Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
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Ringraziamo il Dr. M. Calkins per l'editing di inglese. Questo lavoro è stato supportato da Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) e Ministero della scienza e tecnologia (105-2320-B-182-012-MY2).

Tutti i metodi descritti nel presente documento che utilizzano animali da esperimento sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e utilizzare Committee (IACUC) di Chang Gung University (CGU 13-014).
1. raccogliere lombare DRG da ratti sperimentali
<ol><li>Utilizzare 2 a ratti Sprague-Dawley (deviazione standard) di 3 settimane per lombare DRG insieme. Nota: I neuroni DRG raccolti da ratti di età superiore a 4 settimane non si sviluppano bene sotto le condizioni della coltura desc...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. 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Nel presente articolo, dimostriamo la collezione, enzima-dissociazione e la cultura di lombare ratto DRG. Con il supporto di neurotrophic da NGF, gli assoni dei neuroni DRG esteso entro 3 giorni dopo la semina delle cellule. Gli assoni estesi erano chiaramente osservabili dopo che le cellule sono state macchiate per proteina CGRP, che è sintetizzata nel soma cellulare e trasportata lungo le fibre dell'assone. I processi delle cellule satelliti anche estese, permettendo queste cellule gliale divisione a circondare i neur...

I corpi cellulari dei neuroni sensoriali sono contenuti all'interno di DRG. Questi neuroni sono pseudo-unipolari e innervano sia tessuti periferici e del sistema nervoso centrale. Le terminazioni del nervo periferico dei neuroni sensoriali si trovano nel muscolo, pelle, organi viscerali e osso, tra altri tessuti. Trasmettono segnali periferici sensazione al nervo terminazioni nel corno dorsale spinale e i segnali vengono poi trasmessi al cervello attraverso differenti vie ascendenti di sensazione somatica1,2. Sensazione somatica permette al corpo di sentire (cioè, touch, dolore e sensazioni termiche) e percepire il movimento e orientamento spaziale (sensazioni propriocettive)1,3. Ci sono quattro sottoclassi degli assoni afferenti primari, tra cui gruppo I (Aα) fibre che rispondono a propriocezione dei muscoli scheletrici, le fibre di gruppo II (Aβ) che rispondono a meccanorecettori della pelle, e gruppo III (Aδ) e le fibre di gruppo V (C) rispondere al dolore e temperatura. Solo le fibre C sono unmyelinated, mentre il resto sono myelinated ai gradi differenti.
Nocicettori sono neuroni sensitivi primari, che vengono attivati da stimoli nocivi (stimolazione meccanica, termica e chimica) che portano il potenziale di danno tissutale. Questi neuroni sono composti da fibre Aδ myelinated e1,unmyelinated fibre di C4. Le fibre Aδ esprimono i recettori per il fattore di crescita nervoso (NGF, recettore trkA), CGRP e SP. Le fibre C sono classificate come peptidergic sia non-peptidergic fibre C. D'altra parte, le fibre C non peptidergic esprimono i recettori per il fattore neurotrophic glial-derivato (recettori GDNF, RET e GFR), isolectin IB4 e ionici ATP canale sottotipo (P2X3)5,6,7. Nocicettori possono essere distinto dall'espressione di canali ionici e attivati da fattori neurotrofici, citochine, neuropeptidi, ATP o altro prodotto chimico composti8. Stimolazione, neurotrasmettitori, tra cui CGRP, SP e glutammato possono essere liberati dai terminali di neurone sensoriale nel corno dorsale spinale per trasmettere segnali nocicettivi2. DRG non solo sono composti da neuroni, ma contengono anche cellule gliali satellitare. Le cellule satelliti circondano i neuroni sensoriali e forniscono supporto meccanico e metabolico9,10. Interessante, ci è un corpo crescente di prova che indica che cellule glial satelliti in DRG possono essere coinvolto nella regolazione della sensazione di dolore11.
I neuroni sensoriali sono stati segnalati per essere il più frequentemente usato cellule neuronali primarie12 e è stato utilizzato per elettrofisiologia, trasduzione del segnale e gli studi di rilascio di neurotrasmettitore. Essi sono anche comunemente utilizzati per esplorare i meccanismi cellulari di sviluppo neuronale, dolore infiammatorio, dolore neuropatico, sensazione di pelle (come prurito) e assone escrescenza12,13,14,15. Colture primarie di DRG possono essere coltivati come neuroni dissociati per valutare i cambiamenti biochimici nella singola o più celle, permettendo agli scienziati di eseguire studi che non possono essere eseguiti in soggetti sperimentali. Recentemente, DRG sono state coltivate con successo dai donatori di organo umano che potrebbero beneficiare notevolmente ricerca traslazionale16. D'altra parte, i neuroni sensoriali possono essere coltivati anche come DRG espianti. Gli espianti DRG preservano l'architettura originale del tessuto dei neuroni, tra cui le cellule di Schwann e cellule gliali satellitare e sono particolarmente utili per studiare le interazioni tra cellule neuronali e non neuronali17. Colture primarie di DRG possono essere facilmente preparati all'interno di 2,5 h. La composizione delle cellule e le proprietà sono altamente riflettente dell'origine DRG, e come tale, DRG specifici (DRG lombare o toracica) possono essere raccolti secondo esigenze sperimentali. Colture di neuroni DRG embrionali e neonatali richiedono NGF sopravvivere e per indurre la crescita assonale, ma colture di neuroni adulti non richiedono l'aggiunta di fattori neurotrofici al media12,17. Ci sono anche linee di cellulari DRG-ibridoma commercialmente disponibili come CD7/23 e F11, che non richiedono l'uso di animali da esperimento. Tuttavia, la mancanza del catione potenziale transitorio del ricevitore canale membro subfamily V 1 (TRPV1) espressione (un indicatore importante per piccoli neuroni sensoriali nocicettivi) e profili di espressione genica incongruenti limitano loro applicazioni18. Recentemente, cellulare di un neurone di DRG immortalata linee sono state derivate dal ratto (50B11)19 e del mouse (MED17.11)20, che sono adatti per uso in schermi di alto-rendimento per droga studi di targeting. Tuttavia, profili di espressione genica per queste linee cellulari ha ancora da eseguire. Così, gli esperimenti di convalida confrontando queste cellule immortalizzate ai neuroni sensoriali sono ancora in corso.
NPFFR2 viene sintetizzata in DRG e traslocata ai terminali del nervo sensoriale nel corno dorsale spinale21. In questo articolo, forniamo un protocollo per la coltura delle cellule DRG lombare e trattarli con un agonista di NPFFR2 per indurre il rilascio di neurotrasmettitori, CGRP e SP. La dipendenza da NPFFR2 è ulteriormente testato utilizzando NPFFR2 Short interfering RNA (siRNA), che può essere transfected nelle cellule coltivate del DRG.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

