Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
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हम अंग्रेजी संपादन के लिए डॉ एम Calkins धंयवाद । इस काम चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (CMRPD1F0482), चांग गुंग विश्वविद्यालय, स्वस्थ एजिंग अनुसंधान केंद्र (EMRPD1G0171) और विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (105-2320-B-182-012-MY2) द्वारा समर्थित किया गया था ।

सभी तरीकों कि प्रयोग प्रयोगात्मक पशुओं संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) चांग गुंग विश्वविद्यालय (CGU 13-014) द्वारा अनुमोदित किए गए थे यहां वर्णित ।
1. प्रयोगात्मक चूहों से काठ का डीआरजी लीजिए...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

वर्तमान लेख में, हम संग्रह, एंजाइम-पृथक्करण, और चूहा काठ का डीआरजी की संस्कृति का प्रदर्शन । NGF से neurotrophic समर्थन के साथ, डीआरजी न्यूरॉन्स की axons सेल बोने के बाद 3 दिनों के भीतर विस्तारित. विस्तारित axons स्पष्ट रू...

संवेदी न्यूरॉन्स के कोशिका निकायों डीआरजी के भीतर निहित हैं. इन न्यूरॉन्स छद्म एकध्रुवीय और अंदर आना दोनों परिधीय ऊतकों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र हैं । संवेदी न्यूरॉन्स की परिधीय तंत्रिका अंत मांसपेशियों में पाए जाते हैं, त्वचा, आंत अंगों, और अन्य ऊतकों के बीच हड्डी,. वे रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग में तंत्रिका अंत करने के लिए परिधीय अनुभूति संकेतों संचारित और संकेत तो दैहिक अनुभूति1,2के विभिंन आरोही रास्ते के माध्यम से मस्तिष्क को प्रेषित कर रहे हैं । दैहिक अनुभूति शरीर को महसूस करने के लिए सक्षम बनाता है (यानी, स्पर्श, दर्द, और थर्मल उत्तेजना) और अनुभव आंदोलन और स्थानिक उंमुखीकरण (proprioceptive अनुभूतियां)1,3। प्राथमिक afferent axons के चार उपवर्ग हैं जिनमें समूह I (Aα) तंतु शामिल हैं जो कंकाल की मांसपेशियों के proprioception का जवाब देते हैं, समूह द्वितीय (Aβ) तंतुओं कि त्वचा के mechanoreceptors का जवाब देते हैं, और समूह III (Aδ) और समूह V (ग) तंतुओं कि दर्द का जवाब और तापमान. केवल सी फाइबर unmyelinated होते हैं, जबकि बाकी विभिन्न डिग्री के myelinated होते हैं ।
Nociceptors प्राथमिक संवेदी ंयूरॉंस, जो हानिकारक उत्तेजनाओं (यांत्रिक, थर्मल, और रासायनिक उत्तेजना) कि ऊतक क्षति के लिए क्षमता ले द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । इन न्यूरॉन्स myelinated Aδ फाइबर और unmyelinated सी फाइबर से बना रहे हैं1,4. Aδ फाइबर तंत्रिका विकास कारक के लिए रिसेप्टर्स व्यक्त (NGF, trkA रिसेप्टर), CGRP, और सपा. सी फाइबर या तो peptidergic और गैर peptidergic सी फाइबर के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । दूसरी ओर, गैर-peptidergic सी फाइबर glial के लिए रिसेप्टर्स व्यक्त-व्युत्पंन neurotrophic कारक (GDNF, रेत, और GFR रिसेप्टर्स), isolectin IB4, और एटीपी-gated आयन चैनल उपप्रकार (P2X3)5,6,7. Nociceptors आयन चैनलों की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है और neurotrophic कारकों, साइटोकिंस, neuropeptides, एटीपी, या