Name: time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages
Uploaded: 2018-10-19T13:00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions HA 3271/4-1 et HA 3271/4-2 de la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) et la subvention FF-2016-05 de EXC 1003 (Cluster d’Excellence 1003), cellules en mouvement (CiM), DFG.

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La grande majorité des dosages de phagocytose, surtout les point final et les essais de haut débit, ne fournit pas de visualisation de comment les particules sont effectivement capturés, enveloppés et ingérés. Pionnier dans l’étude de Munthe-Kaas et al. 10 et Kaplan2 dans les années 1970 ont suggéré que remarquablement différentes réorganisations du cytosquelette sont impliquées dans la phagocytose des IgG-opsonized contre les particules complément-opsonized (mouton culots globulaires). Nous décrivons ici les dosages de phagocytose tourne disque microscopie confocale permettant l’imagerie à haute résolution et en temps réel des événements phagocytaires uniques. Notre phagocyte modèle est la les macrophages péritonéaux résident de souris, qui peuvent être isolés avec manipulation minimale, et nous utilisons fraîchement isolées des globules rouges humains sous forme de particules. Toutefois, les dosages de phagocytose pourraient être appliqués aux autres phagocytes, telles que les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris ou neutrophiles, lignées cellulaires de souris macrophage, macrophages dérivés de monocytes humains ou neutrophiles du sang périphérique humain. Dans le cas des phagocytes humains ou neutrophiles souris, alternative anticorps fluorescent marqués serait nécessaire, comme anti-CD14 fluorescent étiquetés anticorps (monocytes/macrophages humains)16 ou des anticorps anti-Gr-1 (Ly - 6 G) (souris neutrophiles).
Unopsonized globules rouges humains, comme les globules rouges de mouton utilisée traditionnellement, sont inertes en ce sens que ces cellules sont pas (ou, du moins, très rarement) ingérés par les macrophages péritonéaux de souris. Ce qui assure, à la différence de billes de polystyrène, activité faible bruit de fond. Globules rouges humains peut être commodément opsonized avec immunoglobulines à l’aide de la souris IgG ou IgM anticorps monoclonaux contre CD235a (glycophorine A), un marqueur spécifique des érythrocytes humains (globules rouges) et de précurseurs érythroïdes17, 18. anti-souris fluorescent étiquetés IgG ou IgM Anticorps secondaires peuvent être appliquées dans des dosages parallèles, pour confirmer l’opsonisation. Les classes d’anticorps IgG et IgM sont hémagglutinines, substances (anticorps) qui causent des globules rouges à agglutiner. Pour éviter l’agglutination, on mélange par intermittence la suspension cellulaire au cours de la période d’incubation de 8 min avec anticorps anti-CD235a, et puis nous ajoutons la suspension mixte directement à une diapositive contenant des macrophages canal (enduit de la fibronectine diapositive) sans un pas de lavage . Pas de lavage impliquent de sédimentation des globules rouges par centrifugation, ce qui encourage vivement l’agglutination. Avant opsonisants globules rouges humains, nous étiquetons la membrane plasmique avec sonde fluorescente orange/rouge lipophile. Cette sonde est brillamment fluorescente au début des enregistrements Time-lapse, mais le signal disparaît peu à peu, probablement en grande partie en raison de photoblanchiment19. En outre, les macrophages et le revêtement de la fibronectine de la diapositive peuvent devenir faiblement orange/rouge fluorescent durant les enregistrements. Ce problème est probablement dû à un lavage insuffisant de globules rouges humains après marquage. Au lieu d’utiliser un marqueur de la membrane de plasma fluorescent lipophiles, globules rouges humains pourrait être étiquetés avec un dérivé rhodamine sensibles au pH à l’aide de son amine réactive succinimidyl ester15,20. Cela a l’avantage de permettre la visualisation de la maturation du phagosome puisque l’intensité de la fluorescence augmente avec la diminution de pH15,20, mais cette approche présente l’inconvénient que les préparatifs de réactif ester sont actuellement cher et instable après reconstitution en milieu aqueux.
IgG-opsonized globules rouges humains sont ingérés par l’intermédiaire de FcγRs, qui peut être confirmé à l’aide des macrophages péritonéaux isolé de NOTAM21 ou Fcer1g- / - (Fcer1g) souris. Les macrophages NOTAM lier IgG-opsonized globules rouges humains, mais n’ont pas ITAM (motif de l’activation basée sur tyrosine immunoreceptor) - mediated signaling nécessaire pour induire la phagocytose, tandis que les macrophages knockout Fcer1g n’expriment pas de surface FcγRs. IgG - ou IgM-opsonized globules rouges humains peuvent en outre être opsonized avec C3b (qui est clivé en iC3b) en incubant les cellules avec du sérum fraîchement isolé par un complément C5 null de souris (sérum sauvage provoque une hémolyse). Les opsonines IgG et IgM activent la cascade du complément classique, qui conduit à la formation des pores (complexe d’attaque membranaire) et la lyse cellulaire. Dans les souris dépourvues de complément C5, la cascade du complément procède pour compléter le clivage de C3, mais C5 convertase manque le substrat nécessaire pour catalyser la voie terminale. Nous avons développé des tests simples pour mesurer la cinétique de la cascade du complément. En bref, des globules rouges humains peuvent être conjointement étiquetées avec un rouge fluorescent, marqueur de la membrane plasmique et vert fluorescent, cytosolique fluorophore. Lors de la formation de l’attaque de membrane complexe, formé de composants complément C5-C9, le fluorophore cytosolique est rapidement (en secondes) perdu du cytosol. Visualisation de la fonction d’effecteur (cytolyse) de la cascade de complément a indiqué que les temps d’incubation de 4 min suffit pour C3b/iC3b opsonisation de globules rouges humains. Dans des essais parallèles, C3b/iC3b revêtement de globules rouges humains peut être facilement évaluée après avoir appliqué un mélange de C3b anti-souris et fluorescent étiquetée anticorps secondaires. Dans ce cas, un lavage est nécessaire pour éliminer les anticorps fluorescents non fixés. Bien que l’étape de lavage implique des cellules sedimentaion par centrifugation, ce qui favorise l’agglutination, opsonisation réussie peut être facilement évaluée par microscopie confocale. Phagocytose médiée par les récepteurs de complément peut être photographiée par chaque application IgG- / iC3b-opsonized de sang rouge humain cellules NOTAM ou Fcer1g- / - macrophages ou en introduisant des IgM- / iC3b-opsonized de sang rouge humain cellules aux macrophages sauvage. IgM-opsonized des cellules de sang ne sont pas reconnus par l’ITAM contenant FcγRs (FcγRI, FcγRIII et FcγRIV) requis pour la phagocytose de particules IgG-opsonized22.
Pour image phagocytaire des événements, la membrane plasmique des macrophages peuvent être étiquetés avec anticorps anti-F4/80 conjugué fluorophore fluorescent vert, qui sert également de marqueur spécifique des macrophages de souris. Globules rouges humains puissent être rendus rouge fluorescent par incubation avec un marqueur rouge/orange fluorescent plasmalemme, tel que discuté ci-dessus. Ce marqueur de la membrane plasmique lipophiles évite les effets confondants potentiels d’étiquettes à base d’anticorps. Rouges fluorescents globules rouges humains, avec ou sans l’opsonisation, peuvent être distribués directement dans le canal 100 µL d’une lame de canal et imagés Time-lapse 3D via un 60 X / 1,49 huile d’immersion (ou similaire) objectif effectuée à l’aide de la 488 nm et les 561 nm laser lignes , respectivement, d’un microscope confocal (ou similaire) à disque filature. Il est tentant pour optimiser le système d’imagerie à haute résolution, mais l’acquisition de répétées Z-piles de plus de 16 minutes ou phototoxicité et photoblanchiment considérable pourrait causer. Nous avons choisi d’utiliser 2 x 2 binning pour promouvoir les bons rapports signal-bruit et permettent des réductions dans l’intensité d’excitation et/ou des durées d’exposition, mais au détriment de la résolution optique. En outre, pour réduire la phototoxicité, nous ajoutons un charognard des espèces réactives de l’oxygène dans le milieu. Dans de futures études, les essais pourraient être modifiées pour l’image de la phagocytose des érythrocytes humains apoptotic. Application d’un ionophore2 + Ca, comme A23187, peut être utilisée pour induire la phosphatidylsérine externalisation23, un « mangez-moi » signal et caractéristique du début l’apoptose24,25.

