Name: time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages
Uploaded: 2018-10-19T13:00:00
Duration: 7 min 24 s
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G., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;phagocytic+synapse&amp;#34;+and+clearance+of+apoptotic+cells.">The &amp;#34;phagocytic synapse&amp;#34; and clearance of apoptotic cells.</a> Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).</li><li>Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+phospholipid+scramblases+in+apoptosis:+An+overview.">The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview.</a> Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

phagocytosis परख के विशाल बहुमत, विशेष रूप से अंत बिंदु और उच्च प्रवाह परख, कैसे कणों वास्तव में कब्जा कर रहे हैं, के दृश्य प्रदान नहीं कर रहे है और लिफाफे में घूस लिया । Munthe द्वारा अग्रणी अध्ययन-Kaas एट अल । 10 और 1970 के दशक में2 कापलान सुझाव दिया है कि हड़ताली अलग cytoskeletal पुनर्गठन आईजीजी के phagocytosis में शामिल-opsonized बनाम पूरक opsonized कणों (भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं) थे । यहां हम phagocytosis का वर्णन परख कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी जो उच्च संकल्प, वास्तविक समय एकल phagocytic घटनाओं के इमेजिंग की अनुमति का उपयोग कर । हमारे मॉडल phagocyte माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज है, जो कम से निपटने के साथ अलग किया जा सकता है, और हम कणों के रूप में हौसले से पृथक मानव लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करें । हालांकि, phagocytosis परख अंय फ़ैगोसाइट के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल, माउस मैक्रोफेज सेल लाइंस, मानव monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज या मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल । मानव फ़ैगोसाइट या माउस न्यूट्रोफिल के मामले में, वैकल्पिक फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी की आवश्यकता होगी, जैसे फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी CD14 एंटीबॉडी (मानव monocytes/मैक्रोफेज)16 या विरोधी जीआर-1 (6G) एंटीबॉडी (माउस न्यूट्रोफिल) ।
Unopsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं, पारंपरिक रूप से इस्तेमाल किया भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं की तरह, इस अर्थ है कि इन कोशिकाओं को नहीं कर रहे हैं में निष्क्रिय कर रहे हैं (या, कम, बहुत शायद ही कभी) माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज द्वारा घूस. यह सुनिश्चित करता है, polystyrene मोतियों के विपरीत, कम पृष्ठभूमि गतिविधि. मानव लाल रक्त कोशिकाओं को आसानी से माउस आईजीजी या मोनोक्लोनल के खिलाफ आईजीएम CD235a एंटीबॉडी का उपयोग इम्युनोग्लोबुलिन के साथ opsonized जा सकता है (glycophorin ए), मानव एरिथ्रोसाइट्स के एक विशिष्ट मार्कर (लाल रक्त कोशिकाओं) और erythroid के अग्रदूतों17, 18. समानांतर परख में, फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी माउस आईजीजी या आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी opsonization पुष्टि करने के लिए लागू किया जा सकता है । आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी वर्गों hemagglutinins, पदार्थ (एंटीबॉडी) कि लाल रक्त कोशिकाओं के कारण agglutinate हैं । समूहन से बचने के लिए, हम आवर्तक रूप CD235a एंटीबॉडी के साथ 8 मिनट की मशीन अवधि के दौरान सेल निलंबन मिश्रण, और फिर हम मिश्रित निलंबन सीधे एक मैक्रोफेज-युक्त चैनल स्लाइड (fibronectin-लेपित स्लाइड) एक धोने कदम के बिना जोड़ने . धो चरणों केंद्रापसारक द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं के अवसादन शामिल है, जो दृढ़ता से समूहन को बढ़ावा देता है । opsonizing मानव लाल रक्त कोशिकाओं से पहले, हम एक lipophilic नारंगी/लाल फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्लाज्मा झिल्ली लेबल । इस जांच चमकीले समय की शुरुआत में फ्लोरोसेंट है चूक रिकॉर्डिंग, लेकिन संकेत धीरे से फ़ेड, शायद मोटे तौर पर19photobleaching के कारण । इसके अलावा, मैक्रोफेज और स्लाइड के fibronectin कोटिंग कमजोर नारंगी/रिकॉर्डिंग के दौरान लाल फ्लोरोसेंट हो सकता है । यह समस्या संभवतः लेबलिंग के बाद मानव लाल रक्त कोशिकाओं के अपर्याप्त धोने के कारण है । इसके बजाय एक lipophilic फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली मार्कर का उपयोग कर के, मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक पीएच के साथ लेबल किया जा सकता है संवेदनशील rhodamine अपने अमीन प्रतिक्रियाशील succinimidyl एस्टर15,20का उपयोग कर व्युत्पंन । यह कम पीएच15,20के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है के बाद से phagosome परिपक्वता के दृश्य की अनुमति का लाभ है, लेकिन इस दृष्टिकोण नुकसान है कि प्रतिक्रियाशील एस्टर की तैयारी वर्तमान में कर रहे है महंगा और अस्थिर जलीय माध्यम में पुनर्गठन के बाद ।
आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं FcγRs, जो मैक्रोफेज21 या नोटं-/-(Fcer1g नॉकआउट) चूहों से अलग पेरिटोनियल Fcer1g का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है के माध्यम से घूस ले रहे हैं । नोटं मैक्रोफेज बाँध आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं, लेकिन कमी आईटम (immunoreceptor tyrosine-आधारित सक्रियण आकृति)-मध्यस्थता संकेत phagocytosis प्रेरित करने के लिए आवश्यक है, जबकि Fcer1g नॉकआउट मैक्रोफेज सतह FcγRs व्यक्त नहीं करते. आईजीजी- या आईजीएम-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को इसके अतिरिक्त C3b के साथ opsonized जा सकता है (जो iC3b से सट जाता है) एक पूरक C5 नल माउस (जंगली-प्रकार सीरम कारण hemolysis) से ताजा अलग सीरम के साथ कोशिकाओं को मशीन द्वारा । opsonins आईजीजी और आईजीएम शास्त्रीय झरना, जो pores के गठन की ओर जाता है पूरक (झिल्ली हमला परिसरों) और सेल lysis सक्रिय करें । में चूहों कमी पूरक c5, झरना पूरक के लिए C3 दरार के पूरक हैं, लेकिन C5 convertase टर्मिनल मार्ग उत्प्रेरित करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट का अभाव है. हम सरल परख विकसित करने के लिए कैनेटीक्स झरना के पूरक उपाय । संक्षेप में, मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक लाल फ्लोरोसेंट, प्लाज्मा झिल्ली मार्कर और हरी फ्लोरोसेंट, cytosolic fluorophore के साथ सह-लेबल किया जा सकता है । झिल्ली हमला जटिल के गठन पर, C5-C9 घटकों के पूरक द्वारा गठित, cytosolic fluorophore तेजी से (सेकंड में) cytosol से खो दिया है । अंत के दृश्य-प्रभाव (cytolysis) समारोह के पूरक झरना का संकेत दिया है कि 4 मिनट की मशीन समय C3b/iC3b opsonization मानव लाल रक्त कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है । समानांतर परख में, C3b/मानव लाल रक्त कोशिकाओं के iC3b कोटिंग विरोधी माउस C3b और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल का एक मिश्रण लागू करने के बाद आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है । इस मामले में, एक धोने कदम असीम फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को दूर करने के लिए आवश्यक है । हालांकि धोने कदम sedimentaion द्वारा सेल शामिल है, जो समूहन को बढ़ावा देता है, सफल opsonization आसानी से फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता phagocytosis या तो आवेदन आईजीजी-/iC3b-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को नोटं या Fcer1g-/मैक्रोफेज या आईजीएम-/iC3b-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं जंगली-प्रकार मैक्रोफेज करने के लिए शुरू करने से imaged जा सकता है । आईजीएम-opsonized रक्त कोशिकाएँ FcγRIII-FcγRIV कणों की phagocytosis के लिए आवश्यक आईटम-युक्त FcγRs (FcγRI, आईजीजी और opsonized) द्वारा मान्यता प्राप्त नहींहैं.
छवि phagocytic घटनाओं के लिए, मैक्रोफेज के प्लाज्मा झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट fluorophore संयुग्मित विरोधी F4/80 एंटीबॉडी, जो भी माउस मैक्रोफेज के एक विशिष्ट मार्कर के रूप में कार्य करता है के साथ लेबल किया जा सकता है । मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक नारंगी/लाल फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली मार्कर के साथ मशीन द्वारा लाल फ्लोरोसेंट गाया जा सकता है, के रूप में ऊपर चर्चा की । यह lipophilic प्लाज्मा झिल्ली मार्कर एंटीबॉडी आधारित लेबल के संभावित निराधार प्रभाव से बचा जाता है । लाल फ्लोरोसेंट मानव लाल रक्त कोशिकाओं के साथ या बिना opsonization, सीधे एक चैनल स्लाइड के १०० µ एल चैनल में pipetted जा सकता है और 3 डी समय-एक 60X/1.49 तेल विसर्जन (या इसी तरह) उद्देश्य लेंस के माध्यम से imaged चूक ४८८ एनएम और ५६१ एनएम लेजर लाइनों का उपयोग कर प्रदर्शन , क्रमशः एक कताई डिस्क की (या इसी तरह) माइक्रोस्कोप । यह उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए प्रणाली का अनुकूलन करने के लिए आकर्षक है, लेकिन 16 मिनट से अधिक दोहराया Z-पोट या तो काफी photobleaching और phototoxicity कारण हो सकता है के अधिग्रहण । हम अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात को बढ़ावा देने और उत्तेजना तीव्रता और/या जोखिम समय में कटौती की अनुमति 2x2 बिन्नी का उपयोग करने के लिए चुना है, लेकिन ऑप्टिकल संकल्प की कीमत पर । इसके अलावा, phototoxicity को कम करने के लिए, हम मध्यम करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में से एक मेहतर जोड़ें । भविष्य के अध्ययनों में, परख अपोप्तोटिक मानव लाल रक्त कोशिकाओं के phagocytosis छवि को संशोधित किया जा सकता है । इस तरह के A23187 के रूप में एक Ca2 + ionophore, के आवेदन, phosphatidylserine externalization23प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, एक "मुझे खाओ" संकेत और जल्दी24,25की पहचान apoptosis.

