Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Nous remercions le Dr M. Calkins pour l’édition anglaise. Ce travail a été soutenu par le Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), l’Université Chang Gung, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) et ministère de la Science et technologie (105-2320-B-182-012-MY2).

Toutes les méthodes décrites dans les présentes et qui utilisent des animaux de laboratoire ont été approuvés par le Comité utiliser (IACUC) de l’Université Chang Gung (CGU 13-014) et d’institutionnels animalier.
1. Récupérez les DRG lombaire des Rats expérimentaux
<ol><li>Utiliser 2 à 3 rats Sprague-Dawley (SD) de la semaine pour la collecte de DRG lombaire. Remarque : Les neurones DRG recueillies des rats pendant 4 semaines d’âge ne poussent pas bien dans les conditi...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+nociception.">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li><li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain.">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li><li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperalgesia+and+allodynia:+peripheral+mechanisms.">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain.">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat.">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li><li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain:+an+in+vivo+and+in+vitro+study.">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).</li><li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain.">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li><li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch.">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li><li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons:+A+transcriptomic+comparison.">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li><li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line.">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li><li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors.">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).</li><li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn.">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

Dans le présent article, nous démontrons la collection, enzyme-dissociation et la culture des lombaires rat DRG. Avec le soutien de neurotrophique de NGF, les axones des neurones DRG étendu dans les 3 jours après l’ensemencement de la cellule. Les axones prolongées ont été clairement observables après que les cellules ont été colorés pour une protéine CGRP, qui est synthétisé dans le soma de la cellule et transporté le long des fibres de l’axone. Les procédés de cellules satellites aussi étendus, pe...

