13.3K Views
•
07:24 min
•
October 19th, 2018
DOI :
October 19th, 2018
•0:04
Title
1:00
Resident Mouse Peritoneal Macrophage and Human Red Blood Cell Isolation
4:00
Macrophage Plasma Membrane Labeling and Human Red Blood Cell-mouse Immunoglobulin (IgG) Opsonization and Imaging
6:32
Results: Representative Time-lapse, 3D-imaging of Phagocytosis
7:02
Conclusion
Transcript
Det övergripande målet för denna uppsats, är att förbereda makrofager och opsonized röda blodkroppar för visualisering av Phagocytosis av tre dimensionella tidsförlopp mikroskopi. Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området immunologi, till exempel hur tar fagocyter fånga och intöma partiklar. Denna teknik möjliggör visualisering av partikelupptag i realtid, till skillnad från i mer traditionella end-point analyser som bara tillåter bedömning av om men inte hur, en partikel har intaget.
Generellt, individer nya till denna metod får kämpa tills de blir vana vid cellen isolering förfaranden. Vi hade först idén för denna metod när vi insåg fördelarna med spinning denna confocal mikroskopi för 3D time-lapse imaging av Phagocytosis. För att isolera peritoneala makrofager, placera en 24 gauge plast kateter i bukhinnan av en tre till fyra månader gammal mus, och använda en plast fem milliliter spruta för att lavage håligheten två gånger med 4,5 milliliter iskall HBSS utan kalcium och magnesium per lavage.
Överföring av den aspirerade suspensionen till en 14-milliliter polypropylen rund botten rör som den samlas. När båda proverna har skördats, centrifug aspirat, och resuspend peritoneal cellerna i en milliliter av komplett bikarbonat fri RPMI 1640 medium för att uppnå ungefär en sex gånger 10 till sjätte celler per milliliter koncentration. Nästa, att förinfyllnadsbilder lägga till en milliliter av komplett HEPES kompletteras medium till en reservoar av en fibronectin belagda kanal slide, och luta bilden så att mediet som skall aspirerade från nedströms reservoar.
För att ta bort oönskade luftbubblor, tillsätt en till två milliliter färskt medium till en av de två reservoarerna, och tätt tillämpa en reservoar lock. Applicera sedan rytmiskt tumtryck på locket för att pumpa ut eventuell luft ur rutschkanan, luta bilden efter behov. När all luft har utvisats, luta bilden mot det icke-utjämnade mediet som innehåller reservoar, och ta bort locket för att undvika att luft sugs tillbaka in i kanalen.
Nu pipettera celllösningen några gånger för att minska klumpar, och tillsätt 100 mikroliter av cellerna i en kanal av bilden för en två timmars inkubation i en fuktig kammare vid 37 grader celsius i avsaknad av koldioxid. I slutet av inkubationen ersätta HEPES innehåller medium i varje objektglas med komplett bikarbonat kompletterat medium som just visat. Placera sedan cellerna i en 37 grader celsius fuktig inkubator med 5% koldioxid för deras övernattning kultur.
Nästa morgon överföra en milliliter av nyligen erhållna friska givaren blod till en två milliliter runda botten polypropylen mikrocentrifugrör. Sedan centrifug provet. Ta bort plasma och buffy coat som innehåller supernatant.
Och försiktigt överföra 100 mikroliter av de sedimenterade röda blodkropparna i en två milliliter mircocentrifug röret som innehåller 100 mikroliter av kompletta HEPES kompletteras medium. Märk röret 1:1 och överför fyra mikroliter av de utspädda röda blodkropparna till ett nytt två milliliter mikrocentrifugrör innehållande två milliliter komplett HEPES kompletterat medium. Sedan märka detta rör 4:2000 och placera båda utspädda röda blodkroppar provrör på is.
Att märka peritoneal makrofager ersätta bikarbonat mediet i varje kanal glida med kompletta medier kompletteras med HEPES. Sedan luta bilden för att tillåta 100 mikroliter av fluorescerande taggade mus makrofag specifik antikropp av intresse som skall läggas droppe klokt till öppnandet av 100 mikroliter kanal av bilden. Aspirera mediet som rinner in i nedströms reservoaren, och inkubera cellerna i 20 minuter i en fuktig kammare vid 37 grader celsius i avsaknad av koldioxid.
Medan peritoneal cellerna är märkt försiktigt blanda 4:2000 röda blodkroppar prov och överföra 400 mikroliter av cellerna till en ny två milliliter microcentrifuge rör, i en uppvärmd aluminium block inuti en laminär flöde huva i cirka fem till åtta minuter. När cellerna har värmts till 37 grader celsius blanda 0,4 mikroliter av en lämplig röd fluorescerande plasmamembran fläck med cellerna. Placera sedan tillbaka cellerna i värmeblocket.
Efter fem minuter tvätta cellerna genom att lägga till 1,6 milliliter av färsk HEPES kompletteras komplett medium och centrifug. Rotera röret för att identifiera den röda blodcellpelletsen. Använda en till 1,5 milliliter pipett spets försiktigt ta bort supernatanten i två volymer utan att störa pelleten och blanda 2000 mikroliter av färska HEPES kompletteras komplett medium med cellerna.
Centrifugera och åter upphäva pelleten i 400 mikroliter medium. Märk sedan röret PMS för PlasmaMembran stain. I slutet av 20 minuters peritoneal cellmärkning inkubation tvätta bilden med en milliliter av färska komplett HEPES kompletterat medium.
För att opsonize de röda blodkropparna lägga till en mikroliter av mus IGG2B monoklonala anti human CD235A antikropp till PMS provröret. Efter åtta minuter vid 37 grader celsius med blandning en gång per minut överföra 100 mikroliter av plasmamembranet färgade IGG opsonized mänskliga röda blodkroppar till peritoneal makrofag som innehåller kanal slide. Så snart de mänskliga röda blodkroppar har lagts montera bilden på en snurrande skiva confocal mikroskop.
Med scenen inkubator inställd på 37 grader celsius och omedelbart börja avbilda cellerna. Time lapse 3D-imaging av gröna fluorescerande makrofager presenteras med röda fluorescerande mänskliga röda blodkroppar möjliggör visualisering av enstaka partikel phagocytic händelser. Till exempel kan fånga av en mus IGG opsonized mänskliga röda blodkroppar av en makrofag filopodium observeras.
Samt, klämma av en mänsklig röd blodkropp under fagocytic kopp bildning. Efter att ha tittat på den här videon bör du ha en god förståelse för hur man isolera mus bosatt peritoneala makrofager, fluorescerande märkta celler och opsonized partiklar.
Här beskriver vi metoder med snurrande bricka konfokalmikroskopi bild enda fagocytos händelser av mus bosatt peritoneal makrofager. Protokoll som kan utökas till andra Fagocytos celler.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved