Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Wij danken Dr. M. Calkins voor Engelse bewerken. Dit werk werd gesteund door de Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung Universiteit, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) en Ministerie van wetenschap en technologie (105-2320-B-182-012-MY2).

Alle hierin beschreven methoden die gebruikmaken van proefdieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruiken Comité (IACUC) van Chang Gung Universiteit (CGU 13-014).
1. Verzamel lumbale DRG van experimentele ratten
<ol><li>2 tot 3 weken oude Sprague-Dawley (SD) ratten voor lumbale DRG-collectie gebruiken Opmerking: DRG neuronen van ratten verzameld van meer dan 4 weken oud groeien niet goed onder de voorwaarden van de cultuur die hierin worden beschreven.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+nociception.">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li><li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain.">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li><li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperalgesia+and+allodynia:+peripheral+mechanisms.">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain.">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat.">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li><li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain:+an+in+vivo+and+in+vitro+study.">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).</li><li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain.">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li><li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch.">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li><li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons:+A+transcriptomic+comparison.">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li><li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line.">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li><li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors.">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).</li><li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn.">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

In dit artikel, tonen we de collectie enzym-dissociatie en de cultuur van rat lumbale DRG. Met de steun van de neurotrophic van de NGF uitgebreid de axonen van neuronen van de DRG binnen 3 dagen na het zaaien van de cel. De uitgebreide axonen waren duidelijk waarneembare nadat cellen werden gekleurd voor CGRP eiwit, die wordt gesynthetiseerd in de cel soma en vervoerd worden langs de axon vezels. De processen van satelliet cellen ook uitgebreid, waardoor deze scheidslijn gliale cellen te omringen de neuronen binnen dagen...

