Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Vi takker Dr. M. Calkins for engelske redigering. Dette arbejde blev støttet af Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung Universitet, sund aldring Research Center (EMRPD1G0171) og ministeriet for videnskab og teknologi (105-2320-B-182-012-MY2).

Alle metoder, der beskrives heri, at bruger forsøgsdyr blev godkendt af institutionelle Animal Care og bruge udvalg (IACUC) af Chang Gung Universitet (CGU 13-014).
1. indsamle lumbal DRG fra eksperimentelle rotter
<ol><li>Bruge 2 til 3 uger gamle Sprague-Dawley (SD) rotter for lumbal DRG samling. Bemærk: DRG neuroner indsamlet fra rotter over 4 uger vokser ikke godt under kultur betingelserne beskrevet heri.</li>
	<li>Sterilisere alle kirurgiske instrumenter i en autoklave.</li>
	<li>Be...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+nociception.">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li><li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain.">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li><li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperalgesia+and+allodynia:+peripheral+mechanisms.">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain.">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat.">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li><li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain:+an+in+vivo+and+in+vitro+study.">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).</li><li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain.">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li><li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch.">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li><li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons:+A+transcriptomic+comparison.">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li><li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line.">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li><li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors.">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).</li><li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn.">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

I denne artikel, vi vise indsamling, enzym-dissociation og kultur af rotte lumbal DRG. Med neurotrope støtte fra NGF udvidet axoner af DRG neuroner senest 3 dage efter celle såning. De udvidede axoner var klart observerbare efter celler blev farvet for CGRP protein, der er syntetiseret i celle soma og transporteret langs axon fibre. Processerne af satellit celler også udvidet, så disse delende glial celler at omgive neuronerne i dage. De primære DRG celler dyrkes af denne protokol er egnet til undersøgelser af de c...

