Name: time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages
Uploaded: 2018-10-19T13:00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים חה 3271/4-1 ו- HA 3271/4-2 מ DFG (פתוח), ואת המענק FF-2016-05 מ סיפורה ה 1003 (אשכול של מצוינות 1003), תאים בתנועה (CiM), DFG.

<ol>
	<li>Tauber, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metchnikoff+and+the+phagocytosis+theory.">Metchnikoff and the phagocytosis theory.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 4, 897-901 (2003).</li><li>Kaplan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+mode+of+phagocytosis+with+Fc+and+C3+receptors+in+macrophages.">Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages.</a> Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).</li><li>Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytochalasin+and+phalloidin+on+actin.">Effects of cytochalasin and phalloidin on actin.</a> The journal of cell biology. 105, 1473-1478 (1987).</li><li>Caron, E., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+distinct+mechanisms+of+phagocytosis+controlled+by+different+Rho+GTPases.">Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases.</a> Science. 282, 1717-1721 (1998).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual review of immunology. 17, 593-623 (1999).</li><li>Chimini, G., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+Rho+family+proteins+in+actin+dynamics+during+phagocytosis+and+engulfment.">Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment.</a> Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).</li><li>Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+during+phagocytosis.">Actin dynamics during phagocytosis.</a> Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).</li><li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes.">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).</li><li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+during+phagocytosis.">Information processing during phagocytosis.</a> Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).</li><li>Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+internalization+of+opsonized+particles+by+rat+Kupffer+cells+in+vitro.">On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro.</a> Experimental cell research. , 201-212 (1976).</li><li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+membrane+structures+during+phagocytosis+and+chemotaxis+of+macrophages:+role+and+regulation+of+the+actin+cytoskeleton.">Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton.</a> Immunological reviews. , 222-239 (2013).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+optomechanical+actuators+for+controlling+mechanotransduction+in+living+cells.">Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells.</a> Nature. 13, 143-146 (2016).</li><li>Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia+using+gaseous+agents+in+laboratory+rodents.">Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents.</a> Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).</li><li>McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+changes+in+volatile+general+anesthetic+sensitivity+of+mice+after+local+or+systemic+pharmacological+intervention.">Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention.</a> Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).</li><li>Horsthemke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+filopodial+dynamics+in+particle+capture+and+phagocytosis+and+phenotypes+of+Cdc42+and+Myo10+deletion.">Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion.</a> The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).</li><li>Bzymek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+two-+and+three-dimensional+imaging+of+monocyte+motility+and+navigation+on+planar+surfaces+and+in+collagen+matrices:+Roles+of+Rho.">Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho.</a> Scientific reports. 6, 25016 (2016).</li><li>Poole, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+cell+antigens+on+band+3+and+glycophorin+A.">Red cell antigens on band 3 and glycophorin A.</a> Blood reviews. 14, 31-43 (2000).</li><li>Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+review+of+our+current+understanding+of+red+blood+cell+(RBC)+glycoproteins.">A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins.</a> Membranes. 7, (2017).</li><li>Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+kinetics+of+fluorescein+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).</li><li>Boross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FcRgamma-chain+ITAM+signaling+is+critically+required+for+cross-presentation+of+soluble+antibody-antigen+complexes+by+dendritic+cells.">FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells.</a> Journal of immunology. , 5506-5514 (2014).</li><li>Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+natural+IgM:+scavenger,+protector+and+regulator.">The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator.</a> Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).</li><li>Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine-related+adhesion+of+human+erythrocytes+to+vascular+endothelium.">Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium.</a> British journal of haematology. , 300-302 (1999).</li><li>Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;phagocytic+synapse&amp;#34;+and+clearance+of+apoptotic+cells.">The &amp;#34;phagocytic synapse&amp;#34; and clearance of apoptotic cells.</a> Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).</li><li>Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+phospholipid+scramblases+in+apoptosis:+An+overview.">The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview.</a> Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הרוב המכריע של phagocytosis מבחני, במיוחד מובילים, מבחני תפוקה גבוהה, אינם מספקים ויזואליזציה של מה חלקיקים הם למעשה בשבי, אפוף בלע. חלוצי מחקרים על ידי וייה רומא-לי קאס. et al. 10 וקפלן2 בשנות השבעים הציע כי ארגון מחדש cytoskeletal שונה היו מעורבים של phagocytosis של IgG-opsonized לעומת חלקיקים opsonized המשלים (כבשים של כדוריות דם אדומות). כאן נתאר מבחני phagocytosis באמצעות ספינינג דיסק קונפוקלית המאפשרים הדמיה ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת של אירועים phagocytic יחיד. פגוציט המודל שלנו הוא העכבר תושב הצפק macrophage, שיכולה להיות מבודדת עם טיפול מינימלי, ונשתמש כדוריות דם אדומות אנושי טרי מבודדים כמו חלקיקים. עם זאת, מבחני phagocytosis יכול לחול על phagocytes אחרים, כגון מקרופאגים הנגזרות מח עצם העכבר או נויטרופילים, העכבר קווי macrophage התא, מקרופאגים נגזר מונוציט אנושי או דם היקפיים אנושי נויטרופילים. במקרה של phagocytes אנושי או העכבר נויטרופילים, אלטרנטיבה המסומנות fluorescently נוגדנים יהיה צורך, כגון תוויות fluorescently אנטי-CD14 נוגדנים (האדם ומונוציטים macrophages)16 או אנטי-Gr-1 (Ly - 6 גרם) נוגדנים (עכבר נויטרופילים).
