Tidsinnstilt 3D bildebehandling av fagocytose av musen makrofager

Det overordnede målet med dette essayet, er å forberede makrofager og opsoniserte røde blodlegemer for visualisering av phagocytose med tredimensjonal tidsforløp mikroskopi. Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen immunologi, for eksempel hvordan fanger fagocytter opp og innkapsler partikler. Denne teknikken tillater visualisering av partikkelopptak i sanntid, i motsetning til i mer tradisjonelle sluttpunktanalyser som bare tillater vurdering av om, men ikke hvordan, en partikkel har blitt innstår.

Vanligvis kan personer som er nye på denne metoden, slite til de blir vant til celleisolasjonsprosedyrene. Vi hadde først ideen til denne metoden da vi innså fordelene ved å spinne denne konfokale mikroskopien for 3D-tidsforløp av avbildning av Phagocytosis. For å isolere peritoneale makrofager, legg et 24 gauge plastkateter i bukhinnen til en tre til fire måneder gammel mus, og bruk en plastfem milliliter sprøyte til åkylle hulrommet to ganger med 4,5 milliliter iskald HBSS uten kalsium og magnesium per lavage.

Overføre aspirated suspensjon til en 14-milliliter polypropylen rundt bunnrøret som det er samlet. Når begge prøvene er høstet, sentrifuger aspiraten, og resuspend peritonealcellene i en milliliter komplett bikarbonatfri RPMI 1640 medium for å oppnå omtrent seks ganger 10 til de sjette cellene per milliliter konsentrasjon. Deretter, for å forhåndsfylle lysbilder legge til en milliliter komplett HEPES supplert medium til ett reservoar av en fibronectin belagt kanal lysbilde, og vippe lysbildet slik at mediet skal aspireres fra nedstrøms reservoaret.

For å fjerne uønskede luftbobler, legg til en til to milliliter friskt medium til ett av de to reservoarene, og påfør et reservoardeksel tett. Påfør deretter rytmisk tommeltrykk på hetten for å pumpe luft ut av lysbildet, vippe lysbildet etter behov. Når all luften er utvist, vipp skyvet skyvet mot det uåpnede mediet som inneholder reservoaret, og fjerner hetten for å unngå at luft suges tilbake i kanalen.

Nå pipette celleløsningen et par ganger for å redusere klumping, og tilsett 100 mikroliter av cellene i en kanal av lysbildet i en to timers inkubasjon i et fuktig kammer ved 37 grader celsius i fravær av karbondioksid. På slutten av inkubasjonen erstatte HEPES som inneholder medium i hvert lysbilde med komplett bikarbonat supplert medium som nettopp demonstrert. Plasser deretter cellene i en 37 grader celsius fuktig inkubator med 5% karbondioksid for deres overnattingskultur.

Neste morgen overføre en milliliter av nyforståret sunt donorblod til en to milliliter rund bunn polypropylen mikrocentrifuge tube. Sentrifuger deretter prøven. Fjern plasma- og buffycoaten som inneholder supernatant.

Og overfør forsiktig 100 mikroliter av de sedimenterte røde blodlegemene til et to milliliter mircocentrifuge rør som inneholder 100 mikroliter komplett HEPES supplert medium. Merk røret 1:1 og overfør fire mikroliter av de fortynnede røde blodlegemene til et nytt to milliliter mikrocentrifugerør som inneholder to milliliter komplett HEPES supplert medium. Merk deretter dette røret 4:2000 og legg begge fortynnede røde blodlegemer prøverør på is.

Hvis du vil merke peritoneale makrofager, erstatter du bikarbonatmediet i hvert kanallysbilde med komplette medier supplert med HEPES. Deretter vipper lysbildet slik at 100 mikroliter av den fluorescerende merkede musen makrofag spesifikke antistoff av interesse som skal legges drop wise til åpningen av 100 mikroliter kanal av lysbildet. Aspirer mediet som strømmer inn i nedstrøms reservoaret, og inkuber cellene i 20 minutter i et fuktig kammer ved 37 grader celsius i fravær av karbondioksid.

Mens peritoneale celler blir merket forsiktig blande 4:2000 røde blodlegemer prøve og overføre 400 mikroliter av cellene til en ny to milliliter mikrocentrifuge tube, i en oppvarmet aluminiumblokk inne i en laminær strømningshette i ca fem til åtte minutter. Når cellene har varmet opp til 37 grader celsius blanding 0,4 mikroliter av en passende rød fluorescerende plasma membran flekk med cellene. Plasser deretter cellene tilbake i varmeblokken.

Etter fem minutter vaske cellene ved å legge til 1,6 milliliter frisk HEPES supplert komplett medium og sentrifuge. Roter røret for å identifisere den røde blodlegemerpellet. Ved hjelp av en til 1,5 milliliter pipettespiss fjerner du forsiktig supernatanten i to bind uten å forstyrre pelleten og bland 2000 mikroliter med friske HEPES supplert komplett medium med cellene.

Sentrifuge og re-suspendere pellet i 400 mikroliter av medium. Merk deretter røret PMS for Plasma Membran Stain. På slutten av 20 minutters peritoneal celle merking inkubasjon vaske lysbildet med en milliliter frisk komplett HEPES supplert medium.

For å opsonisere de røde blodlegemene legge til en mikroliter mus IGG2B monoklonal anti menneskelig CD235A antistoff til PMS prøverør. Etter åtte minutter ved 37 grader celsius med blanding en gang per minutt overføring 100 mikroliter av plasmamembranen farget IGG opsonized menneskelige røde blodlegemer til peritoneal makrofag som inneholder kanal lysbilde. Så snart de menneskelige røde blodlegemene er lagt montere lysbildet på en spinnende plate konfokal mikroskop.

Med scenen inkubator satt til 37 grader celsius og umiddelbart begynne å forestille seg cellene. Tid forfalle 3D-avbildning av grønne fluorescerende makrofager presentert med røde fluorescerende menneskelige røde blodlegemer muliggjør visualisering av enkeltpartikkel phagocytic hendelser. For eksempel kan fangst av en mus IGG opsonisert menneskelig røde blodlegemer av en makrofagfilopodium observeres.

I tillegg til klemming av en menneskelig røde blodlegemer under fagocytisk koppdannelse. Etter å ha sett denne videoen bør du ha en god forståelse av hvordan du isolerer musbosatte peritoneale makrofager, fluorescerende merkede celler og opsoniserte partikler.