Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور م. Calkins لتحرير اللغة الإنجليزية. وكان يؤيد هذا العمل تشانغ Gung التذكاري مستشفى (CMRPD1F0482) وجامعة الأمنيون تشانغ، ومركز بحوث الشيخوخة الصحية (EMRPD1G0171) ووزارة العلوم والتكنولوجيا (105-2320-B-182-012-MY2).

وافق جميع الأساليب الموضحة هنا أن استخدام الحيوانات التجريبية "رعاية الحيوان المؤسسية" واللجنة استخدام (إياكوك) من جامعة الأمنيون تشانغ (CGU 13-014).
1-جمع DRG القطني من الفئران التجريبية
<ol><li>استخدام 2 3 الفئران سبراغ داولي (SD) أسبوع من العمر لمجموعة الرسم القطني. ملاحظة: الرسم ال...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+nociception.">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li><li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain.">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li><li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperalgesia+and+allodynia:+peripheral+mechanisms.">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain.">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat.">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li><li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain:+an+in+vivo+and+in+vitro+study.">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).</li><li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain.">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li><li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch.">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li><li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons:+A+transcriptomic+comparison.">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li><li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line.">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li><li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors.">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).</li><li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn.">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

في هذه المادة، نبدي جمع وإنزيم-الانفصال، وثقافة الفئران القطني DRG. مع دعم نيوروتروفيك من ستموت، مد محاور عصبية من الخلايا العصبية الرسم في غضون 3 أيام بعد البذر الخلية. محاور عصبية طويلة كانت واضحة يمكن ملاحظتها بعد الخلايا كانت الملون لبروتين CGRP، التي يتم توليفها في سوما الخلية ونقلها على...