Unopsonized האנושי כדוריות דם אדומות, כמו כבשים משמשת כדוריות דם אדומות, שהם מבינים במובן כי תאים אלה לא (או, לפחות, מאוד נדיר) בלע על ידי מקרופאגים הצפק העכבר. הדבר מבטיח, בניגוד חרוזי פוליסטירן, פעילות רקע נמוך. כדוריות דם אדומות האנושי יכול opsonized בנוחות עם immunoglobulins באמצעות העכבר IgG או IgM נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD235a (glycophorin A), סמן ספציפיות של האדם אריתרוציטים (כדוריות דם אדומות), מבשרי erythroid17, 18. במבחני מקבילים, שכותרתו fluorescently העכבר אנטי איג או IgM משני נוגדנים יכול להיות מיושם לאשר opsonization. השיעורים נוגדנים IgG ו- IgM הם hemagglutinins, חומרים (נוגדנים) הגורמות תאי דם אדומים agglutinate. כדי להימנע התלכדות, אנחנו לסירוגין לערבב התליה תא במהלך תקופת דגירה 8 דקות עם נוגדן anti-CD235a, ולאחר מכן אנחנו להוסיף ההשעיה מעורבים ישירות לשקופית המכילה מקרופאג ערוץ (שקופית מצופים fibronectin) ללא צעד לשטוף . שטיפת צעדים לערב שקיעת כדוריות דם אדומות על ידי צנטריפוגה, המקדם חריפה התלכדות. לפני opsonizing האנושי כדוריות דם אדומות, מתייגים קרום פלזמה גשש פלורסנט lipophilic כתום/אדום. המכשיר הזה היא פלורסנט במאור פנים עם תחילת הקלטות זמן לשגות, אך האות מתפוגג בהדרגה, כנראה בעיקר בשל photobleaching19. בנוסף, מאקרופאגים הציפוי fibronectin של השקופית עלולים להיות חלש כתום/אדום פלואורסצנטי במהלך הקלטות. בעיה זו נובעת ככל הנראה כביסה לא מספיק תאי דם אדומים אנושי לאחר תיוג. במקום להשתמש בסמן lipophilic קרום פלזמה פלורסנט, כדוריות דם אדומות האנושי יכול להיקרא עם נגזרת rhodamine רגיש pH באמצעות שלה אמין succinimidyl תגובתי אסתר15,20. זה יש את היתרון של המאפשר ויזואליזציה של התבגרות phagosome מאז עוצמת קרינה פלואורסצנטית עולה עם הפחתת pH15,20, אבל גישה זו יש החיסרון הנמצאות אסתר תגובתי ההכנות כעת יקר ולא יציב לאחר שיחזור במדיום מימית.
