Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
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感谢 m. 卡尔金斯博士的英文编辑。这项工作得到了长功夫纪念医院 (CMRPD1F0482)、长功夫大学、健康老龄化研究中心 (EMRPD1G0171) 和科学技术部 (105-2320-182-012-MY2) 的支持。

本文介绍的所有使用实验动物的方法均经 IACUC 大学动物保育和使用委员会 (问 13-014) 批准。
1. 从实验大鼠中收集腰椎背节
<ol><li>使用2至3周-大 (SD) 大鼠腰背根节收集。 注: 从4周龄大鼠收集的背根神经节神经元在此处描述的文化条件下生长不良好。</li>
	<li>在高压釜内消毒所有手术器械。</li>
	<li>麻醉鼠与1:1 混合 tiletamine 和 zolazepam (20 毫克/千克; 腹腔注射 (IP)), 并等待, 直?...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

本文对大鼠腰椎背节的采集、酶解分离和培养进行了说明。在神经生长因子支持下, 背节神经元的轴突在细胞播种后3天内延长。当细胞被染色为 CGRP 蛋白, 在细胞体细胞中合成并沿轴突纤维传输时, 扩展轴突明显可见。卫星细胞的过程也延长, 允许这些分裂的神经胶质细胞在几天之内环绕神经元。本协议所生长的原发根神经节细胞适于对调节感觉神经元的细胞机制进行研究。在这里, 我们通过选择?...

感觉神经元的细胞体包含在根背根内。这些神经元是伪单极和支配的周围组织和中枢神经系统。感觉神经元的周围神经末端在肌肉、皮肤、内脏器官和骨骼, 以及其他组织中发现.他们将周围的感觉信号传送到脊髓背角的神经末梢, 然后通过不同的躯体感觉1,2的提升通路将信号传送到大脑。躯体感觉使身体感觉 (即触摸, 疼痛和热感觉) 和知觉运动和空间方向 (本体感觉)1,3。有四个子类的初级传入轴突, 包括第一组 (Aα) 纤维, 对本体的骨骼肌肉, 第二组 (Aβ) 纤维反应的皮肤 mechanoreceptors, 第三组 (Aδ) 和 V (C) 纤维, 反应疼痛和温度。只有 C 纤维是髓的, 而其余的是髓不同程度。
痛觉受器是主要的感官神经元, 由有害刺激 (机械, 热, 化学刺激) 激活, 具有潜在的组织损伤。这些神经元由髓 Aδ纤维和髓 C 纤维1,4组成。Aδ纤维表达神经生长因子 (NGF、trkA 受体)、CGRP 和 SP 的受体。c 纤维分为肽能和非肽能 c 纤维。另一方面, 非肽能 C 纤维表达了神经胶质源性神经营养因子 (GDNF、RET 和 GFR 受体)、isolectin IB4 和 ATP 门控离子通道亚型 (P2X3)5、6、7的受体。痛觉受器可以通过离子通道的表达和神经营养因子、细胞因子、肽类、ATP 或其他化合物的活化来区分.8。在刺激时, 神经递质, 包括 CGRP、SP 和谷氨酸可以从脊髓背角的感官神经元终端释放, 传递伤害信号2。根神经节不仅由神经元组成, 而且还含有卫星胶质细胞。卫星细胞环绕感觉神经元, 提供机械和新陈代谢支持9,10。有趣的是, 有越来越多的证据表明, 神经节中的卫星胶质细胞可能参与调节疼痛感觉11。
感觉神经元被报道为最常用的原发性神经细胞12 , 并已用于电生理、信号传导和神经递质释放研究。它们也通常用于探索神经细胞发育的细胞机制、炎症性疼痛、神经病理性疼痛、皮肤感觉 (如瘙痒) 和轴突生长因子12、13、14、15。根背节原代培养可以作为分离神经元来评估单个或多个细胞的生化变化, 使科学家能够进行不能在实验对象中进行的研究。近年来, 从人体器官捐献者那里成功地培养了根背根, 对转化研究有很大裨益16。另一方面, 感官神经元也可以培养成根神经节外植体。根背节外植体保留了原组织结构的神经元, 包括雪旺细胞和卫星胶质细胞, 并特别有用的研究神经元和非神经元细胞之间的相互作用17。根背根根的培养可以很容易地在2.5 小时内准备好。细胞的组成和性质是高度反射的源背节, 因此, 特定的背节 (腰椎或胸背节) 可以根据实验要求收集。胚胎和新生儿背根神经节神经元的培养需要神经生长因子存活并诱发轴突的生长, 但成年神经元的培养不需要增加营养因子到媒体12,17。还有商业上可利用的背根瘤细胞系, 如 ND7/23 和 F11, 不需要使用实验动物。然而, 缺乏瞬态受体电位阳离子通道亚科 V 成员 1 (TRPV1) 表达 (一个重要标志的小感官伤害神经元) 和不一致基因表达谱限制其应用18。最近, 永生化的神经节神经元细胞系来源于大鼠 (50B11)19和小鼠 (MED17.11)20, 适合用于药物靶向研究的高通量筛。然而, 这些细胞系的基因表达谱尚未完成。因此, 将这些永生化细胞与感官神经元进行比较的验证实验仍在进行中。
NPFFR2 是在背节和移位的神经节中合成的, 在脊髓后角21的感觉神经端。本文提供了一种培养腰椎背根细胞的方法, 并对其进行 NPFFR2 激动剂的治疗, 以诱导神经递质、CGRP 和 SP 的释放。利用 NPFFR2 小干扰 RNA (siRNA) 对 NPFFR2 的依赖性进行进一步测试, 可将其转染到培养的背根细胞中。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