Les corps cellulaires des neurones sensitifs sont contenues au sein de la DRG. Ces neurones sont Pseudo-aléatoire unipolaires et innervent les tissus périphériques et le système nerveux central. Les terminaisons nerveuses périphériques de neurones sensoriels sont trouvent dans le muscle, peau, organes viscéraux et OS, entre autres tissus. Ils transmettent les signaux de sensation périphériques au nerf terminaisons dans la corne dorsale de la colonne vertébrale et les signaux sont ensuite transmis au cerveau par différentes voies ascendantes de la sensibilité somatique1,2. La sensibilité somatique permet au corps de se sentir (c'est-à-dire, touch, la douleur et les sensations thermiques) et de percevoir le mouvement et l’orientation spatiale (les sensations proprioceptives)1,3. Il y a quatre sous-classes de primaires axones afférents, y compris groupe I fibres (Aα) qui répondent à la proprioception des muscles squelettiques, les fibres II (Aβ) groupe répondant aux mécanorécepteurs de la peau, et le groupe III (Aδ) et fibres de V (C) groupe qui réagissent à la douleur et température. Seulement les fibres C sont amyélinisés, tandis que le reste sont myélinisées à différents degrés.
Nocicepteurs sont des neurones sensitifs primaires, qui sont activés par des stimuli nociceptifs (stimulation mécanique, thermique et chimique) qui portent le risque de lésions tissulaires. Ces neurones sont composées de fibres Aδ myélinisées et amyélinisés C fibres1,4. Les fibres Aδ expriment les récepteurs du facteur de croissance de nerf (NGF, récepteur trkA), CGRP et SP. Les fibres C sont classés comme des fibres C soit peptidergiques et non-peptidergiques. En revanche, les fibres C non-peptidergiques expriment les récepteurs du facteur neurotrophique dérivé du glial (récepteurs GDNF, RET et GFR), isolectine IB4 et ATP-gated ion channel sous-type (P2X3)5,6,7. Nocicepteurs peuvent être distinguées par l’expression des canaux ioniques et activées par facteurs neurotrophiques, cytokines, neuropeptides, ATP ou autres produits chimiques composés de8. Lors de la stimulation, neurotransmetteurs, y compris le CGRP, SP et glutamate peuvent être libérés des terminaisons de neurone sensitif dans la corne dorsale spinale pour transmettre des signaux nociceptifs2. DRG ne sont pas seulement composé de neurones, mais contiennent également des cellules gliales par satellite. Cellules satellites entourent les neurones sensoriels et fournir un appui mécanique et métabolique9,10. Fait intéressant, il y a un nombre croissant de preuves indiquant que les cellules gliales par satellite dans le PMSI pourraient être impliqués dans la régulation de la douleur sensation11.
Les neurones sensoriels ont été signalés le plus fréquemment utilisé des cellules neuronales primaires12 et ont été utilisé pour l’électrophysiologie, transduction du signal et des études de libération neurotransmetteur. Ils sont aussi couramment utilisés pour explorer les mécanismes cellulaires du développement neuronal, douleur inflammatoire, douleur neuropathique, sensation de peau (comme les démangeaisons) et axon excroissance12,13,14,15. Les cultures primaires de DRG peuvent être cultivées comme des neurones dissociés pour évaluer les changements biochimiques dans une ou plusieurs cellules, permettant aux scientifiques d’effectuer des études qui ne peuvent être effectuées chez des sujets expérimentaux. Récemment, DRG provenaient d’échantillons avec succès de donneurs d’organes humains qui pourraient grandement bénéficier de recherche translationnelle16. En revanche, les neurones sensoriels peuvent être aussi cultivées comme explants de DRG. Les explants DRG préserver l’architecture originale de tissu des neurones, y compris les cellules de Schwann et de cellules gliales par satellite et sont particulièrement utiles pour étudier les interactions entre cellules neuronales et non neuronales17. Les cultures primaires de DRG peuvent être facilement établis au sein de 2,5 h. Les propriétés et la composition cellulaire sont hautement réfléchissantes de la source de la DRG, et à ce titre, DRG spécifique (DRG lombaire ou thoracique) peut être collecté selon les demandes expérimentales. Les cultures de neurones DRG embryonnaires et néonatales nécessitent NGF à survivre et à induire l’excroissance des axones, mais les cultures de neurones adultes ne nécessitent pas l’ajout de facteurs neurotrophiques aux médias12,17. Il y a aussi des lignées de cellules DRG-hybridome disponibles dans le commerce comme ND7/23 et F11, qui ne nécessitent pas l’utilisation des animaux d’expérimentation. Toutefois, l’absence du cation potentiel récepteur transitoire canal membre du subfamily V 1 (TRPV1) expression (un marqueur important de petits neurones nociceptifs sensoriels) et les profils d’expression génique incongrues limitent leurs demandes18. Récemment, immortalisé les cellules neuronales de DRG lignes ont été dérivées du rat (50B11)19 et20de souris (MED17.11), qui conviennent à utilisent dans les écrans de haut-débit pour médicament ciblant les études. Toutefois, l’expression de gènes de ces lignées cellulaires n’a pas encore à accomplir. Ainsi, les expériences de validation en comparant ces cellules immortalisées à neurones sensoriels sont toujours en cours.
NPFFR2 est synthétisé dans le PMSI et transloqué aux bornes du nerf sensitif dans la corne dorsale de la moelle21. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour la mise en culture des cellules GRD lombaires et traiter avec un agoniste de NPFFR2 pour provoquer la libération de neurotransmetteurs, CGRP et SP. La dépendance sur NPFFR2 est soumise à d’autres NPFFR2 petits ARN interférents (siARN), qui peut être transfecté dans des cellules cultivées de la DRG.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