अन्य रासायनिक यौगिकों8द्वारा सक्रिय. उत्तेजना पर, न्यूरोट्रांसमीटर, CGRP सहित, सपा, और ग्लूटामेट संवेदी ंयूरॉन टर्मिनलों से स्पाइनल पृष्ठीय सींग में nociceptive संकेतों2संचारित करने के लिए जारी किया जा सकता है । डीआरजी न केवल ंयूरॉंस की रचना कर रहे हैं, लेकिन यह भी उपग्रह glial कोशिकाओं में शामिल हैं । सैटेलाइट कोशिकाओं संवेदी ंयूरॉंस चारों ओर और यांत्रिक और चयापचय का समर्थन9,10प्रदान करते हैं । दिलचस्प है, वहां सबूत के एक बढ़ती शरीर का संकेत है कि डीआरजी में उपग्रह glial कोशिकाओं दर्द सनसनी11विनियमन में शामिल किया जा सकता है ।
संवेदी ंयूरॉंस सबसे अक्सर इस्तेमाल किया प्राथमिक न्यूरॉन्स कोशिकाओं को सूचित किया गया है12 और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उपयोग किया गया है, संकेत transduction, और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज अध्ययन. उंहोंने यह भी सामांयतः के लिए उपयोग किया जाता है सेलुलर तंत्र का पता लगाने के लिए ंयूरॉन विकास, भड़काऊ दर्द, neuropathic दर्द, त्वचा की अनुभूति (खुजली की तरह), और axon वृद्धि12,13,14,15। डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों असंबद्ध ंयूरॉंस के रूप में एक या एकाधिक कोशिकाओं में जैव रासायनिक परिवर्तन का आकलन करने के लिए, वैज्ञानिकों को अध्ययन है कि प्रयोगात्मक विषयों में नहीं किया जा सकता प्रदर्शन करने की अनुमति के रूप में किया जा सकता है । हाल ही में, डीआरजी सफलतापूर्वक मानव अंग दाताओं जो काफी शोधों16लाभ हो सकता है से संस्कृति थे । दूसरी ओर, संवेदी न्यूरॉन्स को भी डीआरजी explants के रूप में कल्चरित किया जा सकता है. डीआरजी explants न्यूरॉन्स के मूल ऊतक वास्तुकला की रक्षा, Schwann कोशिकाओं और उपग्रह glial कोशिकाओं सहित, और विशेष रूप से न्यूरॉन्स और गैर-न्यूरॉन कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं17. डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों २.५ ज के भीतर आसानी से तैयार किया जा सकता है । कोशिका रचना और गुण स्रोत डीआरजी के अत्यधिक चिंतनशील होते हैं, और जैसे, विशिष्ट डीआरजी (काष्ठ या वक्ष डीआरजी) प्रयोगात्मक माँगों के अनुसार एकत्र किए जा सकते हैं । भ्रूण और नवजात डीआरजी न्यूरॉन्स की संस्कृतियों NGF जीवित रहने के लिए और प्रेरित axon वृद्धि की आवश्यकता है, लेकिन वयस्क न्यूरॉन्स की संस्कृतियों मीडिया12,17करने के लिए neurotrophic कारकों के अलावा की आवश्यकता नहीं है. वहां भी कर रहे है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीआरजी-hybridoma सेल लाइनों जैसे ND7/23 और F11, जो प्रयोगात्मक पशुओं के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, क्षणिक रिसेप्टर संभावित कटियन चैनल उपपरिवार V सदस्य 1 की कमी (TRPV1) अभिव्यक्ति (छोटे संवेदी nociceptive न्यूरॉन्स के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर) और incongruent जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल अपने आवेदन18सीमा. हाल ही में, अमर डीआरजी न्यूरॉन सेल लाइनों चूहे से व्युत्पंन किया गया है (50B11)19 और माउस (मेड 17.11)20, जो उच्च प्रवाह स्क्रीन में उपयोग के लिए दवा लक्ष्यीकरण अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं । हालांकि, इन सेल लाइनों के लिए जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा अभी तक किया जा सकता है । इस प्रकार, सत्यापन संवेदी न्यूरॉन्स के लिए इन अमर कोशिकाओं की तुलना प्रयोगों अभी भी चल रहे हैं.