De organen van de cel van de sensorische neuronen bevinden zich in de Deutsche Reichsbahn. Deze neuronen zijn pseudo-unipolaire en innervate zowel perifere weefsels en het centrale zenuwstelsel. De perifere zenuwuiteinden van de sensorische neuronen zijn gevonden in de spier, huid, viscerale organen en bot, onder andere weefsels. Zij zenden perifere sensatie signalen aan de zenuw uitgangen in de spinale dorsale hoorn en de signalen worden vervolgens doorgestuurd naar de hersenen via verschillende oplopende trajecten voor somatische sensatie1,2. Somatische sensatie maakt het lichaam te voelen (dat wil zeggen, aanraking, pijn en thermische gewaarwordingen) en het waarnemen van verkeer en ruimtelijke oriëntatie (proprioceptief sensaties)1,3. Er zijn vier subklassen van primaire afferent axonen, met inbegrip van groep I (Aα) vezels die inspelen op de proprioceptie van skeletspieren, groep II (Aβ) vezels die inspelen op de mechanoreceptors van de huid, en groep III (Aδ) en groep V C vezels die inspelen op de pijn en temperatuur. Alleen de C vezels zijn unmyelinated, terwijl de rest zijn myelinated op verschillende graden.
Nociceptors zijn de primaire sensorische neuronen, die worden geactiveerd door schadelijke stimuli (mechanische, thermische en chemische stimulatie) die potentieel voor weefselschade dragen. Deze neuronen zijn samengesteld uit myelinated Aδ vezels en unmyelinated C vezels1,4. De vezels van de Aδ express de receptoren voor zenuw groeifactor (NGF, trkA receptor), CGRP en SP. De C-vezels worden geclassificeerd als ofwel peptidergic en niet-peptidergic C-vezels. Aan de andere kant, express de niet-peptidergic C vezels de receptoren voor gliale-afgeleide neurotrophic factor (GDNF, RET en GFR-receptoren), isolectin IB4 en ATP-gated ion kanaal subtype (P2X3)5,6,7. Nociceptors kan onderscheiden door de expressie van ionenkanalen en geactiveerd door neurotrophic factoren, cytokines, neuropeptides, ATP of andere chemische verbindingen8. Bij stimulatie, worden neurotransmitters, waaronder CGRP, SP en glutamaat vrijgesteld van sensorisch neuron terminals in de spinale dorsale hoorn voor het verzenden van Nociceptieve signalen2. Deutsche Reichsbahn zijn niet alleen bestaat uit neuronen, maar bevatten ook satelliet gliacellen. Satelliet cellen rondom de sensorische neuronen en bieden ondersteuning voor mechanische en metabole9,10. Interessant, is er een groeiend lichaam van aanwijzingen waaruit blijkt dat satelliet gliale cellen in de DRG kunnen worden betrokken bij de regulering van pijn sensatie11.
Sensorische neuronen zijn bij de meest vaak gebruikte primaire neuronale cellen12 en hebben gebruikt voor electrofysiologie, signaaltransductie en neurotransmitter release studies gemeld. Ze worden ook vaak gebruikt om te verkennen van de cellulaire mechanismen van neuronale ontwikkeling, inflammatoire pijn, neuropathische pijn, gevoel van de huid (zoals jeuk) en axon uitgroei12,13,14,15. Deutsche Reichsbahn primaire culturen kunnen worden gekweekt als gedissocieerde neuronen te beoordelen van biochemische veranderingen in één of meerdere cellen, zodat wetenschappers voor het uitvoeren van studies die in experimentele onderwerpen kunnen niet worden uitgevoerd. Onlangs, DRG werden met succes gekweekt uit menselijke orgaandonoren die misschien veel profijt hebben van translationeel onderzoek16. Aan de andere kant, kunnen sensorische neuronen ook worden gekweekt zoals DRG explants. De DRG explantaten behouden de oorspronkelijke architectuur van het weefsel van de neuronen, met inbegrip van cellen van Schwann en satelliet gliale cellen, en zijn met name nuttig zijn te onderzoeken van interacties tussen neuronale en non-neuronale cellen17. Deutsche Reichsbahn primaire culturen kunnen gemakkelijk worden voorbereid binnen 2,5 uur. De cel samenstelling en eigenschappen zijn weerspiegelend van de bron van de Deutsche Reichsbahn, en als zodanig, specifieke DRG (lumbale of thoracale DRG) kan worden verzameld volgens experimentele eisen. Culturen van embryonale en neonatale DRG neuronen vereist NGF om te overleven en induceren axon uitgroei, maar culturen van volwassen neuronen vereisen niet de toevoeging van neurotrophic factoren de media12,17. Er zijn ook commercieel beschikbare DRG-hybridoma cellijnen zoals ND7/23 en F11, die niet dat het gebruik van proefdieren eisen. Echter het gebrek aan de potentiële catie van voorbijgaande receptor onderfamilie V lid 1 (TRPV1) kanaal expressie (een belangrijke marker voor kleine zintuiglijke Nociceptieve neuronen) en elkaar gene expressieprofielen beperken hun toepassingen-18. Onlangs, vereeuwigd DRG neuronale cel lijnen zijn afgeleid van de rat (50B11)19 en muis (MED17.11)20, die geschikt zijn voor gebruik in high-throughput schermen voor drug targeting studies. Genexpressie profilering voor deze cellijnen moet echter nog worden uitgevoerd. De experimenten van de validatie vergelijken deze vereeuwigd cellen te sensorische neuronen zijn dus nog aan de gang.
NPFFR2 wordt gesynthetiseerd in de DRG en translocated aan op de ingangen van de sensorische zenuw in de spinale dorsale hoorn21. In dit artikel bieden wij een protocol voor het kweken van lumbale DRG-cellen en hen te behandelen met een agonist van NPFFR2 voor het opwekken van de vrijlating van neurotransmitters, CGRP en SP. De afhankelijkheid van NPFFR2 is verder getest met behulp van NPFFR2 Klein Mengend RNA (siRNA), die kan zijn transfected in de gekweekte cellen van de Deutsche Reichsbahn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