Gangli delle radici dorsali (DRG) contengono i corpi cellulari dei neuroni sensoriali. Questo tipo di neurone è pseudo-unipolare, con due assoni che innervano tessuti periferici, quali pelle, muscolo e organi viscerali, come pure il corno dorsale spinale del sistema nervoso centrale. Neuroni sensoriali trasmettono sensazione somatica, tra cui touch, dolore, sensazioni termiche e propriocettivi. Di conseguenza, colture primarie di DRG sono ampiamente usati per studiare i meccanismi cellulari della nocicezione, funzioni fisiologiche dei neuroni sensoriali e lo sviluppo neurale. I neuroni in coltura possono essere applicati negli studi di elettrofisiologia, trasduzione del segnale, rilascio di neurotrasmettitori o l'imaging del calcio. Con colture primarie di DRG, gli scienziati possono coltura neuroni DRG dissociati per monitorare i cambiamenti biochimici nella singola o più celle, superando molti dei limiti connessi con esperimenti in vivo . Rispetto al commercialmente disponibili linee di cellule di ibridoma DRG o immortalizzate linee neuronali DRG, composizione e le proprietà delle cellule primarie sono molto più simili ai neuroni sensoriali nel tessuto. Tuttavia, a causa del numero limitato di cellule coltivate primarie DRG che possono essere isolate da un singolo animale, è difficile effettuare gli schermi ad alta produttività per droga studi di targeting. Nell'articolo attuale, sono descritte le procedure per la raccolta di DRG e cultura. Inoltre, dimostriamo che il trattamento delle cellule coltivate di DRG con un agonista del recettore di neuropeptide FF tipo 2 (NPFFR2) per indurre il rilascio di neurotrasmettitori del peptide (peptide correlato al gene della calcitonina (CRGP) e sostanza P (SP)).