الهيئات الخلية من الخلايا العصبية الحسية الواردة ضمن الرسم. هذه الخلايا العصبية الزائفة أحادي القطب ويعصب الأنسجة المحيطية والجهاز العصبي المركزي. تم العثور على النهايات الطرفية العصبية من الخلايا العصبية الحسية في الجلد وأجهزة الحشوي، العضلات والعظام، وبين سائر الأنسجة. هي إرسال إشارات الإحساس الطرفية للعصب النهايات في القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري والإشارات ثم تنتقل إلى الدماغ عبر مسارات مختلفة تصاعدي من الإحساس جسمية1،2. ويتيح الإحساس جسدية الجسم ليشعر (أي، تعمل باللمس والألم والأحاسيس الحرارية) وتصور الحركة والتوجه المكاني (التحفيز الأحاسيس)1،3. وهناك أربع فئات فرعية من محاور عصبية الزبائ الأولية، بما في ذلك المجموعة الأولى من الألياف (Aα) التي تستجيب لوضع الجسم عضلات الهيكل العظمى، والفريق الثاني (Aβ) الألياف التي تستجيب ميتشانوريسيبتورس الجلد، والمجموعة الثالثة (Aδ) ومجموعة ألياف الخامس (ج) الاستجابة للألم و درجة الحرارة. فقط الألياف ج أونميليناتيد، في حين بقية myelinated بدرجات مختلفة.
نوسيسيبتورس هي الخلايا العصبية الحسية الأولية، التي يتم تنشيطها بالمنبهات الضارة (تحفيز الميكانيكية والحرارية والكيميائية) التي تحمل إمكانات لتلف الأنسجة. وتتكون هذه الخلايا العصبية ميليناتيد Aδ الألياف والألياف ج أونميليناتيد1،4. ألياف Aδ التعبير عن مستقبلات عامل نمو العصب (ستموت، مستقبلات ترقا) وكجرب sp. وتصنف الألياف ج ألياف ج أما من بيبتيديرجيك وغير بيبتيديرجيك. من ناحية أخرى، أعرب الألياف ج غير بيبتيديرجيك المستقبلات لعامل نيوروتروفيك الدبقية مشتقة (مستقبلات جدنف، والمقصود بالصندوق، و GFR)، إيسوليكتين IB4، وبوابات ATP أيون قناة النوع الفرعي (P2X3)5،،من67. يمكن أن تتميز بالتعبير عن قنوات أيون nociceptors وتفعيلها من خلال العوامل نيوروتروفيك، السيتوكينات، neuropeptides، ATP، أو المواد الكيميائية الأخرى مركبات8. يج وز على التحفيز، والعصبية، بما في ذلك كجرب و SP غلوتامات من المحطات العصبية الحسية في القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري إرسال إشارات nociceptive2. الرسم ليست فقط تتكون من الخلايا العصبية، ولكن أيضا تحتوي على الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية. تحيط الخلايا العصبية الحسية الخلايا الأقمار الصناعية وتقديم الدعم الميكانيكية والايض9،10. من المثير للاهتمام، وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن الخلايا الدبقية الساتلية في الرسم قد يكون متورطا في تنظيم ألم الإحساس11.
الخلايا العصبية الحسية أفيد أن يكون الأكثر كثيرا ما تستخدم الخلايا العصبية الأولية12 وقد استخدمت لتوصيل الإشارة الكهربية والعصبي الإفراج عن الدراسات. أنها تستخدم عادة لاستكشاف الآليات الخلوية لتنمية الخلايا العصبية والألم التهابات والأم الأعصاب، والإحساس بالجلد (مثل حكة) واكسون ثمرة12،13،،من1415. يمكن مثقف الرسم الأساسي الثقافات كالخلايا العصبية معزولة تقييم التغيرات البيوكيميائية في واحدة أو في خلايا متعددة، السماح للعلماء إجراء الدراسات التي يتعذر إجراؤها في المواضيع التجريبية. في الآونة الأخيرة، تم بنجاح مثقف الرسم من الجهات المانحة الجهاز البشري الذي قد تستفيد كثيرا من البحوث متعدية16. من ناحية أخرى، يمكن أيضا استزراع الخلايا العصبية الحسية كما DRG explants. DRG explants الحفاظ على بنية الأنسجة الأصلية من الخلايا العصبية، بما في ذلك خلايا شوان والأقمار الصناعية الخلايا الدبقية، وهي مفيدة بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية وغير العصبية17. يمكن بسهولة إعداد الرسم الأساسي الثقافات داخل ح 2.5. تكوين الخلية وخصائص عاكسة لمصدر الرسم، وعلى هذا النحو، يمكن جمعها بالرسم المحددة (DRG القطني أو الصدري) وفقا لمطالب التجريبية. الثقافات من الأجنة وحديثي الولادة DRG الخلايا العصبية تتطلب ستموت البقاء على قيد الحياة، والحث على ثمرة محور عصبي، ولكن الثقافات من الخلايا العصبية الكبار لا تتطلب إضافة العوامل نيوروتروفيك لل12،وسائل الإعلام17. وهناك أيضا خطوط خلايا هيبريدوما DRG المتاحة تجارياً مثل ND7/23 و F11، التي لا تتطلب استخدام الحيوانات التجريبية. ومع ذلك، عدم الموجبة المحتملة مستقبلات عابرة قناة الأعضاء الفصيلية V 1 (TRPV1) التعبير (علامة هامة للخلايا العصبية nociceptive الحسية الصغيرة) وملامح التعبير الجيني تتعارض تحد من تلك التطبيقات18. في الآونة الأخيرة، مخلدة الخلايا العصبية الرسم خطوط مستمدة من الفئران (50B11)19 و20من الماوس (MED17.11)، التي مناسبة لاستخدام في شاشات الفائق للمخدرات تستهدف الدراسات. بيد أن التعبير الجيني التنميط لخطوط الخلية هذه لم تتم. وهكذا، التحقق من صحة التجارب المقارنة بين هذه الخلايا مخلدة للخلايا العصبية الحسية لا تزال جارية.
NPFFR2 هو توليفها في الرسم وذوبانها للمحطات الطرفية العصبية الحسية في العمود الفقري الظهرية القرن21. في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكولا لاستزراع خلايا DRG القطنية والتعامل معهم بمؤثر NPFFR2 للحث على الإفراج عن العصبية، كجرب و sp. الاعتماد على NPFFR2 هو اختبار المزيد من استخدام NPFFR2 صغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، التي قد ترانسفيكتيد في الخلايا المستزرعة DRG.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