Celle organer af sensoriske neuroner er indeholdt i DRG. Disse neuroner er pseudo unipolar og innerverer både perifere væv og centralnervesystemet. De perifere nerveender af sensoriske neuroner findes i muskel, hud, indre organer og knogler, blandt andre væv. De sender perifere sensation signaler til nerve endelser i spinal dorsal Hornet og signaler sendes derefter til hjernen via forskellige opstigende veje af somatiske sensation1,2. Somatiske sensation gør det muligt for kroppen til at føle sig (dvs., touch, smerte og termisk fornemmelser) og opfatte bevægelse og rumlig orientering (proprioceptive fornemmelser)1,3. Der er fire underklasser af primære afferente axoner, herunder gruppe I (Aα) fibre, der reagerer på proprioception af skeletmuskulatur, gruppe II (Aβ) fibre, der reagerer på mechanoreceptors af huden, og gruppe III (Aδ) og gruppe V C fibre, der reagerer på smerte og temperatur. Kun C fibrene er unmyelinated, mens resten er myelinerede til forskellige grader.
Nociceptorer er primære sensoriske neuroner, som aktiveres ved skadelige stimuli (mekanisk, termisk og kemisk stimulation), der bærer risikoen for vævsskader. Disse neuroner er sammensat af myelinerede Aδ-fibre og unmyelinated C fibre1,4. Aδ-fibre express receptorer for nerve vækstfaktor (NGF, trkA receptor), CGRP og SP. C fibre er klassificeret som enten peptidergic og ikke-peptidergic C-fibre. På den anden side express den ikke-peptidergic C fibre receptorer for glial-afledte neurotrope faktor (GDNF, RET og GFR receptorer), isolectin IB4 og ATP-gated ion-kanal subtype (P2X3)5,6,7. Nociceptorer kan skelnes ved ekspression af ionkanaler og aktiveres af neurotrope faktorer, cytokiner, neuropeptider, ATP eller andre kemiske forbindelser8. Ved stimulation, kan neurotransmittere, herunder CGRP, SP og glutamat frigives fra sensorisk neuron terminaler i spinal dorsal Hornet sende nociceptive signaler2. DRG er ikke kun består af neuroner, men også indeholder satellit glial celler. Satellit celler omgiver de sensoriske neuroner og give mekanisk og metaboliske støtte9,10. Det er interessant, at der er en voksende mængde af beviser der angiver, at satellit glial celler i DRG kan være involveret i reguleringen af smerte sensation11.
Sensoriske neuroner er blevet rapporteret til at være mest ofte primære neuronale celler12 og har været udnyttet til Elektrofysiologi, signaltransduktion og neurotransmitter frigivelse undersøgelser. De er også almindeligt anvendt til at undersøge de cellulære mekanismer af neuronal udvikling, inflammatorisk smerte, neuropatiske smerter, hud følelse (som kløe) og axon udvækst12,13,14,15. DRG primære kulturer kan være kulturperler som dissocierede neuroner til at vurdere biokemiske ændringer i én eller flere celler, at lade forskere at udføre undersøgelser, der ikke kan udføres i eksperimentelle emner. For nylig, DRG var med held kulturperler fra menneskelige organdonorer, som kan få stor gavn Translationel forskning16. Sensoriske neuroner kan på den anden side også være kulturperler, som DRG explants. DRG explants bevare den oprindelige væv arkitektur af neuroner, herunder Schwann celler og satellit glial celler, og er især nyttig til at studere samspillet mellem neuronal og ikke-neuronale celler17. DRG primære kulturer kan tilberedes nemt inden for 2,5 h. Celle sammensætning og egenskaber er meget reflekterende af kilde DRG, og som sådan er specifikke DRG (lumbal eller brysthule DRG) kan afhentes efter eksperimentel krav. Kulturer af embryonale og neonatal DRG neuroner kræver NGF at overleve og fremkalde axon udvækst, men kulturer af voksne neuroner kræver ingen tilføjelsen af neurotrope faktorer til media12,17. Der er også kommercielt tilgængelige DRG-hybridom cellelinjer som Sd7/23 og F11, der ikke kræver anvendelse af forsøgsdyr. Men manglen forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1) udtryk (en vigtig markør for små sensoriske nociceptive neuroner) og inkongruente gen expression profiler begrænse deres programmer18. For nylig, udødeliggjort DRG neuronal celle linjer er afledt fra rotte (50B11)19 og mus (MED17.11)20, som er egnet til brug i høj overførselshastighed skærme for drug målretning undersøgelser. Genekspression profilering for disse cellelinjer har dog endnu skal udføres. Validering eksperimenter sammenligne disse udødeliggjort celler til sensoriske neuroner er således stadig pågår.
NPFFR2 er syntetiseret i DRG og omplantes til sensoriske nerve terminalerne i spinal dorsale horn21. I denne artikel leverer vi en protokol for dyrkning af lumbal DRG celler og behandle dem med en agonist for NPFFR2 til at fremkalde frigivelsen af neurotransmittere, CGRP og SP. Afhængigheden af NPFFR2 er yderligere testet ved hjælp af NPFFR2 lille interfererende RNA (siRNA), som kan være transfekteret i kulturperler DRG celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

Dorsalrodsganglier (DRG) indeholder celle organer af sensoriske neuroner. Denne type af neuron er pseudo unipolære, med to axoner, der innerverer perifere væv, såsom hud, muskel og viscerale organer samt det centrale nervesystem spinal dorsale horn. Sensoriske neuroner sende somatiske sensation, herunder berøring, smerte, termiske og proprioceptive fornemmelser. Derfor, DRG primære kulturer er almindeligt anvendt til at undersøge de cellulære mekanismer af nociception, fysiologiske funktioner af sensoriske neuroner, og neurale udvikling. De kulturperler neuroner kan anvendes i undersøgelser, hvor Elektrofysiologi, signaltransduktion, neurotransmitter frigivelse eller calcium billeddannelse. Med DRG primære kulturer, forskere kan kultur dissocierede DRG neuroner for at overvåge biokemiske ændringer i én eller flere celler, at overvinde mange af begrænsningerne tilknyttet i vivo eksperimenter. I forhold til kommercielt er tilgængelige DRG-hybridom cellelinjer eller udødeliggjort DRG neuronal cellelinjer, sammensætning og egenskaber af de primære celler meget mere ligner sensoriske neuroner i væv. På grund af det begrænsede antal kulturperler DRG primærelementer, der kan isoleres fra et enkelt dyr, er det imidlertid vanskeligt at udføre høj overførselshastighed skærme for drug målretning undersøgelser. I den nuværende artikel beskrives procedurer for DRG samling og kultur. Derudover viser vi behandlingen af kulturperler DRG celler med en agonist neuropeptid FF receptor type 2 (NPFFR2) til at fremkalde frigivelsen af peptid neurotransmittere (calcitonin gen-relateret peptid (CRGP) og substans P (SP)).