Vingt ans plus tôt l’observation de Metchnikoff des cellules phagocytaires mésenchyme chez les larves de l’étoile de mer, en 1882 et le développement subséquent de sa théorie de la phagocytose1, Ernest Haeckel décrit, en 1862, l’enlisement des particules de colorants insolubles par le sang cellules de fimbris de Thetis (fimbria Tethys), une espèce de limace de mer prédateur (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria) : Eine Monographie ; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Il a décrit explicitement des saillies de membrane enveloppant les particules qui ont été ensuite repris dans le cytoplasme et accumulés autour du noyau de la cellule. Plus de 100 ans plus tard, une étude pionnière de Kaplan a suggéré qu’il y avait au moins deux mécanismes distincts de phagocytose2. Kaplan a montré au moyen de la microscopie électronique à balayage de cette souris péritonéale macrophages ingéré un globule rouge mouton IgG-opsonized à l’aide des extensions de fine membrane qui a atteint vers le haut et enveloppée hermétiquement la particule, initialement donnant lieu à un coupe-like structure. Phagocytaires coupe formation requise polymérisation de l’actine, puisqu’elle a été abrogée par la toxine fongique cellules perméables cytochalasine B, connu pour bloquer la dynamique de l’actine3. En revanche, les globules rouges de mouton opsonized avec complément semblait s’enfoncer directement dans le macrophage sans la génération des extensions de la membrane, bien que, dans certaines images, volants de membrane peuvent être vu dans le voisinage immédiat des particules naufrage. Contrairement à la formation de coupe phagocytaires, complément médiée par les récepteurs naufrage en a été insenstive à la cytochalasine B traitement2. Dans les expériences décrites par Kaplan, complément opsonisation a été réalisée en incubant des immunoglobulines M (IgM) étiqueté moutons globules rouges avec du sérum de souris complément C5-déficient, qui contourne l’hémolyse par le terminal de complément C5-dépendante compléter le complexe.
Les deux modes de phagocytose, formation coupe phagocytaire et naufrage, identifiés par Kaplan sont devenus les avis établis dans le champ4,5,6,7,8,9 . Cependant, les images à très haute résolution utilisée dans l’étude originale de Kaplan2, comme une étude similaire réalisée par Munthe-Kaas et al. 10, seulement des instantanés des événements phagocytaires. Dans une étude récente, Rougerie et al. 11 a souligné que les différences morphologiques entre FcγR et CR-médiée par phagocytose restent à clarifier et, en outre, membrane volants ont été observés pendant complément médiée par les récepteurs particule absorption2. Imagerie de cellules vivantes des événements phagocytaires uniques allant de capture des particules à l’internalisation, combinée avec génétiquement modifié des souris modèles, pourrait grandement améliorer notre compréhension de comment les phagocytes capturent et ingèrent des particules. Une approche peut consister à utiliser la microscopie à force atomique rapide (AFM) qui permet l’imagerie topographique très haute résolution (10 à 20 nm) des cellules vivantes. Récemment, un rapide du système AFM12 a été développé, qui est adapté pour des surfaces cellulaires d’imagerie rapide avec peu de bruit. Cette technique a l’avantage que paramètres haute résolution, topographiques et mécanique des cellules peuvent être mesurées à de courts intervalles (secondes), contrairement à la microscopie électronique, qui nécessite la fixation et le point critique de séchage de la vie cellules. Une autre approche est la microscopie confocale 3D Time-lapse, laquelle est largement disponible, bien que la phototoxicité et blanchiment sont des facteurs limitants durant les enregistrements. Cette approche est très polyvalente et permet optique découpe avec une résolution spatiale élevée et permet une souplesse extraordinaire au marquage avec un éventail impressionnant de sondes fluorescentes, y compris des protéines fluorescentes codés génétiquement. Nous décrivons ici la phagocytose tests à l’aide de la microscopie confocale disque spinning Time-lapse qui permettent à haute résolution spatio-temporelle d’événements phagocytaires médiée par les récepteurs spécifiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">24-G plastic catheter</td>
			<td style="width:257px;">B Braun Mesungen AG, Germany</td>
			<td style="width:119px;">4254503-01</td>
			<td style="width:167px;">Used for peritoneal lavage</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hank&#8217;s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Used for peritoneal lavage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">14 ml polypropylene round bottom tubes</td>
			<td style="width:257px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td>Used to collect peritoneal cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R7388</td>
			<td>Basis medium for assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10082139</td>