NPFFR2 डीआरजी में संश्लेषित और रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग21में संवेदी तंत्रिका टर्मिनलों को translocated है । इस लेख में, हम संवर्धन काठ का डीआरजी कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और उन्हें न्यूरोट्रांसमीटर, CGRP और एसपी की रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए NPFFR2 के एक एगोनिस्ट के साथ इलाज. NPFFR2 पर निर्भरता आगे NPFFR2 छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) का उपयोग कर परीक्षण किया है, जो कल्चरल डीआरजी कोशिकाओं में transfected हो सकता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) संवेदी ंयूरॉंस के सेल निकायों होते हैं । इस प्रकार का ंयूरॉन है छद्म एकध्रुवीय, दो axons के साथ कि अंदर आना परिधीय ऊतकों, जैसे त्वचा, मांसपेशी और आंत अंगों के रूप में अच्छी तरह के रूप में रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की । संवेदी न्यूरॉन्स स्पर्श, दर्द, थर्मल, और proprioceptive उत्तेजना सहित दैहिक अनुभूति, संचारित । इसलिए, डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों व्यापक रूप से nociception के सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, संवेदी न्यूरॉन्स के शारीरिक कार्य, और तंत्रिका विकास. प्रसंस्कृत ंयूरॉंस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, संकेत transduction, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज, या कैल्शियम इमेजिंग शामिल अध्ययन में लागू किया जा सकता है । डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों के साथ, वैज्ञानिकों असंबद्ध डीआरजी ंयूरॉंस संस्कृति को एकल या एकाधिक कोशिकाओं में जैव रासायनिक परिवर्तन की निगरानी कर सकते हैं, vivo प्रयोगों में से जुड़ी सीमाओं के कई पर काबू पाने । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीआरजी-hybridoma सेल लाइनों या अमर डीआरजी न्यूरॉन सेल लाइनों की तुलना में, संरचना और प्राथमिक कोशिकाओं के गुणों के ऊतकों में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए बहुत अधिक समान हैं. हालांकि, एक ही जानवर से पृथक किया जा सकता है कि संस्कृतिपूर्ण डीआरजी प्राथमिक कोशिकाओं की सीमित संख्या के कारण, यह दवा लक्ष्यीकरण अध्ययन के लिए उच्च प्रवाह स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है. वर्तमान लेख में, डीआरजी संग्रह और संस्कृति के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, हम neuropeptide एफएफ रिसेप्टर प्रकार के एक एगोनिस्ट के साथ संस्कृतिपूर्ण डीआरजी कोशिकाओं के उपचार का प्रदर्शन 2 (NPFFR2) पेप्टाइड न्यूरोट्रांसमीटर (कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (CRGP) और पदार्थ पी (एसपी)) की रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए.