Rotte lumbal DRG neuroner, kulturperler i en 24-godt plade, blev dyrket i dyrkningsmediet med yderligere Ara-C til at hæmme glial celleproliferation og NGF støtte neuronal vækst. Morfologi af levende DRG celler blev observeret. Som vist i figur 3, var cellen kroppen af en enkelt neuron fastgjort i bunden af et fad på dag 1 og markeret til observation. Axon vækst blev overvåget fra dag 1-3. De gliaceller dubleres og udvidet processer at omgive cellen kro...

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsalrodsganglier (DRG) primære kulturer er ofte bruges til at studere fysiologiske funktioner eller patologi-relaterede begivenheder i sensoriske neuroner. Her, demonstrere vi brugen af lumbal DRG kulturer til at registrere frigivelse af neurotransmittere efter neuropeptid FF receptor type 2 stimulation med en selektiv agonist.

Dorsalrodsganglier Isolation og primære kultur at studere Neurotransmitter frigivelse

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål inden for sensorisk forskning, f.eks. Den største fordel ved denne tekniske er, at undersøge den cellulære mekanisme af sensoriske neuroner med den model, der mest simulerer til fysiologisk tilstand. Saml lænde dorsale rodganglier fra stammen af en to til tre uger gammel rotte.Begynd med at lave to snit langs siderne af rygsøjlen og et lateralt snit for at markere lændehvirvelsøjlens rostrale omfang. Derefter, bruge knogle-skæring kraftbecer til at fjerne rygmuskler i rygsøjlen. Dernæst fjerne rygdelen af ryghvirvler og udsætte rygmarven.Brug derefter dissektion saks og forrængebånd til at fjerne rygmarven. Identificer lændet DRG ved at tælle ryghvirvler fra det sidste ribben. Dette diagram viser ryghvirvlerne.Brug mikro saks til at indsamle de 12 bilaterale lænde DRG fra L1 til L6. Fjern eventuelle vedhæftede neuronal fibre til at forbedre renheden af kulturen. Overfør hver lumbal DRG til en 35 millimeter dyrnskål, der indeholder to milliliter iskoldt serumfrit medium. Den DRG-holdige 35 millimeter skål overføres til en laminarhætte, og DRG vaskes med serumfrit medium tre gange med pipette.Brug sterile pincet til at flytte DRG'erne til en ny 35 millimeter kulturskål indeholdende to milliliter steril kollagenase type 1A. Placer vævet i kollagenopløsning i 37 grader Celsius vævskultur inkubator i 30 minutter for at begynde dissociation af cellerne. Efter inkubationen fjernes kollagensopløsningen, og DRG vaskes tre gange i to milliliter af Hanks afbalancerede saltopløsning.Dernæst tilsættes to milliliter forvarmet 0,05% trypsin EDTA til skålen, og fordøje DRG i inkubatoren i 30 minutter som før. Efter fordøjelsen skal du bruge en glaspipette til at overføre de to milliliter DRG-holdige opløsning til et 15 milliliter centrifugerør. DRG kan holde sig til glaspipetten, så dette trin skal udføres med omhu.Det faktiske tab kan undgås ved at holde den DRG-holdige opløsning i den koniske ende af glaspipetten og overføre opløsningen til centrifugerøret langsomt, men uden pause. Dernæst centrifuge løsningen ved 290 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering fjernes supernatanten, og der tilsættes yderligere to milliliter serumfrit medium for at opsælle DRG.Vasken gentages to gange ved hjælp af to milliliter det forvarmede kulturmedium for at opslænge vævet efter den endelige centrifugering. Brug den tidligere forberedte sterile flammepolerede pipette til manuelt at triturere DRG ca. 60 gange. Dernæst skal du fjerne en poly-L-lysin belagt 24 godt plade, der indeholder en milliliter kultur medium pr brønd fra CO2-inkubatoren.Inspirer det inkuberede kulturmedium fra skålen. Frø DRG celler fra en rotte i fire af brøndene. Dette giver en såningstæthed på ca. 500.000 celler pr. brønd.Den følgende dag erstattes kulturmediet med medium suppleret med 10 mikromolar AraC og 100 nanogram pr. milliliter NGF. På dag tre efter celleplettering