			<td>Used as supplement for RPMI 1640 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">100x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Used as supplement for RPMI 1640 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fibronectin-coated &#181;-Slide&#160;I chambers</td>
			<td style="width:257px;">Ibidi, Martinsried, Germany</td>
			<td style="width:119px;">80102</td>
			<td>Channel slides used for assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">&#181;-Slide (anodized aluminum) rack</td>
			<td style="width:257px;">Ibidi, Martinsried, Germany</td>
			<td style="width:119px;">80003</td>
			<td>Autoclavable stackable rack for channel slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">RPMI 1640 medium containing bicarbonate</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8758</td>
			<td>Medium for overnight culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">N-(2-mercaptopropionyl)glycine</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6635</td>
			<td>Scavenger of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:508px;">Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MF48020</td>
			<td>Mouse macrophage marker and plasma membrane label</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">CellMask Orange</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10045</td>
			<td>Red fluorescent plasma membrane stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Succinimidyl ester of pHrodo</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36600</td>
			<td>Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA1-20893</td>
			<td>Used to opsonize human red blood cells with IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Alexa Fluor 594-conjugated&#160; goat anti-mouse (secondary) IgG antibody</td>
			<td style="width:257px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">Ab150116</td>
			<td>Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody</td>
			<td style="width:257px;">Hycult Biotech</td>
			<td style="width:119px;">HM1065</td>
			<td>Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11006</td>
			<td>Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Calcein/AM</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C3100MP</td>
			<td>Used to load human red blood cells with Calcein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon Eclipse Ti inverse microscope</td>
			<td style="width:257px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSU-X1 spinning disk scanner</td>
			<td style="width:257px;">Yokogawa Electric Corporation, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nipkow spinning disk unit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:508px;">14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera</td>
			<td style="width:257px;">Hamamatsu Photonics Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">488 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">561 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages

Phagocytose joue un rôle clé dans la défense de l’hôte, ainsi que dans l’entretien et le développement des tissus et implique des réarrangements rapides, médiée par les récepteurs du cytosquelette d’actine pour capturer, enveloppent et engloutir de grosses particules. Bien que les récepteurs phagocytaires, les voies de signalisation en aval et effecteurs, tels que les GTPases Rho, ont été identifiés, le remodelage du cytosquelette dynamique d’événements phagocytaires médiée par les récepteurs spécifiques demeurent incertains. Il y a quatre décennies, deux mécanismes distincts de phagocytose, illustrée par des récepteurs Fcγ (FcγR) - et les récepteurs du complément (CR) - médiée par phagocytose, ont été identifiés à l’aide de la microscopie électronique à balayage. Liaison d’immunoglobuline G (IgG)-particules opsonisées FcγRs déclenche la saillie des extensions de la fine membrane, qui forment au départ une tasse phagocytaire soi-disant autour de la particule avant qu’il devient complètement clos et rentrer dans la cellule. En revanche, les particules de complément opsonized semblent s’enfoncer dans les phagocytes après fixation aux récepteurs de complément. Ces deux modes de phagocytose, formation coupe phagocytaire et naufrage, sont devenus bien établie dans la littérature. Cependant, les distinctions entre ces deux modes sont devenues floues par les rapports que la phagocytose médiée par les récepteurs du complément peut induire diverses saillies de membrane. Avec la disponibilité des techniques d’imagerie de haute résolution, des essais de phagocytose sont nécessaires qui permettent la visualisation en temps réel de 3D (trois dimensions) de récepteurs phagocytaires comment spécifiques médiat l’absorption des particules individuelles. Plus couramment utilisé des approches pour l’étude de la phagocytose, notamment des essais de point final, manquer l’occasion de comprendre ce qui se passe à l’interface des particules et des phagocytes. Nous décrivons ici les dosages phagocytaires, à l’aide de la microscopie confocale disque spinning Time-lapse, qui permettent l’imagerie 3D de simples événements phagocytaires. En outre, nous décrivons les dosages pour sans ambiguïté l’image récepteurs Fcγ - ou compléter la phagocytose médiée par les récepteurs.

