Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

אנו מודים Calkins מ ר לצורך עריכה באנגלית. עבודה זו נתמכה על ידי צ'נג קונג לבית חולים (CMRPD1F0482), צ'נג קונג אוניברסיטת, המרכז לחקר הזדקנות בריאה (EMRPD1G0171), משרד המדע וטכנולוגיה (105-2320-B-182-012-MY2).

כל השיטות המתוארות בזאת המשתמשות חיות ניסוי אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו להשתמש הוועדה (IACUC) של צ'נג קונג אוניברסיטת (CGU 13-014).
1. איסוף DRG המותני חולדות הניסוי
<ol><li>השתמש 2 כדי 3 בת שבוע ספראג-Dawley (SD) חולדות לאוסף DRG המותני. הערה: נוירונים DRG שנאסף חולדות מעל גיל 4 שבועות ?...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+nociception.">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li><li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain.">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li><li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperalgesia+and+allodynia:+peripheral+mechanisms.">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain.">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat.">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li><li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain:+an+in+vivo+and+in+vitro+study.">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).</li><li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain.">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li><li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch.">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li><li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons:+A+transcriptomic+comparison.">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li><li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line.">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li><li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors.">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).</li><li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn.">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

במאמר הנוכחי, נדגים את האוסף, אנזים-דיסוציאציה והתרבות של עכברוש המותני DRG. עם תמיכה neurotrophic של גורם הגדילה העצבי, האקסונים של נוירונים DRG מורחב בתוך 3 ימים לאחר תא זריעה. האקסונים המורחבת היו בבירור הנצפה לאחר התאים היו מוכתם CGRP חלבון, אשר מסונתז בסומה תא והוא מועבר לאורך הסיבים האקסון. התהלי...