אג-opsonized כדוריות דם אדומות האנושי בלע ויה FcγRs, אשר יכול להיות אישרו שימוש מקרופאגים הצפק מבודד מן NOTAM21 או Fcer1g- / - עכברים (Fcer1g נוק אאוט). מקרופאגים NOTAM לאגד IgG opsonized כדוריות דם אדומות אנושי, אבל חוסר ITAM (מוטיב הפעלה מבוססת-טירוזין immunoreceptor) - מתווכת איתות הנדרש כדי לגרום phagocytosis, ואילו Fcer1g נוקאאוט מקרופאגים שאינם מבטאים משטח FcγRs. איג - או IgM-opsonized כדוריות דם אדומות האנושי יכול להיות בנוסף opsonized עם C3b (אשר הוא ביקע את iC3b) על ידי המקננת התאים עם סרום טרי מבודד מן עכבר null המשלים C5 (סרום פראי-סוג גורם המוליזה). Opsonins IgG ו- IgM להפעיל את המפל המשלים הקלאסית, מה שמוביל להיווצרות נקבוביות (ממברנה התקפה מתחמי) והמסה התא. ב עכברים שחסרו המשלים C5, המפל המשלים ממשיך כהשלמה C3 המחשוף, אבל C5 convertase חסר את המצע הנדרש כדי לעודד את המעבר מסוף. פיתחנו מבחני פשוטה כדי למדוד את קינטיקה של המפל המשלים. בקיצור, תאי דם אדומים האנושי יכול להיות משותף שכותרתו עם אדום פלואורסצנטי, קרום פלזמה סמן את fluorophore ירוק ניאון, cytosolic. על היווצרות של ההתקפה ממברנה מורכבים, שהוקמה על ידי מרכיבי המשלים C5-C9, fluorophore cytosolic זה במהירות (בשניות) איבד מן ציטוזול. ויזואליזציה של הפונקציה סוף-אפקטור (cytolysis) של המפל המשלים ציינו כי 4 דקות זמן הדגירה מספיקה עבור C3b/iC3b opsonization של האדם כדוריות דם אדומות. מבחני מקבילים, C3b/iC3b ציפוי של כדוריות דם אדומות האנושי יכול להיות מוערך בקלות לאחר החלת תערובת של אנטי-העכבר C3b, fluorescently שכותרתו נוגדנים משניים. במקרה זה, צעד שטיפת נדרש להסיר נוגדנים פלורסנט לא מאוגד. למרות הצעד שטיפת כרוך תא sedimentaion על ידי צנטריפוגה, המקדם התלכדות, opsonization מצליח להיות מוערך בקלות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. המשלים קולטן בתיווך phagocytosis יכול לדימות מאת IgG גם החלה- / iC3b-opsonized דם אדום אדם תאים NOTAM או Fcer1g- / - מקרופאגים או על ידי החדרת IgM- / iC3b-opsonized דם אדום אדם תאים מקרופאגים פראי-סוג. IgM-opsonized תאי דם לא יזהו את ITAM המכילים FcγRs (FcγRI, FcγRIII ו- FcγRIV) הדרושה של phagocytosis של חלקיקים IgG-opsonized22.
לשיקוף phagocytic אירועים, קרום הפלזמה של מקרופאגים יכול להיקרא עם נוגדן anti-F4/80 מצומדת fluorophore ניאון ירוק, אשר משמש גם כסמן ספציפי של העכבר מקרופאגים. כדוריות דם אדומות אנושי שיכול להתבצע אדום פלורסנט על ידי דגירה עם סמן קרום פלזמה פלורסנט כתום/אדום, כפי שפורט לעיל. סמן קרום פלזמה lipophilic זה מונע פוטנציאלית השפעות תוויות נוגדן מבוססי מבלבלים. אדום פלואורסצנטי האנושי כדוריות דם אדומות, עם או בלי opsonization, יכול pipetted ישירות לתוך ערוץ 100 µL של שקופית ערוץ ו 3D בצילום מואץ עם תמונה דרך 60 X / 1.49 שמן טבילה (או דומה) המטרה עדשה המבוצעת באמצעות של 488 ננומטר וקווים 561 ננומטר לייזר , בהתאמה, של ספינינג דיסק המיקרוסקופ קונאפוקלית (או דומה). היא מפתה כדי למטב את המערכת עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה, אך רכישת Z חוזרות ונשנות-מעל 16 דקות במחסן או אז עלול לגרום ניכר photobleaching ו- phototoxicity. בחרנו להשתמש binning כדי לקדם את יחס אות לרעש טוב, לאפשר הפחתות עירור העוצמה ו/או פעמים חשיפה, אך כתוצאה מכך רזולוציה אופטית 2 x 2. בנוסף, כדי להפחית את phototoxicity, אנו מוסיפים מנבלות של מינים חמצן תגובתי למדיום. מחקרים עתידיים, מבחני יכול להיות שונה כדי תמונה של phagocytosis תאי דם אדומים מוות אנושי. יישום Ca2 + ionophore, כגון A23187, יכול לשמש כדי לגרום phosphatidylserine הוצאתו23, "לאכול אותי" אות, סימן ההיכר של אפופטוזיס מוקדם24,25.