Un diagramme schématique de la diapositive de canaux utilisé pour l’imagerie de phagocytose par microscopie confocale spinning Time-lapse est illustré à la Figure 1. Globules rouges humains (hRBCs) sont colorées avec le marqueur de la membrane plasmique fluorescent rouge CellMask Orange, tandis que les macrophages péritonéaux résident isolés de souris (Ms) sont étiquetés avec vert fluorescent Alexa Fluor 488 anti-F4/80 anticorps conjugué ( Figure 2), qui sert comme un marqueur spécifique des macrophages de souris et une étiquette de la membrane plasmique. Globules rouges humains peut être opsonized avec la souris IgG (mIgG) ou d’IgM (mIgM), la souris en incubant les cellules à IgG (ou IgM) anticorps anti-CD235a (CD235a, également connu sous le nom de glycophorine A, est une protéine exprimée spécifiquement sur les globules rouges humains). Time-lapse imagerie 3D des macrophages fluorescents verts, présenté avec rouges fluorescents globules rouges humains permet la visualisation des événements phagocytaire de particule (Figure 2). Une observation attentive des événements phagocytaires unique permet détails de la capture des particules et l’ingestion pour être délimité. Par exemple, la capture d’un mIgG-opsonized humain globule rouge par un filopodium de macrophage, une projection mince, doigt, peut être observée (Figure 3 a; Voir aussi Horsthemke et al. 15). en outre, la compression d’une cellule humaine du sang rouge pendant la formation coupe phagocytaires peut être observée (Figure 3 a). Lors de l’introduction de sérum de souris fraîche, mIgG-opsonized, ou de globules rouges humains, mIgM-opsonized déclenchent la cascade de complément classique, qui aboutit à la formation d’un complexe d’attaque membranaire hémolytique. La cinétique d’hémolyse médiée par le complément peut être mesurée par imagerie de cellules double marquage avec CellMask Orange et calcéine. Vert fluorescent calcéine cytosolique est rapidement libéré par les cellules au cours de l’hémolyse (Figure 3 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig1.jpg"> Figure 1 : manipulation des diapositives de canal revêtu la fibronectine. Diapositive de canal (A) A se compose de deux réservoirs reliés par un canal avec les dimensions 50 x 5 mm 0,4 mm canal diapositives sont préremplis initialement en appliquant 1-2 mL de milieu à l’un des deux réservoirs et en inclinant la diapositive. Caps (B) peuvent être placés dans les réservoirs avant l’incubation. Les bouchons peuvent être utilisées pour pomper de bulles d’air indésirables avant le semis du canal avec les cellules. Canal de 100 µL (C) l’air exempt de bulles peut être comblé par pipetage directement moyen dans la bouche d’un canal. Cette étape est utilisée, par exemple, aux macrophages de graines dans une diapositive ou d’ajouter gfluorophore (vert fluo)-anticorps anti-F4/80 conjugué, qui sert une étiquette de membrane, mais aussi un marqueur de macrophages de souris. (D) après que pipetage des particules, comme opsonisées globules rouges humains, dans un canal ensemencé avec fluorescent teinté de macrophages, la lame peut être placée sur la scène d’un microscope inversé et la microscopie confocale spinning Time-lapse disque peut être effectué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig2.jpg"> Figure 2 : imagerie 3D Time-lapse de phagocytose. (A) schéma montrant l’opsonisation de membrane plasmique colorée (rouge fluorescent) globules rouges humains (hRBCs) avec des anticorps de souris (m) anti-CD235a immunoglobuline G (mIgG) et la présentation des hRBCs marqués de macrophages de souris (Ms), étiqueté (vert fluorescent) avec vert fluorescent anticorps conjugué fluorophore anti-F4/80. (B) Images de Time-lapse (vues XZ), obtenues en faisant tourner la microscopie confocale disque, montrant la formation coupe phagocytaire et ingestion de mIgG-opsonized hRBCs. Echelle = 10 µm. (C) reconstructions 3D montrant des