הגופות בתא החישה הניריונים נכללות DRG. נוירונים אלה unipolar מדומים, innervate רקמות היקפיים והן על מערכת העצבים המרכזית. קצות העצבים ההיקפיים של נוירונים סנסוריים מצויים שרירים, עור, איברים מהבטן, העצם, בין רקמות אחרות,. הן מעבירות תחושה היקפיים אותות עצבים סופים הקרן בעמוד השדרה הגבי, את האותות מועברים לאחר מכן אל המוח דרך מסלולים שונים בסדר עולה של תחושה סומאטית1,2. התחושה סומאטית מאפשר לגוף להרגיש (קרי, מגע, כאב, תחושות תרמי) וקולטים תנועה ו-1,מרחבית (תחושות נראה שההתפתחות שלהם)3. יש ארבע מחלקות של האקסונים מביא הראשי, כולל קבוצת אני הסיבים (Aα) להגיב קינסטזיה של שרירי השלד, סיבי II (Aβ) קבוצה מגיבים mechanoreceptors של העור, וקבץ השלישי (Aδ) וסיבים V (C) של קבוצה מגיבים לכאב, טמפרטורה. רק את סיבי C הם unmyelinated, ואילו השאר הם סיבי העצב על דרגות שונות.
Nociceptors הם נוירונים סנסוריים העיקרי, אשר מופעלים על ידי גירויים רעילים (גירוי מכני, תרמי, כימי) שנושאים פוטנציאל נזק לרקמות. נוירונים אלה מורכבים סיבי העצב סיבי Aδ ו- unmyelinated C סיבים1,4. הסיבים Aδ אקספרס קולטני גורם הגדילה העצבי (גורם הגדילה העצבי, קולטן trkA), CGRP של SP. סיבי C מסווגים peptidergic או אי-peptidergic סיבי C. מצד שני, סיבי C peptidergic שאינם מבטאים את קולטני neurotrophic גליה-derived factor (קולטנים GDNF, רט ו- GFR), isolectin IB4 של יונים ממותגת ATP ערוץ המשנה (P2X3)5,6,7. Nociceptors יכול להיות מכובד על-ידי הביטוי של תעלות יונים, מופעל על ידי גורמים neurotrophic, ציטוקינים, neuropeptides, ATP או כימיקלים אחרים תרכובות8. על גירוי, נוירוטרנסמיטרים, כולל CGRP, SP ו גלוטמט יכול להשתחרר מהתחנות נוירון חישה ב הצופר בעמוד השדרה הגבי לשדר אותות nociceptive2. DRG אינם רק המורכבת של נוירונים, אך גם להכיל לוויין גלייה. תאי לוויין להקיף את החישה הניריונים, מספקים תמיכה מכנית וחילוף9,10. מעניין, יש גוף גדל והולך של ראיות המצביעות על לוויין גלייה ב הרפובליקה עשויים להיות מעורבים בוויסות תחושה כאב11.
החישה הניריונים דווחו ביותר לעתים קרובות משמש ראשי תאים עצביים12 , כבר נעזרו אלקטרופיזיולוגיה, אותות, ומחקרים שחרור נוירוטרנסמיטר. הם גם משמשים כדי לחקור את המנגנונים התאיים של ההתפתחות העצבית, כאבים דלקתיים, כאב נוירופטי, תחושה בעור (כמו גירוד) האקסון תוצר12,13,14,15. להיות תרבותי תרבויות העיקרי DRG כמו נוירונים חלופה מועדפת כדי להעריך שינויים ביוכימיים יחיד או מספר תאים, מאפשרת למדענים לבצע מחקרים כי לא ניתן לבצע במקצועות ניסיוני. לאחרונה, DRG היו בהצלחה תרבותי של תורמי איברים אנושיים אשר ייתכן נהנים מאוד המחקר translational16. מצד שני, גם יכול להיות תרבותי החישה הניריונים כפי DRG explants. Explants DRG לשמר את הארכיטקטורה הרקמה המקורית של הנוירונים, לרבות תאי שוואן ותאי גלייה בלוויין, הן שימושיות במיוחד ללמוד אינטראקציות בין עצביים ותאי שאינם עצבית17. תרבויות העיקרי DRG ניתן להכין בקלות בתוך 2.5 h. תא הרכב ואת מאפייני הן מאוד רעיוני של מקור DRG, בתור שכזה, ניתן לאסוף DRG ספציפי (או בית החזה המותני DRG) בהתאם לדרישות ניסיוני. תרבויות של נוירונים DRG עובריים ו neonatal לדרוש גורם הגדילה העצבי לשרוד זירוז תוצר האקסון, אבל תרבויות של נוירונים בוגרים שאינם מצריכים התוספת של גורמים neurotrophic12,מדיה17. ישנם גם זמינים מסחרית שורות תאים DRG-ליפידים כגון ND7/23 והוא F11, שאינן דורשות השימוש של חיות ניסוי. עם זאת, העדר הקטיון פוטנציאליים קולטן ארעי ערוץ חבר תת V 1 (TRPV1) ביטוי (סמן חשוב עבור קטן החישה הניריונים nociceptive), ביטוי גנים incongruent פרופילים להגביל שלהם יישומים18. לאחרונה, מונצחים DRG עצביים תא קווים עיטורית שאבו עכברוש (50B11)19 ועכבר (MED17.11)20, אשר מתאימים עבור השתמש במסכים תפוקה גבוהה עבור סמים מיקוד מחקרים. עם זאת, ביטוי גנים פרופילים עבור שורות תאים אלה טרם שיש לבצע. כך, הניסויים אימות השוואת לתאי החישה הניריונים immortalized אלה הם עדיין בעיצומה.
NPFFR2 הוא מסונתז הרפובליקה, translocated אל המסופים העצבים החישה עמוד השדרה הגבי קרן21. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול culturing תאים DRG המותני ועיבוד אותם עם אגוניסט של NPFFR2 לזירוז בשחרור של נוירוטרנסמיטרים, CGRP ו- SP. התלות NPFFR2 נבדק עוד יותר באמצעות NPFFR2 קטן מפריעות RNA (siRNA), אשר עשוי להיות transfected לתוך התאים DRG בתרבית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