तारामछली लार्वा में phagocytic mesenchyme कोशिकाओं के Metchnikoff अवलोकन से पहले बीस साल, १८८२ में, और1phagocytosis के अपने सिद्धांत के बाद विकास, अर्नेस्ट Haeckel, १८६२ में वर्णित, रक्त द्वारा अघुलनशील डाई कणों की समाई Thetis fimbris (टेथ्स fimbria), शिकारी सागर स्लग (अर्नेस्ट Haeckel की एक प्रजाति की कोशिकाओं । मर Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag वॉन Georg Reimer, बर्लिन, १८६२). वह स्पष्ट रूप से झिल्ली का पुलिंदा है, जो बाद में कोशिका द्रव्य में ले जाया गया था और कोशिका नाभिक के आसपास जमा ढंक । अधिक से अधिक १०० साल बाद, कापलान द्वारा एक अग्रणी अध्ययन का सुझाव दिया है कि वहां थे phagocytosis2में से कम दो आकृति विज्ञान अलग तंत्र । कापलान इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के माध्यम से पता चला है कि माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज एक आईजीजी-opsonized भेड़ लाल रक्त पतली झिल्ली एक्सटेंशन जो ऊपर तक पहुंच और कसकर कण लिफाफा, शुरू में एक कप को जंम देने की तरह का उपयोग कर घूस दिया संरचना. Phagocytic कप गठन आवश्यक actin बहुलकीकरण चूंकि यह कोशिका-पारगंय फफूंद विष cytochalasin बी द्वारा निष्प्रभाव था, actin गतिकी3को ब्लॉक करने के लिए जाना जाता है । इसके विपरीत, पूरक के साथ भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं opsonized झिल्ली एक्सटेंशन की पीढ़ी के बिना मैक्रोफेज में सीधे सिंक करने के लिए दिखाई दिया, हालांकि, कुछ छवियों में, झिल्ली व्याकुलता डूब कणों के तत्काल vacinity में देखा जा सकता है । phagocytic कप के गठन के विपरीत, रिसेप्टर पूरक मध्यस्थता में डूब cytochalasin बी उपचार2के लिए insenstive था. कापलान द्वारा वर्णित प्रयोगों में, पूरक opsonization मशीन द्वारा किया गया था immunoglobulin एम (आईजीएम) के लेबल वाली भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं से सीरम के साथ पूरक c5-की कमी चूहों, जो hemolysis के पूरक द्वारा c5-निर्भर टर्मिनल जटिल पूरक ।
phagocytosis के दो तरीके, phagocytic कप के गठन और डूब में, कापलान द्वारा की पहचान की राय क्षेत्र में स्थापित हो गए है4,5,6,7,8,9 . हालांकि, अल्ट्रा उच्च संकल्प छवियों कापलान2द्वारा मूल अध्ययन में इस्तेमाल किया, साथ ही Munthe द्वारा एक समान अध्ययन-Kaas एट अल । 10, केवल phagocytic घटनाओं के स्नैपशॉट प्रदान करते हैं । हाल ही में एक समीक्षा में, Rougerie एट अल । 11 बल दिया कि FcγR-और सीआर-मध्यस्थता phagocytosis के बीच मतभेद रूपात्मक स्पष्ट किया जाना है, और, इसके अलावा, झिल्ली व्याकुलता पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता कण2के दौरान मनाया गया है. जीना-एकल phagocytic कण पर कब्जा से फैले internalization की घटनाओं के सेल इमेजिंग, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडलों के साथ संयुक्त, बहुत कैसे फ़ैगोसाइट कब्जा और निगल कणों की हमारी समझ में सुधार कर सकता है । एक दृष्टिकोण के लिए तेजी से परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) जो अल्ट्रा उच्च संकल्प (10-20 एनएम) जीवित कोशिकाओं के स्थलाकृतिक इमेजिंग की अनुमति देता है का उपयोग हो सकता है । हाल ही में, एक फास्ट AFM प्रणाली12 विकसित किया गया है, जो इमेजिंग सेल कम शोर के साथ तेजी से सतहों के लिए उपयुक्त है । इस तकनीक का लाभ यह है कि उच्च संकल्प, स्थलाकृतिक और यांत्रिक मानकों के रहने वाले कोशिकाओं को कम अंतराल पर मापा जा सकता है (सेकंड), स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के विपरीत, जो आवश्यक निर्धारण और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की कक्षों. हालांकि phototoxicity और ब्लीचिंग कारकों रिकॉर्डिंग के दौरान सीमित कर रहे हैं एक और दृष्टिकोण, समय चूक 3 डी फोकल माइक्रोस्कोपी है, जो व्यापक रूप से उपलब्ध है. इस दृष्टिकोण अत्यधिक बहुमुखी है और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ऑप्टिकल अनुभाग की अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट जांच की एक चौंका देने वाला रेंज के साथ लेबलिंग में असाधारण लचीलापन सक्षम बनाता है, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन सहित । यहां हम समय का उपयोग कर phagocytosis परख का वर्णन-चूक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी कि अनुमति उच्च विशिष्ट रिसेप्टर के spatiotemporal संकल्प-phagocytic घटनाओं मध्यस्थता ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">24-G plastic catheter</td>