macrophages ingérant mIgG-opsonized hRBCs. Vues XZ correspondantes (pour 3 de la h) apparaissent en représentent des espacements B. grille 5,07 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig3.jpg"> Figure 3 : Capture d’une particule par une filopodium. Images de Time-lapse, obtenue en faisant tourner la microscopie confocale disque, montrant un macrophage souris capture une immunoglobuline souris G (mIgG)-opsonisées humaine de globules rouges (GRH) via un filopodium (flèches dans le panneau du haut), une projection de doigt. Notez que les globules rouges perd sa crenations tôt au cours de la formation de coupe phagocytaire. De plus, la coupe phagocytaire semble se faufiler le globule rouge enveloppé (indiqué par des flèches dans le panneau inférieur). Echelle = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Nous décrivons ici des méthodes à l’aide de microscopie confocale de rotation disque aux événements phagocytaires unique image de macrophages péritonéaux résident de souris. Les protocoles peuvent être étendues à d’autres cellules phagocytaires.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

L’objectif global de cet essai, est de préparer des macrophages et des globules rouges opsonisés pour la visualisation de la phagocytose par microscopie tridimensionnelle time lapse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que la façon dont les phagocytes capturent et ingèrent les particules. Cette technique permet la visualisation de l’absorption des particules en temps réel, contrairement aux analyses de point final plus traditionnelles qui ne permettent d’évaluer si oui ou non comment, une particule a été ingérée.En général, les personnes nouvelles à cette méthode peuvent lutter jusqu’à ce qu’elles deviennent habituées aux procédures d’isolement cellulaire. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé les avantages de faire tourner cette microscopie confocale pour l’imagerie 3D time-lapse de Phagocytosis. Pour isoler les macrophages péritonéaux, placez un cathéter en plastique de calibre 24 dans le péritoine d’une souris de trois à quatre mois, et utilisez une seringue en plastique de cinq millilitres pour la lavage de la cavité deux fois avec 4,5 millilitres de HBSS glacé sans calcium et magnésium par lavage.Transfert de la suspension aspirée dans un tube de fond rond en polypropylène de 14 millilitres au fur et à mesure qu’elle est recueillie. Lorsque les deux échantillons ont été récoltés, centrifuger l’aspirate, et resuspendre les cellules péritonéales dans un millilitre de bicarbonate complet libre RPMI 1640 milieu pour atteindre environ six fois 10 à la sixième cellule par concentration millilitre. Ensuite, pour pré-remplir les diapositives ajouter un millilitre de milieu complété HEPES complet à un réservoir d’une glissière de canal enduit de fibronectine, et incliner la glissière pour permettre au milieu d’être aspiré à partir du réservoir en aval.Pour éliminer les bulles d’air indésirables, ajoutez un à deux millilitres de milieu frais à l’un des deux réservoirs et appliquez bien un bouchon de réservoir. Appliquez ensuite une pression rythmique du pouce sur le capuchon pour pomper tout air hors de la glissière, en inclinant la glissière au besoin. Lorsque tout l’air a été expulsé, inclinez la glissière vers le milieu non plafonné contenant le réservoir et retirez le bouchon pour éviter que l’air ne soit aspiré dans le chenal.Maintenant pipette la solution cellulaire à quelques reprises pour réduire l’agglutination, et ajouter 100 microlitres des cellules dans un canal de la diapositive pour une incubation de deux heures dans une chambre humide à 37 degrés Celsius en l’absence de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation remplacer le HEPES contenant milieu dans chaque diapositive avec bicarbonate complet complété milieu comme vient de le démontrer. Placez ensuite les cellules dans un