背根神经节包含感觉神经元细胞体。这类神经元是伪单极, 有两个轴突, 支配周围组织, 如皮肤, 肌肉和内脏器官, 以及中枢神经系统的脊髓背角。感官神经元传递躯体感觉, 包括触摸, 疼痛, 热, 和本体的感觉。因此, 根根背根培养被广泛用于研究伤害的细胞机制、感官神经元的生理功能和神经发育。培养神经元可用于电生理、信号传导、神经递质释放或钙成像等研究。与根背节的主要文化, 科学家可能培养分离的背节神经元, 以监测在单个或多个细胞的生物化学变化, 克服许多与体内实验相关的限制。与商用神经节-杂交瘤细胞系或永生化背节神经元细胞系相比, 原代细胞的组成和性质更类似于组织中的感觉神经元。然而, 由于受培养的背根细胞的数量有限, 可以从单一的动物分离, 很难为药物靶向研究进行高通量的屏幕。本文介绍了背根背根的收集和培养过程。此外, 我们展示了用神经肽 FF 受体2型 (NPFFR2) 激动剂对培养的背根节细胞进行治疗, 以诱导释放肽类神经递质 (降钙素基因相关肽 (CRGP) 和 P 物质 (SP))。

大鼠腰椎节段神经元, 培养在一个24井板, 生长在培养基与额外的阿糖 C, 以抑制胶质细胞增殖和 NGF 支持神经元生长。观察了活背根细胞的形态。如图 3所示, 单个神经元的细胞体在1天的盘子底部附着, 并被选择观察。轴突生长由天1–3监测。胶质细胞复制和扩展的过程包围的感官神经元的细胞体。在另一种文化中, CGRP 蛋白被染色, 以揭示神经元的形状?...

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Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

背根神经节的原代培养常用于研究感官神经元的生理功能或病理相关事件。在这里, 我们展示了使用腰椎背根神经节的文化, 以检测神经递质的释放后神经元肽 FF 受体2型刺激与选择性激动剂。