			<td style="width:257px;">B Braun Mesungen AG, Germany</td>
			<td style="width:119px;">4254503-01</td>
			<td style="width:167px;">Used for peritoneal lavage</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hank&#8217;s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Used for peritoneal lavage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">14 ml polypropylene round bottom tubes</td>
			<td style="width:257px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td>Used to collect peritoneal cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R7388</td>
			<td>Basis medium for assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10082139</td>
			<td>Used as supplement for RPMI 1640 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">100x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Used as supplement for RPMI 1640 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fibronectin-coated &#181;-Slide&#160;I chambers</td>
			<td style="width:257px;">Ibidi, Martinsried, Germany</td>
			<td style="width:119px;">80102</td>
			<td>Channel slides used for assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">&#181;-Slide (anodized aluminum) rack</td>
			<td style="width:257px;">Ibidi, Martinsried, Germany</td>
			<td style="width:119px;">80003</td>
			<td>Autoclavable stackable rack for channel slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">RPMI 1640 medium containing bicarbonate</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8758</td>
			<td>Medium for overnight culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">N-(2-mercaptopropionyl)glycine</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6635</td>
			<td>Scavenger of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:508px;">Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MF48020</td>
			<td>Mouse macrophage marker and plasma membrane label</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">CellMask Orange</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10045</td>
			<td>Red fluorescent plasma membrane stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Succinimidyl ester of pHrodo</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36600</td>
			<td>Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA1-20893</td>
			<td>Used to opsonize human red blood cells with IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Alexa Fluor 594-conjugated&#160; goat anti-mouse (secondary) IgG antibody</td>
			<td style="width:257px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">Ab150116</td>
			<td>Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody</td>
			<td style="width:257px;">Hycult Biotech</td>
			<td style="width:119px;">HM1065</td>
			<td>Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11006</td>
			<td>Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Calcein/AM</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C3100MP</td>
			<td>Used to load human red blood cells with Calcein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon Eclipse Ti inverse microscope</td>
			<td style="width:257px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSU-X1 spinning disk scanner</td>
			<td style="width:257px;">Yokogawa Electric Corporation, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nipkow spinning disk unit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:508px;">14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera</td>
			<td style="width:257px;">Hamamatsu Photonics Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">488 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">561 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td style="width:257px;">Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages

Phagocytosis मेजबान रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऊतक विकास और रखरखाव में, और तेजी से शामिल है, रिसेप्टर मध्यस्थता actin cytoskeleton के पुनर्व्यवस्थाओं पर कब्जा करने के लिए, ढंक और बड़े कणों निगलना. हालांकि phagocytic रिसेप्टर्स, बहाव संकेत रास्ते, और Rho GTPases के रूप में प्रभाव, की पहचान की गई है, विशिष्ट रिसेप्टर के गतिशील cytoskeletal remodeling-मध्यस्थता phagocytic घटनाओं अस्पष्ट रहते हैं. चार दशक पहले, phagocytosis के दो अलग तंत्र, Fcγ रिसेप्टर (FcγR) द्वारा उदाहरण-और पूरक रिसेप्टर (सीआर)-मध्यस्थता phagocytosis, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर की पहचान की गई. immunoglobulin जी (आईजीजी) के बंधन-opsonized कण पतली झिल्ली एक्सटेंशन है, जो शुरू में कण के आसपास एक तथाकथित phagocytic कप फार्म के पहले यह पूरी तरह से संलग्न है और सेल में मुकर जाता है की दखलंदाजी चलाता है । इसके विपरीत, पूरक opsonized कणों रिसेप्टर्स पूरक करने के लिए बाध्यकारी निम्नलिखित phagocyte में सिंक करने के लिए दिखाई देते हैं. phagocytosis, phagocytic कप के गठन और डूब में इन दो मोड, साहित्य में अच्छी तरह से स्थापित हो गए हैं । हालांकि, दो मोड के बीच भेद रिपोर्टों है कि पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता phagocytosis विभिन्न झिल्ली की दखलंदाजी पैदा कर सकते हैं द्वारा धुंधला हो गया है. उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीक की उपलब्धता के साथ, phagocytosis परख कि कैसे विशिष्ट phagocytic रिसेप्टर्स के व्यक्तिगत कणों के तेज मध्यस्थता की वास्तविक समय 3 डी (तीन आयामी) दृश्य की अनुमति की आवश्यकता है । इस तरह के अंत बिंदु परख के रूप में phagocytosis के अध्ययन के लिए अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया दृष्टिकोण, को समझने की क्या कणों और फ़ैगोसाइट के इंटरफेस पर हो रहा है अवसर याद आती है । यहां हम phagocytic परख का वर्णन, समय का उपयोग चूक डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी कताई, कि एकल phagocytic घटनाओं के 3 डी इमेजिंग की अनुमति । इसके अलावा, हम स्पष्ट रूप से छवि Fcγ रिसेप्टर के लिए परख का वर्णन-या रिसेप्टर की मध्यस्थता phagocytosis पूरक.

समय-चूक कताई फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा phagocytosis के इमेजिंग के लिए इस्तेमाल चैनल स्लाइड का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1में दिखाया गया है । मानव लाल रक्त कोशिकाओं (hRBCs) लाल फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली मार्कर CellMask ऑरेंज के साथ दाग रहे हैं, जबकि अलग माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज (एमएस) हरी फ्लोरोसेंट Alexa Fluor के साथ लेबल कर रहे हैं ४८८-संयुग्मित विरोधी F4/80 एंटीबॉडी ( चित्रा 2), जो माउस मैक्रोफेज के एक विशिष्ट मार्कर के रूप में और एक प्लाज्मा झिल्ली लेबल के रूप में दोनों कार्य करता है । मानव लाल रक्त कोशिकाओं माउस आईजीजी के साथ opsonized जा सकता है (mIgG), या माउस आईजीएम (mIgM), आईजीजी (या आईजीएम) विरोधी CD235a एंटीबॉडी (CD235a, भी glycophorin ए के रूप में जाना जाता है के साथ कोशिकाओं को मशीन द्वारा, एक प्रोटीन है विशेष रूप से मानव लाल रक्त कोशिकाओं पर व्यक्त) । लाल फ्लोरोसेंट के साथ प्रस्तुत हरी फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज के समय चूक 3d इमेजिंग मानव लाल रक्त कोशिकाओं एकल कण phagocytic घटनाओं (चित्रा 2) के दृश्य में सक्षम बनाता है । एकल phagocytic घटनाओं के बंद अवलोकन कण पर कब्जा और घूस का विवरण delineated होने की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, एक मैक्रोफेज filopodium द्वारा एक mIgG-opsonized मानव लाल रक्त कोशिका का कब्जा, एक पतली, उंगली की तरह प्रक्षेपण, मनाया जा सकता है (चित्र 3ए; यह भी Horsthemke एट अल देखें । 15). इसके अलावा, phagocytic कप के गठन के दौरान एक मानव लाल रक्त कोशिका के निचोड़ (आंकड़ा 3ए) मनाया जा सकता है । नए सिरे से माउस सीरम, mIgG-opsonized, या mIgM-opsonized, मानव लाल रक्त कोशिकाओं की शुरूआत पर क्लासिक झरना, जो एक रक्तलायी झिल्ली का दौरा परिसर के गठन में समापन के पूरक ट्रिगर । पूरक-मध्यस्थता hemolysis के कैनेटीक्स CellMask नारंगी और Calcein के साथ दोहरे दाग इमेजिंग कोशिकाओं द्वारा मापा जा सकता है । ग्रीन फ्लोरोसेंट cytosolic Calcein तेजी से hemolysis (चित्र बी) के दौरान कोशिकाओं से जारी है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig1.jpg"> चित्रा 1: fibronectin-लेपित चैनल स्लाइड की हैंडलिंग । (a) एक चैनल स्लाइड आयाम ५० मिमी x 5 मिमी ०.४ मिमी के साथ एक चैनल द्वारा जुड़े दो जलाशयों के होते हैं. चैनल स्लाइड शुरू में दो जलाशयों में से एक के लिए 1-2 मिलीलीटर मध्यम लागू करने और स्लाइड झुकाव से भर रहे हैं । (ख) टोपियां गर्मी से पहले जलाशयों पर रखा जा सकता है । टोपियां आसानी से बाहर अवांछित हवा के बुलबुले कोशिकाओं के साथ चैनल बोने से पहले पंप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (ग) एयर बबल-फ्री १०० µ एल चैनल को सीधे pipetting माध्यम द्वारा किसी चैनल के मुँह में भर दिया जा सकता है. इस चरण का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, एक स्लाइड में मैक्रोफेज बीज के लिए या gfluorophore जोड़ने के लिए (हरी फ्लोरोसेंट)-संयुग्मित विरोधी F4/80 एंटीबॉडी, जो एक झिल्ली लेबल के रूप में कार्य करता है, साथ ही एक माउस मैक्रोफेज मार्कर. (घ) ऐसे opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में pipetting कणों के बाद, एक चैनल में फ्लोरोसेंट दाग मैक्रोफेज के साथ वरीयता प्राप्त, स्लाइड एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर रखा जा सकता है, और समय चूक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप हो सकता है प्रदर्शन. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig2.jpg"> चित्रा 2: phagocytosis की समय चूक 3 डी इमेजिंग । (क) योजनाबद्ध आरेख प्लाज्मा झिल्ली के opsonization से सना हुआ (लाल फ्लोरोसेंट) मानव लाल रक्त कोशिकाओं (hRBCs) माउस के साथ दिखा रहा है (एम) विरोधी CD235a immunoglobulin जी (mIgG) एंटीबॉडी, और माउस hRBCs लेबल मैक्रोफेज की प्रस्तुति (Ms), लेबल हरी फ्लोरोसेंट fluorophore के साथ (ग्रीन फ्लोरोसेंट)-संयुग्मित विरोधी F4/ (ख) समय चूक छवियों (XZ विचारों), कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त की, phagocytic कप के गठन और mIgG-opsonized hRBCs की घूस दिखा । स्केल बार = 10 µm. (C) 3डी रिकंस्ट्रक्शन दिखाकर मैक्रोफेज घूस mIgG-opsonized hRBCs. इसी XZ विचार (timepoints के 3 के लिए) बी में दिखाया गया है ग्रिड रिक्ति ५.०७ µm का प्रतिनिधित्व करते हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> ।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig3.jpg"> चित्रा 3: एक filopodium द्वारा एक कण पर कब्जा । समय चूक छवियों, कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त की, एक चूहा immunoglobulin जी (mIgG) पर कब्जा मैक्रोफेज एक माउस दिखा रहा है-opsonized मानव लाल रक्त कोशिका (hRBC) के माध्यम से एक filopodium (ऊपरी पैनल में तीर), एक उंगली प्रक्षेपण की तरह । ध्यान दें कि लाल रक्त कोशिका phagocytic कप के गठन के दौरान अपने crenations जल्दी खो देता है । इसके अलावा, phagocytic कप को लिफाफा लाल रक्त कोशिका निचोड़ प्रकट होता है (निचले पैनल में तीर से संकेत) । स्केल बार = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> ।