skal mediet skiftes til 0,5 milliliter præwarmed serumfrit medium og inkuberes i en time. Under inkubationen tilsættes 50 millimolar siRNA i en mikroliter RNase-frit vand til 12,5 mikroliter serumfrit medium pr. transfektion.Derefter pipettes 2,5 mikroliter transfektion reagens i 10 mikroliter af serumfrit medium for hver transfektion. Bland begge opløsninger med pipette, og inkuber denne blandede transfektionsopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter 10 minutter tilsættes transfektionsopløsningen i brøndene på den DRG-holdige 24 brøndplade, og den blandes ved forsigtigt at ryste.Efter en seks timers inkubation tilsættes 0,5 milliliter kulturmed 20%FBS, 10 mikromolar AraC og 100 nanogram pr. milliliter NGF i hver cellebly. Endelig inkubere DRG i en 37 grader Celsius CO2 inkubator i yderligere 66 timer. På dag seks efter plating, og 72 timer efter siRNA transfektion, ændre kultur medium til 200 mikroliter af serum-fri medium.Efter en 30 minutters inkubation tilsættes en mikroliter af stimulationskemikaliet og blandes forsigtigt ved pipettering. NPFFR2 agonist, dNPA og det tilsvarende køretøj bruges her. Efter inkubering i den krævede periode, indsamle kultur medium fra kultur parabol, og centrifuge på 5000 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius at fjerne eventuelle suspenderede urenheder.Supernatanten opsaml supernatanten fra centrifugeringen, og fortyndes med fosfatbufferet saltvand efter behov. Assay niveauet af neurotransmittere med kommercielt tilgængelige enzym immunoassay kits. På dag ét, celle kroppen af en enkelt neuron angivet med pilen var fastgjort på bunden af en skål.En gliacelle, der er angivet med en pilespids, er også til stede. Gliacellerne duplikerede og udvidede processer til at omgive cellekroppen af den sensoriske neuron på dag to, en proces, der var endnu mere fremtrædende på dag tre. I en anden kultur, CGRP protein blev plettet til at afsløre formen af neuroner.CGRP protein farvning vises i cytoplasmaet og axoner af sensoriske neuroner. De nukleare morfologier af neuroner og gliaceller er forskellige, når farves med DAPI. Neuronerne har en større og mere afrundet kerne end gliaceller.Til sammenligning er kerner af glia mere ovale i form. Når mestrer, kan denne teknik gøres i to og en halv time, hvis det udføres korrekt. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan dissekere og kultur dorsale rod ganglion, og bruge det som et redskab til at undersøge underliggende fysiologiske funktioner.Glem ikke, at arbejde med primære celler kan være meget vanskeligere end at arbejde med almindelige cellelinjer, og at være blid er altid den bedste måde, når du udfører disse procedure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk Undersøgelse af Axon Regeneration med dyrkede voksne dorsale rodganglie neuroner

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrodsganglier neuroner og differentierede adipøst afledte stamceller: An<em&gt; In vitro</em&gt; Co-kultur Model til Uddannelse Perifere nerveregenerering

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging af Nikotin induceret Calcium Signaling og neurotransmitterfrigivelse Langs ventrale Hippocampale Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

En tilgang til Forøge Justering og myelination af Dorsal rodganglieneuroner

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulisk Ekstrudering af rygmarven og Isolering af dorsalrodsganglier i Gnavere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsalrodsganglion Injektion og Dorsal Root Crush Skade som en model for Sanse Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Hurtig isolering af dorsale Rodganglion makrofager

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Berigelse af voksne musedorsalrodganglier neuronkulturer ved immunpanorering

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...