health.

Obs: Se figur 1 för en schematisk översikt av viktiga steg.
1. WST-1 minskning Assay
<ol><li>Växa och differentiera C2C12 vidhäftande celler använder standard cell kultur förfaranden7 i en plattan med 96 brunnar utnyttja rader A-F.<ol>
<li>Använd en differentiering medel bestående av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 2% häst serum, 100 U/mL penicillin och 0,1 mg/mL streptomycin. Inkubera cellerna vid 37...

<ol>
	<li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell.">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li><li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li><li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+trans-plasma+membrane+electron+transport+system+in+plact+cells.">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li><li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells.">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li><li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma-membrane+redox+systems+in+growth+and+development.">Transplasma-membrane redox systems in growth and development.</a> Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport:+a+cellular+assay+for+NADH-+and+NADPH-oxidase+based+on+extracellular,+superoxide-mediated+reduction+of+the+sulfonated+tetrazolium+salt+WST-1.">Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1.</a> Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).</li><li>Eccardt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle.">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).</li><li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane.">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li><li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells.">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li><li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport.">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li><li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ehrlich+cell+plasma+membrane+redox+system+is+modulated+through+signal+transduction+pathways+involving+cGMP+and+Ca2++as+second+messengers.">Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).</li><li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+plasma+membrane+redox+systems.">Multifunctional plasma membrane redox systems.</a> Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).</li><li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells.">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li><li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho(0)HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane.">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).</li><li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes.">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li><li>Herst, P. M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+oxygen+consumption:+a+major+contributor+to+cellular+oxygen+consumption+in+glycolytic+cancer+cell+lines.">Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).</li><li>Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation.">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li><li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome.">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li><li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-plasma+membrane+electron+transport+in+mammals:+functional+significance+in+health+and+disease.">Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Capacity+Redox+Control+at+the+Plasma+Membrane+of+Mammalian+Cells+Trans-Membrane,+Cell+Surface,+and+Serum+NADH-Oxidases.">High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).</li><li>Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Sulfonated+Tetrazolium+Salt+That+Produces+a+Highly+Water-Soluble+Formazan+Dye.">A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+New+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Gurtoo, H. L., Johns, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2,6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase.">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li><li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells.">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2013).</li><li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+(WST-1).">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li><li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway.">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li><li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+(phenazine+methosulfate)+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level.">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li><li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase.">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li><li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol.">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+and+cellular+basis+of+cell+proliferation+assays+that+use+tetrazolium+salts.">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li><li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt,+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan:+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents.">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li><li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+(PI3K)+signaling+pathway.">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li><li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+(B-CPAP)+cells.">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li><li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase.">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li><li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen.">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li><li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases.">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li></ol>

Vi har lagt fram två metoder för att utnyttja extracellulära Elektronacceptorer, WST-1 och DPIP, spektrofotometrisk analyser att övervaka tPMET i C2C12 myotubes. Med tillväxten av cellinjer i standard kultur förfaranden och en spektrofotometer Plattläsare är det möjligt att övervaka tPMET med dessa Elektronacceptorer i en enkel mikroplattan-analys. WST-1 minskning är reproducerbara från väl-att-väl inom ett test, men det finns variation. Dagliga variationskoefficienten (CV) utnyttja PBS som bufferten är 0,...

Renat plasma membran förmåga att minska Elektronacceptorer har lett till att plasmamembranet har en inneboende redox kapacitet1. TPMET tidigare sett i svampar, växter och djur, och är en process som är gemensamma för flera organismer2,3,4,5. Specifikt, har denna process visats i Saccharomyces cerevisiae, morot celler, erytrocyter, lymfocyter, osteosarkom, melanom, makrofager, skelettmuskel och neutrofiler2,3, 4 , 5 , 6 , 7. en process som transporterar elektroner över plasmamembranet att minska extracellulära oxidanter, tPMET är involverad i många cellulära funktioner inklusive: cell tillväxt5,8, cell livskraft9, järn ämnesomsättningen10, cell signalering11,12,13och skydd från reaktivt syre arter12,14,15. På grund av Tpmet's medverkan i många cellulära funktioner, har en obalans i tPMET antagit hypotesen för att bidra till utvecklingen av vissa allvarliga hälsotillstånd, inklusive cancer16, hjärt-kärlsjukdom17, och metaboliska syndrom18.
Det finns flera sätt att övervaka överföring av elektroner över plasmamembranet, men den mest använda tekniken är att bedöma minskningen av extracellulära Elektronacceptorer genom kolorimetrisk analyser. Vanligen används extracellulära Elektronacceptorer är tetrazolium salter, DPIP, FeCN och ferricytochrome c19,20. Det vanligaste tetrazolium saltet är en andra generationens salt känd som WST-119. Denna förening är lättare att utnyttja kolorimetriska analyser jämfört med första generationens tetrazolium salter på grund av två sulfonat grupper, som ökar dess vatten löslighet21. WST-1, reduceras jämförd med den mellanliggande elektron acceptorn 1-metoxi-phenazine metosulfat (mPMS), i två single-elektronöverföring händelser. Denna minskning ändrar svagt färgade oxiderade form av WST-1 till en mer intensiv, gul formazan20,22. WST-1 har en hög molar extinktionskoefficient 37 x 103 M-1cm-1, vilket leder till en hög assay känslighet21,22. DPIP utnyttjas också som en extracellulär Elektronacceptor att övervaka tPMET. Det har visat att DPIP kan minskas extracellularly genom tPMET utan hjälp av mellanliggande elektron acceptorer23,24. På grund av mellanliggande Elektronacceptorer, DPIP direkt kan pickupen elektroner från plasmamembranet, till skillnad från WST-124. Liknar DPIP, FeCN har visat att minskas extracellularly till kaliumferrocyanid genom tPMET utan hjälp av mellanliggande elektron acceptorer19,24. Till skillnad från WST-1 och DPIP har FeCN en låg molar extinktionskoefficient leder till en lägre analysens känslighet9. En annan vanligt förekommande extracellulära Elektronacceptor att övervaka tPMET är ferricytochrome c. liknar WST-1, ferricytochrome c minskning ökar med användning av mellanliggande Elektronacceptor, mPMS22. Till skillnad från WST-1 dock är ferricytochrome c metoden mindre känslig på grund av en hög bakgrund och en låg molar absorption koefficient22.
Här presenterar vi en metod för realtidsanalys av tPMET genom spektrofotometrisk analyser. Metoden utnyttjas de extracellulära Elektronacceptorer WST-1 och DPIP, som de båda har en hög molar extinktionskoefficient medan att vara mindre dyr jämfört med andra ofta används extracellulära Elektronacceptorer såsom ferricytochrome c. Vi utnyttjade phenazine metosulfat (PMS) i stället för mPMS de har en liknande kemisk makeup och PMS är betydligt billigare. mPMS är photochemically stabila vilket ett viktigt kännetecken för en kommersiell kit som behöver en lång hållbarhet. Men gör vi PMS färska för varje analys, så stabilitet inte bör vara ett problem. Vi presenterar också en metod för att utvärdera möjliga enzymatisk interaktioner (se figur 1) mellan extracellulära Elektronacceptor och enzymer som kan utnyttjas för att ytterligare karakterisera processen för tPMET. Specifikt, avgöra de enzymer som AO och SOD kan användas som del av tPMET beror på askorbat transport eller extracellulära superoxid release, två vanliga metoder för elektronerna transporteras över plasmamembranet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C2C12 myoblasts</td>
			<td>American Type Culture Collection&#160;</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle&#39;s medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Plex animal serum complex</td>
			<td>Gemini Bio-Products&#160;</td>
			<td>100-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>516106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Gibco Technologies</td>
			<td>16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm culture dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)</td>
			<td>Accela ChemBio&#160; Inc</td>
			<td>SY016315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenazine methosulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate oxidase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol sodium salt&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>215011825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerwave X-I spectrophotometer</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>336001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>220299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xanthine oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Studio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC4</td>
			<td>Biotek Insturments</td>
			<td>discontinued&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring trans-plasma membrane electron transport by c2c12 myotubes

Trans-plasma membran elektrontransport (tPMET) spelar en roll i skyddet av celler från intracellulära reduktiv stress samt skydd mot skador av extracellulära oxidanter. Denna process för transport av elektroner från intracellulära reduktionsmedel till extracellulära oxidanter är inte väldefinierade. Här presenterar vi spektrofotometrisk analyser av C2C12 myotubes att övervaka tPMET utnyttja de extracellulära Elektronacceptorer: vattenlösliga tetrazolium salt-1 (WST-1) och 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP eller DCIP). Genom minskning av dessa Elektronacceptorer har vi möjlighet att övervaka denna process i en realtidsanalys. Med tillägg av enzymer såsom askorbinsyra oxidas (AO) och superoxiddismutas (SOD) att analyserna, kan vi avgöra vilken del av tPMET beror askorbat produktion för export eller superoxid, respektive. Medan WST-1 visades att producera stabila resultat med låg bakgrund, kunde DPIP vara åter oxiderat efter tillsats av AO och SOD, vilket visades med spektrofotometrisk analys. Denna metod visar en realtid, flera, snabb spektrofotometrisk analysen med fördelar jämfört med andra metoder som används för att övervaka tPMET, såsom Kaliumferricyanid (FeCN) och ferricytochrome c minskning.

Statistiken utfördes med ANOVA med upprepad åtgärder använder RStudio statistisk programvara25. Urvalsstorlekar indikeras i figur legender.
För att övervaka tPMET, utnyttjades C2C12 myotubes tillsammans med extracellulära Elektronacceptorer, WST-1 och DPIP. AO användes för att avgöra vilken del av WST-1 och DPIP minskningen hade askorbat efflux och SOD användes för att avgöra vilken del av WS...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes at JoVE.com

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Mäta Trans-Plasma membran elektrontransport av C2C12 Myotubes

Målet med detta protokoll är att spektrofotometriskt övervaka trans-plasma membran elektrontransport utnyttja extracellulära Elektronacceptorer och analysera enzymatisk samspel som kan uppstå med dessa extracellulära Elektronacceptorer.

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Mätning av proteinbindning till F-aktin genom sam-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysera superkomplex av den mitokondriella elektrontransportkedjan med naturliga elektrofores, in-gel-analyser och elektrolys

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrokemisk detektion av Deuterium Kinetic isotopen effekt på extracellulära elektrontransport i Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analys av β-Amyloid-inducerad avvikelser på Fibrin Clot struktur av spektroskopi och svepelektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokona-och endoplasmatiska Retikulum avbildning av korrelat ljus och Volymelektronmikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...