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Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

यहां हम माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज द्वारा छवि एकल phagocytic घटनाओं के लिए कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग तरीकों का वर्णन । अंय phagocytic कक्षों के लिए प्रोटोकॉल विस्तारित किया जा सकता है ।

माउस मैक्रोफेज द्वारा Phagocytosis की समय-चूक 3d इमेजिंग

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

इस निबंध का समग्र लक्ष्य, तीन आयामी समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा Phagocytosis के दृश्य के लिए मैक्रोफेज और ओपोनाइज्ड लाल रक्त कोशिकाओं को तैयार करना है। यह विधि इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, जैसे कि फैगोसाइट्स कैसे कैप्चर करते हैं और कणों को निगलना करते हैं। इस तकनीक को वास्तविक समय में कण तेज के दृश्य की अनुमति देता है, और अधिक पारंपरिक अंत बिंदु परख के विपरीत है कि केवल के आकलन की अनुमति है कि क्या लेकिन नहीं कैसे, एक कण किया गया है ।आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति तब तक संघर्ष कर सकते हैं जब तक कि वे सेल अलगाव प्रक्रियाओं के आदी न हो जाएं। हम पहली बार इस विधि के लिए विचार किया था जब हम 3 डी समय के लिए इस confocal माइक्रोस्कोपी कताई के फायदे का एहसास-Phagocytosis के चूक इमेजिंग । पेरिटोनियल मैक्रोफेज को अलग करने के लिए, तीन से चार महीने पुराने माउस के पेरिटोनम में 24 गेज प्लास्टिक कैथेटर रखें, और एक प्लास्टिक पांच मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें ताकि कैल्शियम और मैग्नीशियम प्रति लावेज के बिना ४.५ मिलीलीटर बर्फ-ठंडे एचबीएसएस के साथ दो बार गुहा को लाव किया जा सके ।एस्पिरेटेड निलंबन को 14-मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन राउंड बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करना क्योंकि यह एकत्र किया जाता है। जब दोनों नमूनों को काटा गया है, तो एस्पिरेट को अपकेंद्री करें, और पेरिटोनियल कोशिकाओं को पूर्ण बाइकार्बोनेट मुक्त आरपीएमआई 1640 माध्यम के एक मिलीलीटर में पुनर्प्रांतित करें ताकि छठी कोशिकाओं को मिलीलीटर एकाग्रता के अनुसार छह गुना 10 प्राप्त किया जा सके। इसके बाद, स्लाइडों को पूर्व-भरने के लिए फाइब्रोनेक्टिन कोटेड चैनल स्लाइड के एक जलाशय में पूर्ण एचईपीएस पूरक माध्यम का एक मिलीलीटर जोड़ें, और स्लाइड को झुकाएं ताकि माध्यम को डाउनस्ट्रीम जलाशय से एस्पिरेटेड किया जा सके।अवांछित हवा के बुलबुले को हटाने के लिए, दो जलाशयों में से एक में एक से दो मिलीलीटर ताजा माध्यम जोड़ें, और कसकर एक जलाशय टोपी लागू करें। फिर स्लाइड से बाहर किसी भी हवा पंप करने के लिए टोपी के लिए लयबद्ध अंगूठे के दबाव लागू होते हैं, आवश्यक के रूप में स्लाइड झुकाव । जब हवा के सभी निष्कासित कर दिया गया है, जलाशय युक्त अनकैप्ड माध्यम की ओर स्लाइड झुकाव, और टोपी को हटाने के लिए हवा से बचने के लिए चैनल में वापस चूसा जा रहा है ।अब झुरमुट को कम करने के लिए कई बार सेल समाधान को पिपेट करें, और कार्बन डाइऑक्साइड के अभाव में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नम कक्ष में दो घंटे इनक्यूबेशन के लिए स्लाइड के एक चैनल में कोशिकाओं के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के अंत में प्रत्येक स्लाइड में माध्यम युक्त एचईपीई को पूर्ण बाइकार्बोनेट पूरक माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें जैसा कि अभी प्रदर्शित किया गया है। फिर कोशिकाओं को उनकी रातोंरात संस्कृति के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें।अगली सुबह एक मिलीलीटर हौसले से प्राप्त स्वस्थ दाता रक्त के एक दो मिलीलीटर दौर नीचे पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसके बाद सैंपल को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट युक्त प्लाज्मा और बफी कोट निकालें।और ध्यान से तलछट लाल रक्त कोशिकाओं के 100 माइक्रोलीटर को दो मिलीलीटर मिरकोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्ण एचईपी पूरक माध्यम के 100 माइक्रोलीटर होते हैं। ट्यूब 1:1 लेबल और पतला लाल रक्त कोशिकाओं के चार माइक्रोलीटर को एक नए दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें दो मिलीलीटर पूर्ण एचईपी पूरक माध्यम होते हैं। फिर इस ट्यूब 4:2000 लेबल और बर्फ पर दोनों पतला लाल रक्त कोशिका नमूना ट्यूब जगह है ।