עשרים שנה לפני התצפית של Metchnikoff של תאי מזנכימה phagocytic כוכב ים הזחלים, בשנת 1882, ופיתוח עוקבות של התיאוריה שלו של phagocytosis1, תיאר ארנסט הקל, בשנת 1862, היבלעות של חלקיקי צבע קשי תמס דם תאים של תטיס fimbris (טתיס fimbria), מין של ים טורף הסלאג (ארנסט הקל. למות Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; דרוק und גיאורג פון הרסוביץ ריימר, ברלין, 1862). הוא תיאר באופן מפורש בליטות הקרום עוטף את החלקיקים, אשר היו לאחר מכן לתוך הציטופלסמה, שהצטברו סביב גרעין התא. יותר מ-100 שנה מאוחר יותר, מחקר חלוצי על ידי קפלן הציע כי היו לפחות שני מנגנונים נפרדים מורפולוגית של phagocytosis2. קפלן הראה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים זה העכבר הצפק מקרופאגים בלע כבשים opsonized-איג תא דם אדום באמצעות סיומות קרום דק אשר הגיע בחוזקה אפוף החלקיק, בתחילה והוליד דמוי ספל מבנה. גביע phagocytic היווצרות נדרש פלמור אקטין מאז זה היה יושב על ידי הרעלן פטרייתי חדיר תא cytochalasin B, חוסמות את הדינמיקה אקטין3. לעומת זאת, תאי דם אדומים כבשים opsonized עם המשלים הופיע לשקוע ישירות מקרופאג ללא הדור של קרום הרחבות, למרות, כמה תמונות, קפלים של קרום ניתן לראות את vacinity מיידית של החלקיקים טובעת. בניגוד למערך גביע phagocytic, המשלים קולטן בתיווך נקלט היה insenstive טיפול cytochalasin ב'2. בניסויים מתוארת על ידי קפלן, opsonization המשלים בוצע על ידי המקננת אימונוגלובולינים ז (IgM) שכותרתו כבשים כדוריות דם אדומות עם סרום של עכברים המשלים חשוכת-C5, אשר עוקף המוליזה על ידי הטרמינל המשלים תלויי-C5 משלימים מורכבים.
שני מצבים של phagocytosis, היווצרות גביע phagocytic, דשן, המזוהה על-ידי קפלן הפכו דעת ויצר שדה4,5,6,7,8,9 . עם זאת, התמונות ברזולוציה גבוהה במיוחד בשימוש המחקר המקורי על ידי קפלן2, כמו גם מחקר דומה על ידי וייה רומא-לי קאס. et al. 10, מספקים רק תמונות של אירועים phagocytic. בסקירה האחרונה, Rougerie. et al. 11 הדגיש כי הבדלים מורפולוגיים בין FcγR ו- CR-בתיווך phagocytosis הבהרה ו, יתר על כן, ממברנה קפלים נצפו במהלך המשלים חלקיקים קולטן בתיווך ספיגת2. הדמיה לחיות תאים של יחיד אירועים phagocytic הנמשכים מן ללכוד חלקיקים כדי הפנמה, בשילוב עם גנטית שונה עכבר מודלים, יכולה לשפר באופן ניכר את ההבנה שלנו על איך phagocytes ללכוד לבלוע חלקיקים. גישה אחת יכול להיות לשימוש מיקרוסקופ כוח אטומי מהר (AFM) אשר מאפשר הדמיה טופוגרפית ברזולוציה גבוהה במיוחד (10 – 20 ננומטר) של תאים חיים. לאחרונה, מערכת מהירה AFM12 פותחה, אשר מתאימה הדמיה משטחים תא במהירות עם רעש נמוכה. טכניקה זו יש את היתרון הזה פרמטרים ברזולוציה גבוהה, טופוגרפית, מכני של חיים תאים ניתן למדוד במרווחי זמן קצרים (שניות), בניגוד סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר מחייבת את הקיבעון וייבוש נקודה קריטית של תאים. גישה נוספת היא זמן לשגות 3D מיקרוסקופיה קונפוקלית, אשר זמין נרחב, למרות phototoxicity ולהלבנה הם הגבלת גורמים במהלך הקלטות. גישה זו הוא תכליתי מאוד, מאפשרת אופטי חלוקתה עם רזולוציה מרחבית גבוהה ומאפשר גמישות יוצאת דופן תיוג עם מגוון מדהים של הגששים פלורסנט, כולל חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית. כאן נתאר מבחני phagocytosis באמצעות דיסק מסתובב זמן לשגות קונפוקלית לאפשר רזולוציה גבוהה ייתכן של אירועים phagocytic בתיווך קולטן ספציפי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">24-G plastic catheter</td>
			<td style="width:257px;">B Braun Mesungen AG, Germany</td>
			<td style="width:119px;">4254503-01</td>
			<td style="width:167px;">Used for peritoneal lavage</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hank&#8217;s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Used for peritoneal lavage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">14 ml polypropylene round bottom tubes</td>
			<td style="width:257px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td>Used to collect peritoneal cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R7388</td>
			<td>Basis medium for assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10082139</td>
			<td>Used as supplement for RPMI 1640 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">100x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Used as supplement for RPMI 1640 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fibronectin-coated &#181;-Slide&#160;I chambers</td>
			<td style="width:257px;">Ibidi, Martinsried, Germany</td>
			<td style="width:119px;">80102</td>
