本文的总体目标是，通过三维时间差显微镜，为噬菌体进行脑力噬菌体和结果红血球的可视化。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如噬细胞如何捕获和摄入粒子。这种技术允许实时可视化粒子吸收，不像在更传统的端点分析中，它只允许评估粒子是否被吸收，但不允许如何被吸收。
一般来说，对这种方法的新鲜人可能挣扎，直到他们习惯细胞隔离程序。当我们意识到旋转这种共生显微镜用于噬菌体3D延时成像的优点时，我们首先想到了这种方法。为了分离腹腔巨噬细胞，将一个24量表的塑料导管放入一只3至4个月大的小鼠的腹腔中，并使用塑料5毫升注射器用4.5毫升的冰冷HSS将腔面两次，没有钙和镁。
在收集时将吸气悬浮液转移到 14 毫升聚丙烯圆形底部管中。两个样品都收获后，将吸气离心机离机，将围体细胞重新沉淀在一毫升完全不含碳酸氢盐的RPMI 1640介质中，达到每毫升浓度的6倍至第六细胞。接下来，预填充幻灯片将一毫升完整的 HEPES 补充介质添加到纤维素涂层通道滑道幻灯片的一个储液罐中，并倾斜滑轨，使介质从下游储液罐中吸气。
要去除不需要的气泡，请向两个储层之一添加 1 到 2 毫升的新鲜介质，并紧密地应用储液罐盖。然后对盖子施加有节奏的拇指压力，将任何空气从滑轨中抽出，并必要时倾斜滑梯。当所有空气被排出时，将滑轨向包含储液罐的未封顶介质倾斜，并拆下盖子，以避免空气被吸回通道。
现在移液细胞溶液几次，以减少细胞的笨拙，并添加100微升的细胞到一个通道的幻灯片，在潮湿的室孵育两个小时，在37摄氏度没有二氧化碳。在孵化结束时，将每张幻灯片中含有介质的 HEPES 替换为完整的碳酸氢盐补充介质，正如刚才所展示的。然后将细胞放在一个37摄氏度的潮湿孵化器中，用5%的二氧化碳进行隔夜培养。
第二天早上将一毫升新鲜获得的健康献血者血液转移到两毫升圆底聚丙烯微离心管中。然后将样品离心。拆下含有上一液的血浆和抛光涂层。
并小心地将100微升沉淀的红血球转移到含有100微升完整 HEPES 补充介质的两毫升的米高分中心管中。标记管1：1，将稀释的红血球的四微升转移到含有两毫升完整 HEPES 补充介质的两毫升微离心管中。然后标记此管 4：2000，并在冰上放置两个稀释的红细胞样本管。
要给围体巨噬细胞贴上标签，请用补充 HEPES 的完整介质替换每个通道幻灯片中的碳酸氢盐介质。然后倾斜幻灯片，允许100微升的荧光标记小鼠巨噬细胞特异性抗体被添加下降明智到100微升通道的滑动。吸进流入下游储层的介质，在没有二氧化碳的情况下，在37摄氏度的潮湿室内孵育细胞20分钟。
当足细胞被轻轻标记混合4：2000红血球样本，并转移400微升细胞到一个新的两毫升微离心管，在一个加热的铝块内的层水流罩约5至8分钟。当细胞加热到37摄氏度时，将0.4微升的合适红色荧光血浆膜污渍与细胞混合。然后将细胞放回热块中。
五分钟后，通过添加1.6毫升新鲜 HEPES 补充完整的介质和离心机来清洗细胞。旋转管以识别红血球。使用 1 至 1.5 毫升移液器尖端小心地去除两卷中上流水液，而不会干扰颗粒，并混合 2000 微升新鲜 HEPES 与细胞一起补充完整介质。
在400微升介质中离心和重新悬浮颗粒。然后标记等离子膜污渍的管PMS。在20分钟内细胞标签孵育结束时，用一毫升新鲜完整的 HEPES 补充介质清洗幻灯片。
为了使红血球产生，在PMS样品管中加入一微升小鼠IGG2B单克隆抗人类CD235A抗体。在37摄氏度下8分钟后，每分钟混合一次，将100微升的血浆膜染色的GG将人类红血球转移到含有通道滑道的内膜巨噬细胞。一旦添加了人类红血球，将幻灯片安装在旋转的圆盘共合显微镜上。
随着舞台培养箱设置为37摄氏度，并立即开始成像细胞。绿色荧光巨噬细胞与红色荧光人类红血球的延时3D成像使单粒子噬细胞事件的可视化。例如，可以观察到通过巨噬细胞脂肪捕获小鼠 IGG 蛋白化人类红血球。
此外，在吞噬杯形成过程中人类红血球的挤压。看完这段视频后，您应该对如何分离小鼠驻留性内皮内巨噬细胞、荧光标记细胞和观察粒子有一个很好的理解。