العقد الجذرية الظهرية (DRG) تحتوي على جثث الخلية من الخلايا العصبية الحسية. هذا النوع من الخلايا العصبية شبه أحادي القطب، مع اثنين من محاور عصبية التي يعصب الأنسجة المحيطية، مثل الجلد، والعضلات وأجهزة الحشوي، فضلا عن القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري للجهاز العصبي المركزي. الخلايا العصبية الحسية يحيل الإحساس الجسدية، بما في ذلك اللمس، الألم، والأحاسيس الحرارية، والتحفيز. ولذلك، تستخدم على نطاق واسع الثقافات الرسم الأساسي لدراسة آليات nociception الخلوية، والوظائف الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية والعصبية التنمية. ويمكن تطبيق الخلايا العصبية مثقف في الدراسات التي تنطوي على الكهربية وتوصيل الإشارة والإفراج عن ناقل عصبي، أو تصوير الكالسيوم. مع الثقافات الرسم الأساسي، والعلماء قد الثقافة الخلايا العصبية DRG منفصلان لرصد التغيرات البيوكيميائية في واحد أو عدة خلايا، التغلب على العديد من أوجه القصور المرتبطة بالتجارب في فيفو . مقارنة تجارياً المتاحة خطوط خلايا هيبريدوما DRG أو مخلدة الرسم خطوط الخلايا العصبية وتكوين وخصائص الخلايا الأولية أكثر بكثير مماثلة للخلايا العصبية الحسية في الأنسجة. ومع ذلك، نظراً للعدد المحدود من الرسم مثقف الابتدائية الخلايا التي يمكن أن تكون معزولة عن حيوان مفردة، من الصعب أداء شاشات الفائق للمخدرات تستهدف الدراسات. ويرد في المادة الحالية، إجراءات تحصيل الرسم والثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر معاملة مثقف DRG الخلايا مع مؤثر مستقبلات neuropeptide فرنك فرنسي نوع 2 (NPFFR2) للحث على الإفراج عن العصبية الببتيد (كالسيتونين المتصلة بالجينات الببتيد (كرجب) ومادة ف (س)).

الخلايا العصبية DRG القطني الفئران، مثقف في صفيحة 24-جيدا، كانت تزرع في الثقافة المتوسطة مع ج ارا إضافية لكبح انتشار الخلايا الدبقية وستموت لدعم نمو الخلايا العصبية. مورفولوجية المعيشة لوحظ الخلايا DRG. كما هو موضح في الشكل 3، تعلق على الجزء السفلي من الطبق ف?...

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release (Video) | JoVE

كثيرا ما تستخدم الجذر الظهرية ganglia (DRG) الثقافات الأولية لدراسة الوظائف الفسيولوجية أو الأحداث المتعلقة بعلم الأمراض في الخلايا العصبية الحسية. هنا، نحن شرح استخدام الثقافات DRG القطني للكشف عن الإفراج عن العصبية بعد مستقبلات neuropeptide فرنك فرنسي اكتب التحفيز 2 مع مؤثر انتقائية.

عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة الإفراج عن ناقل عصبي

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البحوث الحسية، مثل nociception المحيطية. الميزة الرئيسية لهذا التقنية هو أن التحقيق في آلية الخلوية من الخلايا العصبية الحسية مع النموذج الذي يحاكي معظم للحالة الفسيولوجية. جمع ganglia الجذر الظهري من جذع الجرذ من العمر أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع.تبدأ من خلال إجراء شقين على طول جانبي العمود الفقري وقطع واحد الجانبي للاحتفال المدى الرسترالي للعمود الفقري القطني. ثم استخدم ملقط قطع العظام لإزالة العضلات الظهرية للعمود الفقري. بعد ذلك، قم بإزالة الجزء الظهري من الفقرات وفضح الحبل الشوكي.ثم استخدام مقص التشريح ملقط لإزالة الحبل الشوكي. تحديد DRG القطنية عن طريق عد الفقرات من الضلع الأخير. يوضح هذا الرسم التخطيطي مواضع الفقرات.استخدام مقص صغير لجمع 12 ثنائية 12 11 1 1 1 1100000000000000000000000000000000000000000000000 إزالة أي ألياف الخلايا العصبية المرفقة لتحسين نقاء الثقافة. نقل كل DRG القطنية إلى طبق ثقافة 35 ملليمتر تحتوي على ملليلتر من الجليد الباردة مصل المتوسطة الخالية. نقل طبق DRG التي تحتوي على 35 ملليمتر في غطاء محرك السيارة، وغسل DRG مع المتوسطة خالية من المصل ثلاث مرات عن طريق ماصات.استخدام ملاقط معقمة لنقل DRGs إلى جديد 35 ملليمتر طبق الثقافة التي تحتوي على مليلتر اثنين من الكولاجين العقيمة نوع 1A. وضع الأنسجة في حل الكولاجيناز في 37 درجة مئوية حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة لبدء تفكك الخلايا. بعد الحضانة، وإزالة محلول الكولاجيناز وغسل DRG ثلاث مرات في ملليلتر من محلول الملح هانك متوازنة.بعد ذلك، أضف ملليلترين من 0.05٪ من التربسين EDTA مسبقًا إلى الطبق، وهضم DRG في الحاضنة لمدة 30 دقيقة كما كان من قبل. بعد الهضم، استخدم ماصة زجاجية لنقل ميليلترين من محلول يحتوي على DRG إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. قد تلتزم DRG بالميصة الزجاجية لذلك يجب إجراء هذه الخطوة بعناية.يمكن تجنب الخسارة الفعلية عن طريق الحفاظ على حل يحتوي على DRG في نهاية الماصات الزجاجية ، ونقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي ببطء ولكن دون توقف. بعد ذلك، الطرد المركزي الحل في 290 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وإزالة عظمى وإضافة ملليلترين أخرى من المتوسطة خالية من المصل لإعادة drsuspend DRG.كرر غسل مرتين، وذلك باستخدام مليلترين من ثقافة ما قبل الاحتياف المتوسطة لإعادة تعليق الأنسجة بعد الطرد المركزي النهائي. استخدام الماصات المصات المُعَمَّل المُعدّة مسبقًا ل triturate يدوياً في DRG حوالي 60 مرة. بعد ذلك، قم بإزالة لوحة بولي-إل-ليسين المغلفة 24 بئر تحتوي على ملليلتر واحد من الثقافة المتوسطة في البئر من حاضنة ثاني أكسيد الكربون.التعرق الثقافة المحتضنة المتوسطة من الطبق. بذور خلايا DRG من فأر واحد في أربعة من الآبار. وهذا يعطي كثافة البذر من حوالي 500،000 الخلايا في البئر.في اليوم التالي، استبدل الوسط الثقافي بـ"متوسط" مكمّل بـ 10 ميكرومولار آراك، و100 نانوغرام لكل ملليلتر NGF. في اليوم الثالث بعد طلاء الخلايا، قم بتغيير الوسيط إلى 0.5 ملليلتر من الوسيط الخالي من المصل مسبقًا، واحتضان لمدة ساعة واحدة. خلال الحضانة، إضافة 50 ملليمولار سيرنا في ميكرولتر واحد من المياه الخالية من RNase إلى 12.5 ميكرولترات من المتوسطة خالية من المصل لكل عملية نقل.