			<td>Channel slides used for assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">&#181;-Slide (anodized aluminum) rack</td>
			<td style="width:257px;">Ibidi, Martinsried, Germany</td>
			<td style="width:119px;">80003</td>
			<td>Autoclavable stackable rack for channel slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">RPMI 1640 medium containing bicarbonate</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8758</td>
			<td>Medium for overnight culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">N-(2-mercaptopropionyl)glycine</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6635</td>
			<td>Scavenger of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:508px;">Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MF48020</td>
			<td>Mouse macrophage marker and plasma membrane label</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">CellMask Orange</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10045</td>
			<td>Red fluorescent plasma membrane stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Succinimidyl ester of pHrodo</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36600</td>
			<td>Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA1-20893</td>
			<td>Used to opsonize human red blood cells with IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Alexa Fluor 594-conjugated&#160; goat anti-mouse (secondary) IgG antibody</td>
			<td style="width:257px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">Ab150116</td>
			<td>Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody</td>
			<td style="width:257px;">Hycult Biotech</td>
			<td style="width:119px;">HM1065</td>
			<td>Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11006</td>
			<td>Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Calcein/AM</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C3100MP</td>
			<td>Used to load human red blood cells with Calcein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon Eclipse Ti inverse microscope</td>
			<td style="width:257px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSU-X1 spinning disk scanner</td>
			<td style="width:257px;">Yokogawa Electric Corporation, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nipkow spinning disk unit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:508px;">14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera</td>
			<td style="width:257px;">Hamamatsu Photonics Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">488 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">561 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages

Phagocytosis ממלא תפקיד מרכזי בהגנה המארח, כמו גם רקמות פיתוח ותחזוקה, כרוכה rearrangements מהירה, קולטן בתיווך של שלד התא אקטין כדי ללכוד, אופפים לבלוע חלקיקים גדולים. למרות קולטנים phagocytic איתות המסלולים במורד הזרם, effectors, כגון GTPases רו, זוהו, שיפוץ cytoskeletal דינמי של אירועים ספציפיים קולטן בתיווך phagocytic נותרו בלתי ברורים. לפני ארבעה עשורים, שני מנגנונים נפרדים של phagocytosis, ומעוררות קולטן Fcγ (FcγR) - וגם המשלים קולטן (CR) - מתווכת phagocytosis, אותרו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה. איגוד של אימונוגלובולין G (IgG)-חלקיקי opsonized FcγRs מפעיל את חדירת קרום דק הרחבות, המהווים בתחילה כוס phagocytic כביכול סביב החלקיק לפני זה לחלוטין הופך סגור, כשנעלמת התא. לעומת זאת, המשלים opsonized חלקיקים מופיעים לשקוע פגוציט בעקבות איגוד כהשלמה קולטנים. שני מצבים אלה של phagocytosis, היווצרות גביע phagocytic שוקע בחול, הפכו וותיקה בספרות. עם זאת, ההבחנות בין שני המצבים יש מיטשטשים בדו חות phagocytosis קולטן בתיווך את המשלים עלול לגרום בליטות ממברנה שונים. עם הזמינות של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה, מבחני phagocytosis נדרשים לאפשר חזותיים בזמן אמת 3D (תלת-ממדי) של קולטני phagocytic כמה ספציפית התחלקות ספיגת של חלקיקים בודדים. יותר נפוץ גישות המחקר של phagocytosis, כגון מבחני מובילים, להחמיץ את ההזדמנות כדי להבין מה קורה בבית הממשק של חלקיקים phagocytes. כאן נתאר מבחני phagocytic, תוך שימוש בצילום מואץ ספינינג דיסק מיקרוסקופיה קונפוקלית, לאפשר הדמיה תלת-ממדית של אירועים phagocytic יחיד. בנוסף, אנו מתארים את מבחני חד משמעית תמונה קולטן Fcγ - או משלימים phagocytosis קולטן בתיווך.