incubateur humide de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pour leur culture nocturne.Le lendemain matin, transférez un millilitre de sang de donneur sain fraîchement obtenu dans un tube de microcentrifugeuse de polypropylène rond de deux millilitres. Puis centrifuger l’échantillon. Retirer le plasma et le pelage bouffi contenant du supernatant.Et transférez soigneusement 100 microlitres des globules rouges sédimentés dans un tube de mircocentrifugeuse de deux millilitres contenant 100 microlitres de milieu complété complet de HEPES. Étiquetez le tube 1:1 et transférez quatre microlitres des globules rouges dilués dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de deux millilitres contenant deux millilitres de milieu complété par HEPES complet. Ensuite, étiquetez ce tube 4:2000 et placez les deux tubes dilués d’échantillon de globule rouge sur la glace.Pour étiqueter les macrophages péritonéaux remplacer le milieu bicarbonate dans chaque diapositive de canal avec des médiums complets complétés par HEPES. Inclinez ensuite la glissière pour permettre l’ajout de 100 microlitres de l’anticorps spécifique macrophage de souris marqué fluorescentement à l’ouverture du canal de 100 microlitres de la diapositive. Aspirer le milieu qui se jette dans le réservoir en aval, et incuber les cellules pendant 20 minutes dans une chambre humide à 37 degrés Celsius en l’absence de dioxyde de carbone.Alors que les cellules péritonéales sont étiquetées mélanger doucement 4:2000 globules rouges échantillon et transférer 400 microlitres des cellules dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de deux millilitres, dans un bloc d’aluminium chauffé à l’intérieur d’un capot d’écoulement laminaire pendant environ cinq à huit minutes. Lorsque les cellules se sont réchauffées à 37 degrés Celsius, mélanger 0,4 microlitres d’une tache appropriée de membrane plasmatique fluorescente rouge avec les cellules. Ensuite, placez les cellules dans le bloc thermique.Après cinq minutes laver les cellules en ajoutant 1,6 millilitres de HEPES frais complété moyen complet et centrifugeuse. Faites pivoter le tube pour identifier la pastille des globules rouges. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 à 1,5 millilitre, retirez soigneusement le supernatant en deux volumes sans déranger la pastille et mélangez 2000 microlitres de milieu complet frais complété par hepes avec les cellules.Centrifugeuse et re-suspendre la pastille dans 400 microlitres de milieu. Étiquetez ensuite le tube PMS pour la tache de membrane plasmatique. À la fin de l’incubation d’étiquetage péritonéal de cellules de 20 minutes lavez la glissière avec un millilitre de milieu complété hepes complet frais.Pour opsoniser les globules rouges ajouter un microlitre de souris IGG2B anticorps anti-humain CD235A au tube d’échantillon PMS. Après huit minutes à 37 degrés Celsius avec le mélange une fois par minute de transfert 100 microlitres de la membrane plasmatique tachée IGG opsonized globules rouges humains au macrophage péritonéal contenant la glissière de canal. Dès que les globules rouges humains ont été ajoutés monter la diapositive sur un microscope confocal disque filature.Avec l’incubateur de scène fixé à 37 degrés Celsius et commencer immédiatement l’imagerie des cellules. Time lapse 3D-imaging of green fluorescent macrophages presented with red fluorescent human red blood cells enables the visualization of single particle phagocytic events. Par exemple, la capture d’une souris IGG opsonized globule rouge humain par un filopodium macrophage peut être observée.En plus, la compression d’un globule rouge humain pendant la formation de tasse phagocytique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les macrophages péritonéaux résidents de la souris, les cellules étiquetées fluorescentes et les particules opsonisées.

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