背根神经节分离与原代培养对神经递质释放的研究

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

这种方法有助于回答感官研究领域的一些关键问题，如外周感知。这一技术的主要优点是，用最模拟生理状况的模型来研究感觉神经元的细胞机制。从两到三周大的老鼠的躯干中收集腰椎根。首先沿着脊柱的两侧进行两次切口，一次横向切割，以标记腰椎的脊椎范围。然后，使用骨切钳去除脊柱的后肌。接下来，切除椎骨的后肢，露出脊髓。然后使用解剖剪刀和钳子切除脊髓。通过计算上一根肋骨的椎骨来识别腰椎 DRG。此图显示了椎骨的位置。使用微型剪刀收集从 L1 到 L6 的 12 个双边腰椎 DRG。去除任何附加的神经元纤维，以提高培养的纯度。将每个腰椎 DRG 转移到一个 35 毫米培养皿中，其中含有两毫升无冰冷血清介质。将含有 DRG 的 35 毫米培养皿转移到层罩中，用移液器用无血清介质清洗 DRG 三次。使用无菌钳子将 DRG 移动到包含两毫升无菌胶原酶 1A 类型的新的 35 毫米培养盘中。将组织放在胶原酶溶液中，在37摄氏度的组织培养箱中放置30分钟，开始分离细胞。孵育后，去除胶原酶溶液，在汉克平衡盐溶液的两毫升中洗涤性干酶三次。接下来，在培养皿中加入两毫升预预热0.05%的三辛EDTA，并像之前一样在培养箱中消化30分钟的 DRG。消化后，使用玻璃移液器将含 DRG 溶液的两毫升转移到 15 毫升离心管中。DRG 可能会粘在玻璃移液器上，因此应小心执行此步骤。通过将含 DRG 溶液留在玻璃移液器的锥度端，并缓慢地（但无需暂停）将溶液转移到离心管中，可以避免实际损失。接下来，在摄氏4度下将溶液在290倍G下离心5分钟。离心后，去除上流剂，再加入两毫升无血清介质，重新下垂 DRG。重复洗涤两次，使用两毫升预受的培养培养，在最后离心后重新暂停组织。使用先前准备的无菌火焰抛光移液器手动三角化 DRG 约 60 次。接下来，从CO2培养箱中去除一个涂有1毫升培养基的聚L-Lysine涂层24井板，其中含有1毫升培养基。从菜中吸出孵化的培养培养。将 DRG 细胞从一只大鼠中播种到四口井中。这样，每井的播种密度约为50万个细胞。第二天，用10微摩尔AraC和每毫升NGF100毫微克取代培养剂。在细胞电镀后的第三天，将培养素更改为0.5毫升的预预热无血清培养，并孵育一小时。在孵育过程中，在无RNase水的微升中加入50毫摩尔siRNA，每转染12.5微升无血清介质。然后移液器2.5微升转染试剂进入10微升的无血清培养剂，每次转染。通过移液器混合两种溶液，并在室温下孵育这种混合转染溶液 10 分钟。10分钟后，将转染溶液加入含有 DRG 的 24 孔板的孔中，轻轻摇动混合。经过6个小时的孵育，在每毫升NGF的每个细胞井中加入0.5毫升培养，20%FBS、10微摩尔阿拉克和100毫微克。最后，在37摄氏度的CO2培养箱中再孵育36小时。在电镀后的第六天和siRNA转染后72小时，将培养剂更改为200微升无血清介质。经过30分钟的孵育，加入一微升的刺激化学物质，通过移液轻轻混合。此处使用 NPFFR2 激动剂、dNPA 和相应的车辆。在所需期间孵育后，从培养皿中收集培养基，并在5000次G下离心，在4摄氏度下5分钟，去除任何悬浮杂质。从离心中收集上流液，并根据需要用磷酸盐缓冲盐水稀释。使用市售酶免疫测定试剂盒测定神经递质水平。第一天，箭头指示的单个神经元的细胞体附着在盘子的底部。还存在箭头指示的胶质单元格。胶质细胞复制和扩展的过程，以包围感觉神经元的细胞体第二天，这个过程甚至更突出的第三天。在另一种培养文化中，CGRP蛋白被染色，以揭示神经元的形状。CGRP蛋白染色出现在感觉神经元的细胞质和轴突中。神经元和胶质细胞的核形态在染色达皮时是截然不同的。神经元的核比胶质细胞更大、更圆。相比之下，胶质的核形状更椭圆形。一旦掌握，这项技术可以在两个半小时，如果它执行得当。看完这段视频后，你应该对如何解剖和培养后根结节有一个良好的理解，并用它来研究潜在的生理功能的工具。不要忘记，使用原细胞比使用常规细胞系困难得多，而执行这些程序时，温和总是最好的方法。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

染色质免疫沉淀从以下轴索损伤的背根神经节组织

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

科研

神经科学

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

实时成像背根轴突后根切断术

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

培养成年的背根神经节神经元轴突再生的遗传研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

背根神经节神经元和区分脂肪干细胞：一种<em&gt;在体外</em&gt;共培养模型来研究周围神经再生

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

尼古丁诱导的钙信号和神经递质的释放了沿着腹侧海马轴突实时成像

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

一种方法来提高背根神经节的对齐和髓鞘

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

背根神经节的啮齿动物的脊髓和隔离的液压挤压

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

背根神经节内注射和背根挤压伤为感官轴突再生模型

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

多尾根结鱼巨噬细胞的快速隔离

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

通过免疫淘选富集成年小鼠背根神经节神经元培养物

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...