चूहा काठ का डीआरजी ंयूरॉंस, एक 24 अच्छी तरह से थाली में, संस्कृति माध्यम में अतिरिक्त आरा-सी के साथ glial कोशिका प्रसार और NGF को बाधित करने के लिए ंयूरॉन विकास का समर्थन हो रहे थे । जीवित डीआरजी कोश...

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Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) प्राथमिक संस्कृतियों अक्सर शारीरिक कार्यों या विकृति संवेदी न्यूरॉन्स में संबंधित घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. यहां, हम काठ का डीआरजी संस्कृतियों के उपयोग के लिए न्यूरोट्रांसमीटर के रिलीज के बाद neuropeptide एफएफ रिसेप्टर टाइप 2 एक चयनात्मक एगोनिस्ट के साथ उत्तेजना का पता लगाने के प्रदर्शन ।

पृष्ठीय रूट गैंग्लिया अलगाव और प्राथमिक संस्कृति न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई का अध्ययन करने के लिए

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

यह विधि संवेदी अनुसंधान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों का उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे परिधीय एनओसी। इस तकनीकी का मुख्य लाभ यह है कि मॉडल के साथ संवेदी न्यूरॉन्स के सेलुलर तंत्र की जांच करना जो सबसे शारीरिक स्थिति का अनुकरण करता है। दो से तीन सप्ताह पुराने चूहे के ट्रंक से काठ पृष्ठीय जड़ गैंगलिया ले लीजिए।रीढ़ की हड्डी के कॉलम के किनारों के साथ दो कटौती और काठ की रीढ़ की हड्डी के रोस्ट्रल सीमा को चिह्नित करने के लिए एक पार्श्व कटौती करके शुरू करें। इसके बाद रीढ़ की पृष्ठीय मांसपेशियों को दूर करने के लिए हड्डी काटने वाले संदंश का प्रयोग करें। इसके बाद, कशेरुकी के पृष्ठीय भाग को हटा दें और रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करें।इसके बाद रीढ़ की हड्डी को हटाने के लिए विच्छेदन कैंची और संदंश का प्रयोग करें। पिछले पसली से कशेरुकी गिनती द्वारा काठ डीआरजी की पहचान करें। यह आरेख कशेरुकी स्थितियों को दर्शाता है।L1 से L6 तक 12 द्विपक्षीय काठ डीआरजी इकट्ठा करने के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग करें। संस्कृति की शुद्धता में सुधार करने के लिए किसी भी संलग्न न्यूरोनल फाइबर को हटा दें। प्रत्येक काठ डीआरजी को 35 मिलीमीटर कल्चर डिश में स्थानांतरित करें जिसमें दो मिलीलीटर बर्फ ठंडे सीरम-मुक्त माध्यम हैं। डीआरजी युक्त 35 मिलीमीटर डिश को लैमिनार हुड में ट्रांसफर करें और डीआरजी को पिपेट करके तीन बार सीरम-फ्री मीडियम से धोएं।डीआरजी को एक नए 35 मिलीमीटर संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ चिमटी का उपयोग करें जिसमें बाँझ कोलेजन प्रकार 1A के दो मिलीलीटर होते हैं। कोशिकाओं के वियोजन शुरू करने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में कोलेजनेस समाधान में ऊतक रखें। इनक्यूबेशन के बाद, कोलेजनेस समाधान को हटा दें और हांक के संतुलित नमक समाधान के दो मिलीलीटर में तीन बार डीआरजी को धोएं।इसके बाद, डिश में प्रीवार्मेड 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के दो मिलीलीटर जोड़ें, और पहले की तरह 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में डीआरजी को पचा लें। पाचन के बाद, डीआरजी युक्त समाधान के दो मिलीलीटर को 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें। डीआरजी ग्लास पिपेट से चिपक सकता है इसलिए इस कदम को देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।वास्तविक नुकसान से कांच के पिपेट के टेपर अंत में डीआरजी युक्त समाधान रखने और समाधान को धीरे-धीरे लेकिन बिना ठहराव के स्थानांतरित करके टाला जा सकता है। इसके बाद, चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए २९० बार जी पर समाधान अपकेंद्रित्र । सेंट्रलाइज करने के बाद सुपरनेट निकालें और डीआरजी को रीसुस्ट करने के लिए सीरम-फ्री मीडियम के एक और दो मिलीलीटर जोड़ें ।अंतिम अपकेंद्रित्र के बाद ऊतक को फिर से खर्च करने के लिए प्रीवार्म्ड कल्चर मीडियम के दो मिलीलीटर का उपयोग करके दो बार धो दोहराएं। डीआरजी को लगभग 60 बार मैन्युअल रूप से ट्राय करने के लिए पहले से तैयार बाँझ लौ पॉलिश पिपेट का उपयोग करें। इसके बाद, एक पॉली-एल-lysine लेपित 24 अच्छी तरह से CO2 इनक्यूबेटर से अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के एक मिलीलीटर युक्त थाली हटा दें ।पकवान से इनक्यूबेटेड संस्कृति माध्यम को आकांक्षी करें। डीआरजी कोशिकाओं को एक चूहे से चार कुओं में बीज करें। यह लगभग 500, 000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक सीडिंग घनत्व देता है।अगले दिन, संस्कृति माध्यम को 10 माइक्रोमोलर अरासी के साथ माध्यम से प्रति पूरक और 100 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर एनजीएफ के साथ प्रति की जगह दें। सेल प्लेटिंग के बाद तीन दिन, मध्यम को प्रीवार्म्ड सीरम-मुक्त माध्यम के 0.5 मिलीलीटर में बदलें, और एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान, आरएनएसई-मुक्त पानी के एक माइक्रोलीटर में 50 मिलीमोलर सिरना को सीरम-मुक्त माध्यम प्रति ट्रांसफैक्शन के 12.5 माइक्रोलीटर में जोड़ें।