שורש העץ הגרעינים (DRG) מכילים תא גופות של נוירונים סנסוריים. סוג זה של נוירון הוא unipolar מדומים, עם שני אקסונים זה innervate רקמות היקפיים, כגון עור, שריר, איברים מהבטן, כמו גם הקרן בעמוד השדרה הגבי של מערכת העצבים המרכזית. החישה הניריונים לשדר תחושה הסומטית, כולל מגע, כאב, תחושות תרמי, נראה שההתפתחות שלהם. לכן, תרבויות העיקרי DRG נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים התאיים של nociception, פונקציות פיזיולוגיים של נוירונים סנסוריים, והתפתחות עצבית. ניתן ליישם את הנוירונים בתרבית מחקרים שכללו אלקטרופיזיולוגיה, אותות, שחרור נוירוטרנסמיטר או סידן הדמיה. עם תרבויות העיקרי DRG, מדענים ייתכן תרבות הפומבית נוירונים DRG כדי לעקוב אחרי שינויים ביוכימיים יחיד או מספר תאים, התגברות על רבים מן המגבלות המשויך ויוו ניסויים. בהשוואה מסחרית זמינים שורות תאים DRG-ליפידים או מונצחים שורות תאים עצביים DRG, הרכב ואת המאפיינים של התאים הראשי דומים הרבה יותר החישה הניריונים ברקמות. עם זאת, בגלל מספר מוגבל של בתרבית תאים DRG הראשי ניתן לבודד מחיה יחיד, קשה לבצע מסכי תפוקה גבוהה עבור סמים מיקוד מחקרים. במאמר הנוכחי, מתוארים הליכים DRG אוסף ותרבות. בנוסף, נדגים את הטיפול בתרבית תאים DRG עם אגוניסט של neuropeptide FF קולטן מסוג 2 (NPFFR2) כדי לעודד את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים פפטיד (פפטיד הקשורות ג'ין קלציטונין (CRGP), חומר P (SP)).

החולדה המותני DRG הנוירונים, תרבותי לתוך צלחת 24-ובכן, גדלו במדיום תרבות נוספים Ara-C כדי לעכב את התפשטות תא גליה, גורם הגדילה העצבי לתמוך בצמיחה עצביים. המורפולוגיה של החיים DRG תאים נצפתה. כפי שמוצג באיור3, בגוף התא של נוירון אחד היה מצורף בתחתית צלחת על יום 1 ונ?...