ثم ماص 2.5 ميكرولترات من مُشفر transfection إلى 10 ميكرولترات من وسيط خال من المصل لكل عملية نقل. اخلط كلا الحلين بواسطة الماصات، وحضن هذا الحل المختلط لـ 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق، أضف محلول الانتقال إلى آبار لوحة DRG التي تحتوي على 24 بئرًا واخلطها عن طريق الاهتزاز بلطف.بعد فترة حضانة لمدة ست ساعات، أضف 0.5 ملليلتر من الاستزراع المتوسط مع 20٪ FBS، و10 ميكرومولار آراك، و100 نانوغرام لكل ملليلتر NGF في كل بئر من الخلايا. وأخيراً، احتضان DRG في حاضنة CO2 37 درجة مئوية لمدة 66 ساعة أخرى. في اليوم السادس بعد الطلاء، وبعد 72 ساعة من نقل الرنا، قم بتغيير متوسط الثقافة إلى 200 ميكرولترات من المتوسطة الخالية من المصل.بعد 30 دقيقة الحضانة، إضافة ميكرولتر واحد من المواد الكيميائية التحفيز ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب. يتم استخدام ناهض NPFFR2، dNPA، والسيارة المقابلة هنا. بعد احتضان للفترة المطلوبة، وجمع المتوسطة الثقافة من طبق الثقافة، والطرد المركزي في 5000 مرات G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لإزالة أي الشوائب المعلقة.جمع عظمى من الطرد المركزي وتمييع مع المالحة الفوسفات المخزنة حسب الحاجة. اختبار مستويات الناقلات العصبية مع مجموعات المناعة الانزيم المتاحة تجاريا. في اليوم الأول، تم إرفاق جسم الخلية من الخلايا العصبية واحدة المشار إليها من قبل السهم على الجزء السفلي من طبق.توجد أيضاً خلية ذبقية تشير إليها رأس سهم. الخلايا الدبقية مكررة ووسعت العمليات لتحيط الجسم الخلية من الخلايا العصبية الحسية في اليوم الثاني، وهي العملية التي كانت أكثر بروزا في اليوم الثالث. في ثقافة أخرى، كان بروتين CGRP ملطخًا للكشف عن شكل الخلايا العصبية.يظهر تلطيخ بروتين CGRP في السيتوبلازم والمحاور العصبية الحسية. و morphologies النووية من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية هي متميزة عندما ملطخة DAPI. الخلايا العصبية لديها نواة أكبر وأكثر تقريب من الخلايا الدبقية.وعلى سبيل المقارنة، نواة من الدبقية هي أكثر بيضاوية في الشكل. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في ساعتين ونصف إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح وثقافة ganglion جذر الظهرية، واستخدامه كأداة للتحقيق في الوظائف الفسيولوجية الكامنة.لا تنس أن العمل مع الخلايا الأساسية يمكن أن يكون أكثر صعوبة من العمل مع خطوط الخلايا العادية، ويجري لطيف هو دائما أفضل وسيلة عند تنفيذ هذه العملية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury (Video) | JoVE

مناعي لونين من الظهرية جذر الأنسجة العقد التالي من الإصابات محواري

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy (Video) | JoVE

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons (Video) | JoVE

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration (Video) | JoVE

الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons (Video) | JoVE

تصوير لايف من النيكوتين المستحثة اشارة الكالسيوم وناقل عصبي الإصدار جنبا إلى جنب بطني الحصين المحاوير

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons (Video) | JoVE

مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents (Video) | JoVE

البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration (Video) | JoVE

الظهرية جذر حقن العقدة وظهري الجذر سحق إصابة نموذجا لالحسية أكسون التجديد

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages (Video) | JoVE

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning (Video) | JoVE

إثراء مزارع الخلايا العصبية للعقد الجذرية الظهرية للفأر البالغ عن طريق التحفيز المناعي

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...