תרשים סכימטי של השקופית ערוץ המשמש עבור ההדמיה של phagocytosis ספינינג זמן לשגות מיקרוסקופיה קונפוקלית מוצג באיור1. תאי דם אדומים (hRBCs) אנושי מוכתמים דה מרקר קרום פלזמה ניאון אדום כתום CellMask, בעוד העכבר מבודד תושב מקרופאגים הצפק (Ms) מסומנים בתווית ירוקה פלורסנט מצומדת אלקסה עבור חיל הים 488 אנטי-F4/80 נוגדנים ( איור 2), אשר משמש כסמן ספציפי של העכבר מקרופאגים והן כתווית קרום פלזמה. כדוריות דם אדומות האנושי יכול opsonized עם העכבר IgG (mIgG), או עכבר IgM (mIgM), על ידי המקננת התאים עם נוגדן anti-CD235a IgG (או IgM) (CD235a, הידוע גם glycophorin A, הוא חלבון הביעו במפורש על האדם כדוריות דם אדומות). זמן לשגות הדמיה ממוחשבת של מקרופאגים ניאון ירוק הציגה עם אדום פלואורסצנטי האנושי תאי דם אדומים מאפשר הדמיה של חלקיק בודד phagocytic אירועים (איור 2). תצפית קרובה של אירועים phagocytic יחיד מאפשרת פרטים של בליעה מאפשרת ללכוד חלקיקים. לדוגמה, לכידתו של mIgG opsonized האנושי תאי הדם האדומים על ידי filopodium macrophage, הקרנה דק, כמו אצבע, יכול להיות שנצפו (איור 3A; ראה גם Horsthemke. et al. 15). יתר על כן, סחיטת תא דם אדום אנושי במהלך היווצרות גביע phagocytic יכול להיות שנצפו (איור 3 א). על החדרת סרום העכבר טרי, mIgG-opsonized, או mIgM opsonized, אנושי כדוריות דם אדומות לעורר את המפל המשלים הקלאסית, המגיע לשיאו היווצרות קומפלקס התקפה ממברנה היילוד. קינטיקה של המוליזה בתיווך המשלים נמדד על ידי הדמיה תאים שהוכתמו כפול עם כתום CellMask ו- Calcein. ירוק ניאון Calcein cytosolic הוא שוחרר במהירות מתאי במהלך המוליזה (איור 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig1.jpg"> איור 1: טיפול של שקופיות ערוץ מצופים fibronectin. (א) א ערוץ שקופית מורכב שני מאגרים המחוברים באמצעות ערוץ בעל הממדים 50 מ מ x 5 מ מ 0.4 מ מ. ערוץ שקופיות הן בתחילה שמולאו מראש על-ידי החלת בינוני 1-2 מ לאחד שני המאגרים הטיית השקופית. כמוסות (B) ניתן להניח על המאגרים לפני הדגירה. הפקקים יכול לשמש בנוחות לשאוב החוצה בועות אוויר לא רצויים לפני זריעה הערוץ עם תאים. (ג) האוויר הבועה נטולת 100 µL ערוץ יכול להיות מלא על-ידי ישירות pipetting בינוני לתוך הפה של ערוץ. שלב זה נועד, לדוגמה, מקרופאגים זרע לתוך שקופית או כדי להוסיף gfluorophore (ירוק ניאון)-מצומדת נוגדן anti-F4/80, אשר משמש תווית ממברנה, כמו גם סמן העכבר מקרופאג. (ד) לאחר pipetting חלקיקים, כגון opsonized האנושי כדוריות דם אדומות, לתוך ערוץ נזרע עם fluorescently צבעונית מקרופאגים, השקופית ניתן להניח על השלב של מיקרוסקופ הפוכה, ספינינג זמן לשגות דיסק קונפוקלית וניתן לבצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig2.jpg"> איור 2: זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של phagocytosis. תרשים סכמטי (A) מציג את opsonization של קרום פלזמה צבעונית (פלורסנט אדום)-תאי דם אדומים-אנושי-(hRBCs) עם העכבר (ז) אנטי-CD235a אימונוגלובולין G (mIgG) נוגדנים, מצגת של hRBCs עם תוויות על העכבר מקרופאגים (Ms), מתויג (ירוק פלורסנט) עם ירוק נוגדן anti-F4/80 פלורסנט fluorophore מצומדת. (B) זמן לשגות תמונות (XZ תצוגות), מתקבל על ידי ספינינג קונפוקלית דיסק, מציג היווצרות גביע phagocytic, בליעה של hRBCs mIgG-opsonized. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) 3D שחזורים מציג מקרופאגים בליעת hRBCs mIgG-opsonized. התואמים XZ (עבור 3 של timepoints) מוצגים ברשת ב' spacings מייצגים 5.07 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig3.jpg"> איור 3: מידיהם של חלקיק filopodium. תמונות בצילום מואץ, שהושג על ידי סחרור קונפוקלית דיסק, מציג macrophage העכבר לכידה של העכבר אימונוגלובולין G (mIgG)-opsonized האנושי תא דם אדום (hRBC) דרך filopodium (חיצים בחלונית העליונה), תחזית דמוי אצבע. שימו לב כי תא דם אדום מאבד את crenations שלה מוקדם במהלך היווצרות גביע phagocytic. יתר על כן, בגביע phagocytic מופיע לסחוט תא דם אדום מעטפת (המסומנים על ידי חצים בחלונית התחתונה). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages at JoVE.com

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

המטרה הכוללת של מאמר זה, היא להכין מקרופאגים ותאי דם אדומים אופוסוניזציה להדמיה של Phagocytosis על ידי מיקרוסקופיה זמן תלת מימדי לשגות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד phagocytes ללכוד ולבלוע חלקיקים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של ספיגת חלקיקים בזמן אמת, שלא כמו במבחן נקודת קצה מסורתי יותר המאפשר רק את ההערכה אם או לא איך, חלקיק כבר לבלוע.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק עד שהם מתרגלים להליכי בידוד התא. היה לנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר הבנו את היתרונות של ספינינג מיקרוסקופ קונפוקל זה עבור 3D זמן לשגות הדמיה של Phagocytosis. כדי לבודד מקרופאגים הצפיים, מניחים קטטר פלסטיק 24 מד לתוך הצפאי של עכבר בן שלושה עד ארבעה חודשים, ולהשתמש מזרק פלסטיק חמישה מיליליטר כדי לשטוף את החלל פעמיים עם 4.5 מיליליטר של HBSS קר כקרח ללא סידן ומגנזיום לכל lavage.העברת ההשעיה שאפתן לתוך צינור 14 מיליליטר פוליפרופילן עגול התחתון כפי שהוא נאסף. כאשר שתי הדגימות נקצרו, צנטריפוגה שאפה, ו resuspend התאים הצפק במיליליטר אחד של RPMI חינם ביקרבונט מלא 1640 בינוני כדי להשיג בערך שש פעמים 10 לתאים השישי לריכוז מיליליטר. לאחר מכן, כדי למלא מראש שקופיות להוסיף מיליליטר אחד של HEPES מלא בתוספת בינונית למאגר אחד של שקופית ערוץ מצופה fibronectin, ולהטות את השקופית כדי לאפשר את המדיום להיות שאפתן ממאגר במורד הזרם.כדי להסיר בועות אוויר לא רצויות, יש להוסיף 1-2 מיליליטר של מדיום טרי לאחד משני המאגרים, ולהחיל בחוזקה מכסה מאגר. לאחר מכן להחיל לחץ אגודל קצבי על הכובע כדי לשאוב כל אוויר מתוך השקופית, הטיית השקופית לפי הצורך. כאשר כל האוויר גורש, להטות את השקופית לכיוון המדיום הלא מנוצל המכיל מאגר, ולהסיר את הכובע, כדי למנוע אוויר נשאב בחזרה לתוך התעלה.עכשיו פיפטה פתרון התא כמה פעמים כדי להפחית את הגושים, ולהוסיף 100 microliters של התאים לערוץ אחד של השקופית עבור דגירה של שעתיים בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס בהעדר פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה להחליף את HEPES המכיל בינוני בכל שקופית עם מדיום שלם בתוספת ביקרבונט כפי שהודגם רק. ואז למקם את התאים באינקובטור לח 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני לתרבות הלילה שלהם.למחרת בבוקר להעביר מיליליטר אחד של דם תורם בריא שהושג טרי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן עגול שני מיליליטר עגול. ואז צנטריפוגה הדגימה. הסר את הפלזמה ואת מעיל באפי המכיל על טבעי.ולהעביר בזהירות 100 microliters של תאי הדם האדומים מוצצים לתוך צינור mircocentrifuge שני מיליליטר המכיל 100 microliters של מדיום HEPES מלא בתוספת. סמן את הצינור 1:1 ולהעביר ארבעה microliters של תאי הדם האדומים מדולל לתוך צינור microcentrifuge שני מיליליטר חדש המכיל שני מיליליטר של HEPES מלא בתוספת בינוני. ואז לתייג את הצינור הזה 4:2000 ולמקום שני צינורות מדגם תא דם אדום מדולל על קרח.כדי לתייג את המקרופגים הפניוניים, החלף את מדיום ביקרבונט בכל שקופית ערוץ עם מדיומים שלמים בתוספת HEPES. לאחר מכן להטות את השקופית כדי לאפשר 100 microliters של מקרופאג עכבר מתויג פלואורסצנטי נוגדן ספציפי של עניין להתווסף טיפה חכם לפתיחת ערוץ 100 microliter של השקופית. שאפו את המדיום הזורם לתוך המאגר במורד הזרם, והדגירה את התאים במשך 20 דקות בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס בהעדר פחמן דו חמצני.בעוד התאים צפק מסומנים בעדינות לערבב 4:2000 תאי דם אדומים מדגמים ולהעביר 400 microliters של התאים לתוך צינור microcentrifuge שני מיליליטר חדש, בבלוק אלומיניום מחומם בתוך מכסה המנוע לזרימת למינאר במשך כחמש עד שמונה דקות. כאשר התאים התחממו ל 37 מעלות צלזיוס לערבב 0.4 microliters של כתם קרום פלזמה פלואורסצנטי אדום מתאים עם התאים. ואז למקם את התאים בחזרה בבלוק החום.לאחר חמש דקות לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.6 מיליליטר של HEPES טרי בתוספת בינוני מלא צנטריפוגה. סובב את הצינור כדי לזהות את גלולת תאי הדם האדומים. באמצעות קצה פיפט אחד עד 1.5 מיליליטר בזהירות להסיר את supernatant בשני כרכים מבלי להפריע גלולה לערבב 2000 microliters של HEPES טרי בתוספת מדיום שלם עם התאים.צנטריפוגה ולהשעות מחדש את גלולה ב 400 microliters של בינוני. ואז לתייג את הצינור PMS עבור כתם קרום פלזמה. בסוף 20 דקות דגירה תיוג תא הצפי לשטוף את השקופית עם מיליליטר אחד של HEPES שלם טרי בתוספת בינוני.כדי opsonize תאי הדם האדומים להוסיף microliter אחד של העכבר IGG2B נוגדן אנטי אנושי CD235A לצינור מדגם PMS. לאחר שמונה דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב פעם בדקה העברה 100 microliters של קרום פלזמה מוכתם IGG תאי דם אדומים אופוסונים אנושיים מקרופאגים צפי המכיל שקופית ערוץ. ברגע שתאי הדם האדומים האנושיים נוספו, עלו על השקופית במיקרוסקופ קונפוקל של דיסק מסתובב.עם אינקובטור הבמה מוגדר 37 מעלות צלזיוס ומיד להתחיל לדמיין את התאים. זמן לשגות 3D-הדמיה של מקרופאגים פלואורסצנטיים ירוקים הציג עם תאי דם אדומים פלואורסצנטיים אנושיים מאפשר הדמיה של אירועים phagocytic חלקיקים בודדים. לדוגמה, ניתן לראות את לכידתו של עכבר IGG אופוסוניזציה תא דם אדום אנושי על ידי filopodium מקרופאג'.כמו גם, סחיטה של תא דם אדום אנושי במהלך היווצרות phagocytic. לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך להבין היטב כיצד לבודד מקרופאגים צפיוניים תושב העכבר, תאים המסומן באופן פלואורסצנטי, וחלקיקים opsonized.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine לימפוציטים תיוג ידי<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור<em&gt; In vivo</em&gt; סחר Cell על ידי PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

השרשה וניטור על ידי PET/CT של מודל אורתוטופית של מזותליומה של האדם בעכברים האטורי

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...