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

שורש העץ הגרעינים (DRG) ראשי תרבויות משמשים לעתים קרובות כדי לחקור פונקציות פיזיולוגיים או אירועים הקשורים לפתולוגיה, החישה הניריונים. כאן, נדגים את השימוש המותני תרבויות DRG כדי לזהות את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים לאחר neuropeptide FF קולטן הקלד 2 גירוי עם אגוניסט סלקטיבי.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר החושי, כגון nociception היקפי. היתרון העיקרי של טכני זה הוא כי חקירת המנגנון התאי של נוירונים חושיים עם המודל המדמה ביותר למצב פיזיולוגי. לאסוף את גנגליה שורש הגב המותני מתא המטען של חולדה בת שבועיים עד שלושה שבועות.התחל על ידי ביצוע שני חתכים לאורך הצדדים של עמוד השדרה וחתך רוחבי אחד כדי לסמן את היקף rostral של עמוד השדרה המותני. לאחר מכן, השתמש מטלפים חיתוך עצם כדי להסיר את השרירים הגביים של עמוד השדרה. לאחר מכן, להסיר את החלק הגבי של החוליות ולחשוף את חוט השדרה.לאחר מכן השתמש מספריים ניתוח מדפים כדי להסיר את חוט השדרה. זהה את DRG המותני על ידי ספירת חוליות מן הצלע האחרונה. דיאגרמה זו מציגה את מיקומי החוליות.השתמש מספריים מיקרו כדי לאסוף את 12 DRG מותני דו צדדי מ L1 כדי L6. הסר את כל הסיבים העצביים המצורפים כדי לשפר את טוהר התרבות. מעבירים כל DRG מותני לצלחת תרבות של 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מדיום נטול סרום קר כקרח. מעבירים את המנה המכילה DRG 35 מילימטר לתוך מכסה המנוע למינאר, ולשטוף את DRG עם מדיום ללא סרום שלוש פעמים על ידי פיפטה.השתמש פינצטה סטרילית כדי להעביר את DRGs לצלחת תרבות חדשה 35 מילימטר המכיל שני מיליליטר של קולגנס סטרילי סוג 1A. מניחים את הרקמה בתסמת קולגנס באינקובטור תרבות הרקמה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להתחיל דיסוציאציה של התאים. לאחר הדגירה, הסר את תווי הקולגנס ושטף את ה- DRG שלוש פעמים בשני מיליליטר של תווי המלח המאוזנים של האנק.לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA לפני המלחמה לצלחת, ולעכל את DRG באינקובטור במשך 30 דקות כמו קודם. לאחר העיכול, השתמש פיפטה זכוכית להעביר את שני מיליליטר של פתרון המכיל DRG לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. DRG עשוי לדבוק פיפטה זכוכית כך שלב זה צריך להתבצע בזהירות.ההפסד בפועל ניתן להימנע על ידי שמירה על פתרון המכיל DRG בקצה המתחדד של פיפטה זכוכית, והעברת הפתרון לתוך צינור צנטריפוגה לאט אבל ללא הפסקה. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 290 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהוסיף עוד שני מיליליטר של מדיום ללא סרום כדי לעשות שימוש חוזר DRG.חזור על הכביסה פעמיים, באמצעות שני מיליליטר של מדיום תרבות טרום המלחמה כדי resuspend הרקמה לאחר הצנטריפוגה הסופית. השתמשו בצנרת המלוטשת של להבה סטרילית שהוכנה בעבר כדי להפוך את ה-DRG לטריטוריה ידנית כ-60 פעמים. לאחר מכן, הסר צלחת פולי-L-ליסין מצופה 24 באר המכילה מיליליטר אחד של מדיום תרבות ל הבאר מהאינקובטור CO2.שאפו את מדיום התרבות הדגירה מהמנה. זרע את תאי DRG מעכברוש אחד לארבע בארות. זה נותן צפיפות זריעה של כ 500, 000 תאים לגם.למחרת, להחליף את מדיום התרבות עם בינוני בתוספת 10 micromolar AraC, ו 100 ננוגרם למיליליטר NGF. ביום השלישי לאחר ציפוי התא, לשנות את המדיום ל 0.5 מיליליטר של מדיום נטול סרום מראש, ו דגירה במשך שעה אחת. במהלך הדגירה, מוסיפים 50 מילימולרים siRNA במיקרוליטר אחד של מים נטולי RNase ל-12.5 מיקרוליטרים של מדיום ללא סרום לכל טרנספייפ.לאחר מכן פיפטה 2.5 microliters של reagent transfection לתוך 10 microliters של מדיום ללא סרום עבור כל transfection. ערבבו את שני הפתרונות לפי פיפט, והתערבבו בתספורת מעורבת זו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, מוסיפים את תספורת ההטרדה לתוך בארות של צלחת 24 באר המכילה DRG ומערבבים על ידי טלטול בעדינות.לאחר דגירה של שש שעות, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מדיום תרבותי עם 20%FBS, 10 מיקרומולרים AraC ו-100 ננוגרם למיליליטר NGF לכל באר של תאים. לבסוף, חודרים את DRG ב 37 מעלות צלזיוס CO2 אינקובטור במשך 66 שעות נוספות. ביום השישי לאחר ציפוי, ו 72 שעות לאחר transfection siRNA, לשנות את מדיום התרבות ל 200 microliters של מדיום ללא סרום.לאחר דגירה של 30 דקות, מוסיפים מיקרוליטר אחד של הכימיקל הגירוי ומערבבים בעדינות על ידי צינורות. אגוניסט NPFFR2, dNPA, ורכב מתאים משמשים כאן. לאחר הדגירה לתקופה הנדרשת, לאסוף את מדיום התרבות מן צלחת התרבות, צנטריפוגה ב 5000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל זיהומים מושעה.לאסוף את supernatant מן הצנטריפוגה לדלל עם מלוחים מאגר פוספט לפי הצורך. תן לי את רמות הנוירוטרנסמיטורים עם ערכות אימונואזי אנזימים זמינות מסחרית. ביום הראשון, גוף התא של נוירון יחיד שצוין על ידי החץ היה מחובר בתחתית צלחת.כמו כן קיים תא גליה המצוין על-ידי ראש חץ. תאי הגלישה שכפלו והרחיבו תהליכים כדי להקיף את גוף התא של הנוירון החושי ביום השני, תהליך שהיה בולט עוד יותר ביום השלישי. בתרבות אחרת, חלבון CGRP היה מוכתם כדי לחשוף את הצורה של נוירונים.כתמי חלבון CGRP מופיעים בציטופלסמה ובאקסונים של נוירונים חושיים. מורולוגיות גרעיניות של נוירונים ותאי גלייה מובחנים כאשר מוכתמים ב- DAPI. לנוירונים יש גרעין גדול ועגול יותר מתאי גליה.לשם השוואה, הגרעינים של גליה הם אליפסה יותר בכושר. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בעוד שעתיים וחצי אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לנתח ולתרבת את גנגליון השורש הגבי, ולהשתמש בו ככלי לחקור פונקציות פיזיולוגיות הבסיסית.אל תשכח כי עבודה עם תאים ראשוניים יכול להיות הרבה יותר קשה מאשר לעבוד עם קווי תאים רגילים, ולהיות עדין היא תמיד הדרך הטובה ביותר בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

העשרת תרביות נוירונים של גרעיני שורש גבי של עכבר בוגר על ידי אימונופנינג

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...