फिर प्रत्येक ट्रांसफैक्शन के लिए सीरम-मुक्त माध्यम के 10 माइक्रोलीटर में ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के 2.5 माइक्रोलीटर पिपेट करें। पिपेट द्वारा दोनों समाधानों को मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इस मिश्रित ट्रांसफैक्शन समाधान को इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के बाद, डीआरजी युक्त 24 अच्छी प्लेट के कुओं में ट्रांसफेक्शन समाधान जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाते हुए मिलाएं।छह घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में 20% एफबीएस, 10 माइक्रोमोलर आरईसी और 100 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर एनजीएफ के साथ संस्कृति माध्यम के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। अंत में, डीआरजी को 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में एक और 66 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। चढ़ाना के बाद छह दिन, और सिराना ट्रांसफैक्शन के ७२ घंटे बाद, सीरम मुक्त माध्यम के २०० माइक्रोलीटर के लिए संस्कृति माध्यम बदल जाते हैं ।30 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, उत्तेजना रसायन का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे पिपिंग करके मिलाएं। NPFFR2 agonist, dNPA, और इसी वाहन यहां उपयोग किया जाता है । आवश्यक अवधि के लिए इनक्यूबेटिंग के बाद, संस्कृति पकवान से संस्कृति माध्यम इकट्ठा, और किसी भी निलंबित अशुद्धियों को दूर करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ५० बार जी पर अपकेंद्रित्र ।जरूरत के अनुसार फॉस्फेट-बफर नमकीन के साथ अपकेंद्री और पतला से सुपरनेट ले लीजिए। परख व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम इम्यूनोसे किट के साथ न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर। एक दिन, तीर द्वारा इंगित एक एकल न्यूरॉन का सेल शरीर एक डिश के तल पर जुड़ा हुआ था।एक तीर सिर द्वारा इंगित एक ग्लियल सेल भी मौजूद है। ग्लियल कोशिकाओं ने दो दिन संवेदी न्यूरॉन के कोशिका शरीर को घेरने के लिए डुप्लिकेट और विस्तारित प्रक्रियाओं को दोहराया, एक प्रक्रिया जो तीन दिन में और भी प्रमुख थी। एक अन्य संस्कृति में, सीजीआरपी प्रोटीन न्यूरॉन्स के आकार को प्रकट करने के लिए दाग था।सीजीआरपी प्रोटीन धुंधला साइटोप्लाज्म और संवेदी न्यूरॉन्स के अक्षों में दिखाई देता है। DAPI के साथ दाग होने पर न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं की परमाणु मॉर्फोलोजी अलग होती हैं। न्यूरॉन्स में ग्लियल कोशिकाओं की तुलना में एक बड़ा और अधिक गोलाकार नाभिक होता है।तुलना करके, ग्लियल का नाभिक आकार में अधिक अंडाकार होता है। एक बार महारत हासिल करने के बाद अगर इसे ठीक से किया जाए तो इस तकनीक को ढाई घंटे में किया जा सकता है। इस वीडियो को देखने के बाद, आपको इस बात की अच्छी समझ होनी चाहिए कि पृष्ठीय जड़ गैंगलियन को कैसे विच्छेदन और संस्कृति से अलग किया जाए, और अंतर्निहित शारीरिक कार्यों की जांच करने के लिए इसे एक उपकरण के रूप में उपयोग करें।यह न भूलें कि प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करना नियमित सेल लाइनों के साथ काम करने की तुलना में बहुत अधिक कठिन हो सकता है, और इन प्रक्रियाओं को निष्पादित करते समय कोमल होना हमेशा सबसे अच्छा तरीका होता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Chromatin पृष्ठीय रूट ganglia ऊतक से axonal चोट के बाद immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Rhizotomy बाद पृष्ठीय रूट axons की लाइव इमेजिंग

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

संवर्धित वयस्क पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स साथ Axon पुनर्जनन की आनुवंशिक अध्ययन

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

रूट ganglia न्यूरॉन्स और विभेदित वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल पृष्ठीय: एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सह संस्कृति मॉडल परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

निकोटीन प्रेरित कैल्शियम संकेतन और उदर Hippocampal Axons साथ neurotransmitter रिहाई के रहते इमेजिंग

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

एक दृष्टिकोण संरेखण और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की myelination बढ़ाने के लिए

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

चूहे में रीढ़ की हड्डी और पृष्ठीय रूट ganglia के अलगाव की हाइड्रोलिक बाहर निकालना

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट संवेदी अक्षतंतु उत्थान के लिए एक मॉडल के रूप में चोट क्रश

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

डोर्सल रूट गंडिका मैक्रोफेज का तेजी से अलगाव

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

इम्यूनोपैनिंग द्वारा वयस्क माउस पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया न्यूरॉन संस्कृतियों का संवर्धन

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...