पेरिटोनियल मैक्रोफेज लेबल करने के लिए प्रत्येक चैनल स्लाइड में बाइकार्बोनेट माध्यम को एचईपीईएस के साथ पूरक पूर्ण माध्यमों के साथ प्रतिस्थापित करें। फिर स्लाइड को झुकाएं फ्लोरोसेंटली टैग किए गए माउस मैक्रोफेज विशिष्ट एंटीबॉडी के 100 माइक्रोलीटर की अनुमति देने के लिए स्लाइड के 100 माइक्रोलीटर चैनल के उद्घाटन के लिए ड्रॉप वार जोड़ा जा सकता है। डाउनस्ट्रीम जलाशय में बहने वाले माध्यम को एस्पिरेट करें, और कार्बन डाइऑक्साइड के अभाव में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नम कक्ष में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।जबकि पेरिटोनियल कोशिकाओं को धीरे से 4:2000 लाल रक्त कोशिकाओं के नमूने मिश्रण लेबल किया जा रहा है और कोशिकाओं के ४०० माइक्रोलीटर को एक नए दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं, एक गर्म एल्यूमीनियम ब्लॉक में लगभग पांच से आठ मिनट के लिए एक लैमिनार प्रवाह हुड के अंदर । जब कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है कोशिकाओं के साथ एक उपयुक्त लाल फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली दाग के 0.4 माइक्रोलीटर मिश्रण। फिर कोशिकाओं को वापस हीट ब्लॉक में रखें।पांच मिनट के बाद ताजा HEPES के १.६ मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा कोशिकाओं को धोने पूरा माध्यम और अपकेंद्रित्र पूरक । लाल रक्त कोशिका गोली की पहचान करने के लिए ट्यूब घुमाएं। एक से 1.5 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग सावधानीपूर्वक गोली को परेशान किए बिना दो खंडों में सुपरनैट को हटा दें और कोशिकाओं के साथ पूर्ण माध्यम को पूरक ताजा एचईपी के 2000 माइक्रोलीटर मिलाएं।मध्यम के 400 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। फिर प्लाज्मा झिल्ली दाग के लिए ट्यूब पीएमएस लेबल। 20 मिनट के पेरिटोनियल सेल लेबलिंग के अंत में इनक्यूबेशन ताजा पूर्ण HEPES पूरक माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ स्लाइड धोने के लिए ।लाल रक्त कोशिकाओं को opsonize करने के लिए पीएमएस नमूना ट्यूब के लिए माउस IGG2B मोनोक्लोनल एंटी ह्यूमन सीडी 235A एंटीबॉडी का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रति मिनट एक बार मिश्रण के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर आठ मिनट के बाद प्लाज्मा झिल्ली दाग IGG के १०० माइक्रोलीटर की opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को पेरिटोनियल मैक्रोफेज युक्त चैनल स्लाइड के लिए । जैसे ही मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक कताई डिस्क कंफोकल माइक्रोस्कोप पर स्लाइड माउंट जोड़ा गया है।स्टेज इनक्यूबेटर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और तुरंत कोशिकाओं को इमेजिंग शुरू करें। लाल फ्लोरोसेंट मानव लाल रक्त कोशिकाओं के साथ प्रस्तुत हरे फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज की समय चूक 3डी-इमेजिंग एकल कण फैगोसाइटिक घटनाओं के दृश्य को सक्षम बनाती है। उदाहरण के लिए, एक मैक्रोफेज फिलोपोडियम द्वारा माउस IGG की कल्पना मानव लाल रक्त कोशिका का कब्जा देखा जा सकता है।साथ ही, फागोसाइटिक कप गठन के दौरान मानव लाल रक्त कोशिका का निचोड़। इस वीडियो को देखने के बाद आपको माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज, फ्लोरोसेंट रूप से लेबल की कोशिकाओं और ओपोनाइज्ड कणों को अलग करने के तरीके की अच्छी समझ होनी चाहिए।

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Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

म्यूरीन लिम्फोसाइट लेबलिंग द्वारा<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-एंटीबॉडी रिसेप्टर के लिए लक्ष्य निर्धारण<em&gt; में विवो</em&gt; पीईटी / सी टी द्वारा सेल तस्करी

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

एपोप्टोटिक थाइमोसाइट का प्रायोगिक विश्लेषण मैक्रोफेज द्वारा निगण

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

एथिमिक चूहों में मानव प्लीर मेसोथेलियोमा के ऑर्थोटोपिक मॉडल के पीईटी/सीटी द्वारा प्रत्यारोपण और निगरानी

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...