Dorsal root ganglia (DRG) bevatten cel organen van de sensorische neuronen. Dit type van neuron is pseudo-unipolaire, met twee axonen die perifere weefsels, zoals huid, spier en viscerale organen, alsmede de spinale dorsale Hoorn van het centrale zenuwstelsel innervate. Sensorische neuronen zenden somatische sensatie, met inbegrip van de aanraking, pijn, thermische en proprioceptieve sensaties. Daarom worden DRG primaire culturen veel gebruikt om te studeren de cellulaire mechanismen van Nociceptie, fysiologische functies van de sensorische neuronen, en neurale ontwikkeling. In studies waarbij electrofysiologie, signaaltransductie, neurotransmitter release of calcium beeldvorming kunnen de beschaafde neuronen worden toegepast. Met DRG primaire culturen, wetenschappers kunnen cultuur gedissocieerde DRG neuronen als u wilt controleren van biochemische veranderingen in één of meerdere cellen, het overwinnen van veel van de beperkingen die zijn gekoppeld aan in vivo experimenten. Ten opzichte van commercieel zijn beschikbare DRG-hybridoma cellijnen of vereeuwigd DRG neuronale cellijnen, de samenstelling en eigenschappen van de primaire cellen veel meer vergelijkbaar met de sensorische neuronen in weefsel. Vanwege het beperkt aantal gekweekte DRG primaire cellen die geïsoleerd uit een enkel dier worden kunnen, is het echter moeilijk uit te voeren van high-throughput schermen voor drug targeting studies. In het huidige artikel, worden procedures voor het verzamelen van de Deutsche Reichsbahn en cultuur beschreven. Daarnaast tonen we de behandeling van gekweekte DRG cellen met een agonist van neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) voor het opwekken van de release van peptide neurotransmitters (calcitonine-gen-gerelateerde peptide (CRGP) en stof P (SP)).

Rat lumbale DRG neuronen, gekweekt in een 24-well plaat, zijn geteeld in een kweekvloeistof met extra Ara-C voor de remming van gliale celproliferatie en NGF neuronale groei te ondersteunen. De morfologie van levende cellen van de DRG werd waargenomen. Zoals blijkt uit Figuur 3, was de cel lichaam van een enkel neuron aangesloten op de bodem van een schotel op dag 1 en geselecteerd voor observatie. Axon groei werd gecontroleerd vanaf dag 1 – 3. De gliacelle...

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release (Video) | JoVE

Dorsal root ganglia (DRG) primaire culturen worden vaak gebruikt om te studeren fysiologische functies of pathologie-gerelateerde gebeurtenissen in de sensorische neuronen. Wij tonen hier, het gebruik van lumbale DRG culturen te detecteren het vrijkomen van neurotransmitters nadat neuropeptide FF receptor 2 stimulatie met een selectieve agonist.

Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van sensorisch onderzoek te beantwoorden, zoals perifere nociception. Het belangrijkste voordeel van deze technische is dat het onderzoeken van het cellulaire mechanisme van sensorische neuronen met het model dat de meeste simuleert tot fysiologische conditie. Verzamel de lendenen rugwortel ganglia uit de stam van een twee tot drie weken oude rat.Begin met het maken van twee sneden langs de zijkanten van de wervelkolom en een laterale snede om de rostrale omvang van de lumbale wervelkolom te markeren. Gebruik vervolgens botsnijdende tangen om de rugspieren van de wervelkolom te verwijderen. Verwijder vervolgens het dorsale gedeelte van de wervels en stel het ruggenmerg bloot.Gebruik vervolgens dissectie schaar en tangen om het ruggenmerg te verwijderen. Identificeer de lumbale DRG door wervels van de laatste rib te tellen. Dit diagram toont de wervelposities.Gebruik een microschaar om de 12 bilaterale lumbale DRG van L1 naar L6 te verzamelen. Verwijder alle bijgevoegde neuronale vezels om de zuiverheid van de cultuur te verbeteren. Breng elke lumbale DRG over op een 35 millimeter kweekschotel met twee milliliter ijskoud serumvrij medium. Breng de DRG-bevattende 35 millimeter schotel in een laminaire kap, en was de DRG met serum-vrij medium drie keer door pipet.Gebruik steriele pincetten om de DRGs te verplaatsen naar een nieuwe 35 millimeter kweekschotel met twee milliliter steriele collagenase type 1A. Plaats het weefsel in collagenase oplossing in de 37 graden Celsius weefsel cultuur incubator gedurende 30 minuten om te beginnen met dissociatie van de cellen. Na de incubatie, verwijder de collagenase oplossing en was de DRG drie keer in twee milliliter van evenwichtige zout hank's oplossing.Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde 0,05% trypsin EDTA toe aan de schotel en vert verteer de DRG in de couveuse 30 minuten zoals voorheen. Gebruik na de spijsvertering een glazen pipet om de twee milliliter DRG-bevattende oplossing over te brengen naar een 15 milliliter centrifugebuis. De DRG kan vasthouden aan de glazen pipet, zodat deze stap moet worden uitgevoerd met zorg.Het werkelijke verlies kan worden voorkomen door de DRG-bevattende oplossing in het tappeneinde van de glazen pipet te houden en de oplossing langzaam maar zonder pauze in de centrifugebuis te brengen. Vervolgens centrifuge de oplossing op 290 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Na het centrifugeren, verwijder de supernatant en voeg nog eens twee milliliter serumvrij medium toe om de DRG opnieuw op te hangen.Herhaal de was twee keer, met behulp van twee milliliter van voorverwarmde kweekmedium om het weefsel na de laatste centrifugatie opnieuw op te hangen. Gebruik de eerder voorbereide steriele vlam gepolijste pipet om de DRG ongeveer 60 keer handmatig te tritureren. Verwijder vervolgens een poly-L-lysine gecoate 24 putplaat met één milliliter kweekmedium per put uit de CO2-incubator.Aspirate de geïncubeerde cultuur medium uit het gerecht. Zaad de DRG cellen van een rat in vier van de putten. Dit geeft een zaaidichtheid van ongeveer 500.000 cellen per put.De volgende dag, vervang het kweekmedium met medium aangevuld met 10 micromolar AraC, en 100 nanogram per milliliter NGF. Verander op dag drie na celbeplating het medium tot 0,5 milliliter voorverwarmd serumvrij medium en broed gedurende een uur in. Voeg tijdens de incubatie 50 millimolar siRNA toe in één microliter RNase-vrij water tot 12,5 microliter serumvrij medium per transfectie.Dan pipette 2,5 microliter van transfectie reagens in 10 microliter van serum-vrij medium voor elke transfectie. Meng beide oplossingen door pipet, en uitbroed deze gemengde transfectie oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 10 minuten de transfectieoplossing toe aan de putten van de DRG-bevattende 24 putplaat en meng door zachtjes te schudden.Na een incubatie van zes uur voegt u 0,5 milliliter kweekmedium toe met 20%FBS, 10 micromolar AraC en 100 nanogram per milliliter NGF in elke put van cellen. Tot slot, inculbateren van de DRG in een 37 graden Celsius CO2 incubator voor nog eens 66 uur. Op dag zes na beplating, en 72 uur na siRNA transfection, verander het kweekmedium tot 200 microliters van serumvrij medium.Na een incubatie van 30 minuten, voeg een microliter van de stimulatie chemische stof en voorzichtig mengen door pipetten. De NPFFR2 agonist, dNPA, en bijbehorende voertuig worden hier gebruikt. Na het uitbroeden voor de vereiste periode, verzamel het cultuurmedium van de cultuurschotel, en centrifuge bij 5000 keer G vijf minuten bij vier graden Van Celsius om om het even welke opgeschorte onzuiverheden te verwijderen.Verzamel de supernatant uit de centrifugatie en verdun indien nodig met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Test de niveaus van neurotransmitters met commercieel beschikbare enzym immunoassay kits. Op dag één, het cellichaam van een enkel neuron aangegeven door de pijl werd bevestigd op de bodem van een schotel.Een gliacel aangegeven door een pijlpunt is ook aanwezig. De gliacellen gedupliceerd en uitgebreid processen om het cellichaam van het sensorische neuron te omringen op dag twee, een proces dat nog prominenter was op dag drie. In een andere cultuur werd CGRP-eiwit gekleurd om de vorm van neuronen te onthullen.CGRP eiwit kleuring verschijnt in het cytoplasma en axonen van zintuiglijke neuronen. De nucleaire morfologieën van neuronen en gliacellen zijn verschillend wanneer ze met DAPI worden gekleurd. De neuronen hebben een grotere en meer afgeronde kern dan gliacellen.Ter vergelijking, de kernen van glia zijn meer ovaal van vorm. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in twee en een half uur als het goed wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe te ontleden en cultuur van de dorsale wortel ganglion, en gebruik het als een instrument om onderliggende fysiologische functies te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met primaire cellen kan veel moeilijker zijn dan het werken met gewone cellijnen, en zacht is altijd de beste manier bij het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury (Video) | JoVE

Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy (Video) | JoVE

Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons (Video) | JoVE

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration (Video) | JoVE

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons (Video) | JoVE

Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons (Video) | JoVE

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents (Video) | JoVE

Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration (Video) | JoVE

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages (Video) | JoVE

Snelle isolatie van dorsale wortel ganglion macrofagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning (Video) | JoVE

Verrijking van volwassen muis dorsale wortel ganglia neuronculturen door immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...