Les ganglions rachidiens (DRG) contiennent les corps cellulaires des neurones sensoriels. Ce type de neurone est Pseudo-aléatoire unipolaire, avec deux axones qui innervent les tissus périphériques, tels que peau, muscles et organes viscéraux, ainsi que la corne dorsale de la colonne vertébrale du système nerveux central. Les neurones sensoriels transmettent la sensibilité somatique, y compris le touch, des douleurs, des sensations thermiques et proprioceptives. Par conséquent, les cultures primaires de DRG sont largement utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires de la nociception, fonctions physiologiques des neurones sensoriels et développement neural. Les neurones en culture peuvent être appliquées dans les études impliquant l’électrophysiologie, transduction du signal, la libération des neurotransmetteurs ou imagerie calcique. Avec des cultures primaires de DRG, scientifiques peuvent culture dissociés DRG neurones pour surveiller les modifications biochimiques en seul ou plusieurs cellules, surmonter beaucoup des restrictions associées à des expériences in vivo . Par rapport à commercialement disponible DRG-hybridome lignées cellulaires ou immortalisé des lignées de cellules neuronales DRG, la composition et propriétés des cellules primaires sont beaucoup plus semblables à des neurones sensoriels dans les tissus. Toutefois, en raison du nombre limité de cellules cultivées de primaire DRG qui peuvent être isolés dans un seul animal, il est difficile d’effectuer des écrans de haut-débit pour médicament ciblant les études. Dans l’article actuel, procédures pour collection DRG et la culture sont décrites. En outre, nous montrons le traitement des cellules cultivées de DRG avec un agoniste du type de récepteur neuropeptide FF 2 (NPFFR2) pour induire la libération de neurotransmetteurs peptidiques (peptide lié au gène de la calcitonine (CRGP) et la substance P (SP)).

Les neurones DRG lombaires rat, cultivées dans une plaque 24 puits, ont été cultivées dans un milieu de culture avec l’Ara-C supplémentaire pour inhiber la prolifération des cellules gliales et NGF pour soutenir la croissance neuronale. La morphologie de la vie les cellules GRD a été observée. Comme illustré à la Figure 3, le corps cellulaire d’un neurone unique était attaché au fond d’un plat au jour 1 et sélectionné pour l’observation...

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Les cultures primaires (DRG) les ganglions de la racine dorsale sont fréquemment utilisés pour étudier les fonctions physiologiques ou pathologie imprévisibles dans les neurones sensoriels. Ici, nous montrent l’utilisation de cultures DRG lombaires pour détecter la libération de neurotransmetteurs après le type de récepteur de neuropeptide FF 2 stimulation avec un agoniste sélectif.

Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sensorielle, telles que la nociception périphérique. Le principal avantage de cette technique est que l’étude du mécanisme cellulaire des neurones sensoriels avec le modèle qui simule le plus à l’état physiologique. Recueillir les ganglions de racines dorsales lombaires dans le tronc d’un rat de deux à trois semaines.Commencez par faire deux coupures le long des côtés de la colonne vertébrale et une coupe latérale pour marquer l’étendue rostrale de la colonne lombaire. Ensuite, utilisez des forceps de coupe osseuse pour enlever les muscles dorsal de la colonne vertébrale. Ensuite, retirez la partie dorsale des vertèbres et exposez la moelle épinière.Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection et des forceps pour enlever la moelle épinière. Identifiez le DRG lombaire en comptant les vertèbres de la dernière côte. Ce diagramme montre les positions des vertèbres.Utilisez des micro ciseaux pour recueillir les 12 DRG lombaires bilatéraux de L1 à L6. Enlevez toutes les fibres neuronales attachées pour améliorer la pureté de la culture. Transférer chaque DRG lombaire dans un plat de culture de 35 millimètres contenant deux millilitres de milieu sans sérum glacé. Transférer le plat de 35 millimètres contenant du DRG dans une hotte laminaire et laver le DRG avec un milieu sans sérum trois fois par pipette.Utilisez des pinces stériles pour déplacer les DRGs vers un nouveau plat de culture de 35 millimètres contenant deux millilitres de collagène stérile de type 1A. Placez le tissu dans la solution de collagène dans l’incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour commencer la dissociation des cellules. Après l’incubation, retirez la solution de collagène et lavez le DRG trois fois en deux millilitres de la solution de sel équilibrée de Hank.Ensuite, ajouter deux millilitres de trypsine préchaurée 0,05% EDTA au plat, et digérer le DRG dans l’incubateur pendant 30 minutes comme avant. Après la digestion, utilisez une pipette en verre pour transférer les deux millilitres de solution contenant du DRG à un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Le DRG pourrait s’en tenir à la pipette en verre de sorte que cette étape doit être effectuée avec soin.La perte réelle peut être évitée en gardant la solution contenant du DRG dans l’extrémité effilée de la pipette en verre, et en transférant la solution dans le tube de centrifugeuse lentement mais sans pause. Ensuite, centrifuger la solution à 290 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugage, retirer le supernatant et ajouter deux millilitres de milieu sans sérum pour résuspendre le DRG.Répétez le lavage deux fois, à l’aide de deux millilitres de milieu de culture préchauré pour résuspendre le tissu après la centrifugation finale. Utilisez la pipette polie stérile à flamme précédemment préparée pour triturer manuellement le DRG environ 60 fois. Ensuite, retirez une plaque de puits recouverte de poly-L-lysine contenant un millilitre de milieu de culture par puits de l’incubateur de CO2.Aspirer le milieu de culture incubé du plat. Ensemencer les cellules DRG d’un rat dans quatre des puits. Ça donne une densité d’ensemencement d’environ 500 000 cellules par puits.Le lendemain, remplacez le milieu de culture par un milieu complété par 10 micromolaires AraC et 100 nanogrammes par millilitre de NGF. Le troisième jour après le placage cellulaire, changer le milieu à 0,5 millilitres de milieu sans sérum préchauré, et incuber pendant une heure. Pendant l’incubation, ajouter 50 millimolaires d’ARN dans un microlitre d’eau sans RNase à 12,5 microlitres de milieu sans sérum par transfection.Puis pipette 2,5 microlitres de réaccélération transfection en 10 microlitres de milieu sans sérum pour chaque transfection. Mélanger les deux solutions par pipette et incuber cette solution de transfection mixte pendant 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, ajouter la solution de transfection dans les puits de la plaque de puits contenant 24 DRG et mélanger en secouant doucement.Après une incubation de six heures, ajouter 0,5 millilitres de milieu de culture avec 20% de FBS, 10 micromolaires AraC, et 100 nanogrammes par millilitre de NGF dans chaque puits de cellules. Enfin, incubez le DRG dans un incubateur de CO2 de 37 degrés Celsius pendant encore 66 heures. Le sixième jour après placage, et 72 heures après la transfection de siRNA, changez le milieu de culture à 200 microlitres du milieu sérique-libre.Après une incubation de 30 minutes, ajouter un microlitre du produit chimique de stimulation et mélanger délicatement par pipetting. L’agoniste NPFFR2, le dNPA et le véhicule correspondant sont utilisés ici. Après l’incubation pendant la période requise, recueillir le milieu de culture du plat de culture, et centrifugeuse à 5000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les impuretés suspendues.Recueillir le supernatant de la centrifugation et diluer avec de la solution saline tamponnée de phosphate au besoin. Analysez les niveaux de neurotransmetteurs avec des kits d’immunoassay enzymatiques disponibles dans le commerce. Le premier jour, le corps cellulaire d’un seul neurone indiqué par la flèche était fixé au fond d’un plat.Une cellule gliale indiquée par une pointe de flèche est également présente. Les cellules gliales ont dupliqué et étendu les processus pour entourer le corps cellulaire du neurone sensoriel le deuxième jour, un processus qui était encore plus important le troisième jour. Dans une autre culture, la protéine CGRP a été tachée pour révéler la forme des neurones.La coloration protéique CGRP apparaît dans le cytoplasme et les axones des neurones sensoriels. Les morphologies nucléaires des neurones et des cellules gliales sont distinctes lorsqu’elles sont tachées de DAPI. Les neurones ont un noyau plus grand et plus arrondi que les cellules gliales.En comparaison, les noyaux de glial sont de forme plus ovale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer et de culture le ganglion de racines dorsales, et l’utiliser comme un outil pour étudier les fonctions physiologiques sous-jacentes.N’oubliez pas que travailler avec les cellules primaires peut être beaucoup plus difficile que de travailler avec des lignées cellulaires régulières, et être doux est toujours la meilleure façon d’effectuer ces procédures.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Recherche

Neurosciences

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolement rapide des macrophages de ganglion de racine dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enrichissement de cultures de neurones ganglionnaires de la racine dorsale de souris adultes par immunopanoramique

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...