Neuroni DRG lombari del ratto, coltivati in una piastra a 24 pozzetti, sono stati coltivati in terreno di coltura con ulteriori Ara-C per inibire la proliferazione delle cellule gliali e NGF per sostenere la crescita neuronale. La morfologia di vivere cellule DRG è stata osservata. Come mostrato nella Figura 3, il corpo cellulare di un singolo neurone era attaccato sul fondo di un piatto al giorno 1 e selezionato per l'osservazione. Crescita dell'assone è s...

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Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Colture primarie di radice dorsale (DRG) i gangli sono frequentemente utilizzati per studiare funzioni fisiologiche o eventi relativi alla patologia nei neuroni sensoriali. Qui, noi dimostrare l'uso di colture di DRG lombare per rilevare il rilascio dei neurotrasmettitori dopo tipo del ricevitore di neuropeptide FF 2 stimolazione con un agonista selettivo.

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sensoriale, come la nocicezione periferica. Il vantaggio principale di questo tecnico è che indagare il meccanismo cellulare dei neuroni sensoriali con il modello che più simula alle condizioni fisiologiche. Raccogli i gangli della radice dorsale lombare dal tronco di un topo di due o tre settimane.Inizia facendo due tagli lungo i lati della colonna vertebrale e un taglio laterale per segnare l'estensione rostrale della colonna lombare. Quindi, utilizzare le forcep di taglio osseo per rimuovere i muscoli dorsali della colonna vertebrale. Quindi, rimuovere la porzione dorsale delle vertebre ed esporre il midollo spinale.Quindi utilizzare forbici di dissezione e forcep per rimuovere il midollo spinale. Identificare il DRG lombare contando le vertebre dall'ultima costola. Questo diagramma mostra le posizioni delle vertebre.Utilizzare micro forbici per raccogliere il DRG lombare bilaterale 12 da L1 a L6. Rimuovere eventuali fibre neuronali attaccate per migliorare la purezza della coltura. Trasferire ogni DRG lombare in un piatto di coltura di 35 millimetri contenente due millilitri di mezzo privo di siero freddo ghiacciato. Trasferire il piatto da 35 millimetri contenente DRG in una cappa laminare e lavare il DRG con mezzo privo di siero tre volte con pipetta.Utilizzare pinzette sterili per spostare le DRAG in un nuovo piatto di coltura di 35 millimetri contenente due millilitri di collagenasi sterile di tipo 1A. Posizionare il tessuto nella soluzione di collagenasi nell'incubatrice di coltura tissutale di 37 gradi Celsius per 30 minuti per iniziare la dissociazione delle cellule. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di collagenasi e lavare il DRG tre volte in due millilitri della soluzione salina bilanciata di Hank.Successivamente, aggiungere due millilitri di EDTA di tripsidenza prebellica dello 0,05% al piatto e digerire il DRG nell'incubatore per 30 minuti come prima. Dopo la digestione, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire i due millilitri di soluzione contenente DRG in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Il DRG potrebbe attenersi alla pipetta di vetro, quindi questo passaggio deve essere eseguito con cura.La perdita effettiva può essere evitata mantenendo la soluzione contenente DRG nell'estremità cono della pipetta di vetro e trasferendo la soluzione nel tubo di centrifuga lentamente ma senza pause. Quindi, centrifugare la soluzione a 290 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e aggiungere altri due millilitri di mezzo privo di siero per rimescolare il DRG.Ripetere il lavaggio due volte, utilizzando due millilitri di mezzo di coltura prebellico per rimospendare il tessuto dopo la centrifugazione finale. Utilizzare la pipetta lucida a fiamma sterile preparata in precedenza per triturare manualmente il DRG circa 60 volte. Successivamente, rimuovere una piastra di 24 pozzetti rivestita in poli-L-lisina contenente un millilitro di mezzo di coltura per pozzo dall'incubatore di CO2.Aspirare il mezzo di coltura incubato dal piatto. Seminare le cellule DRG da un ratto in quattro dei pozzi. Questo dà una densità di semina di circa 500.000 cellule per pozzo.Il giorno seguente, sostituire il mezzo di coltura con mezzo integrato con AraC micromolare e 100 nanogrammi per millilitro NGF. Il terzo giorno dopo la placcatura cellulare, cambiare il mezzo a 0,5 millilitri di mezzo senza siero prebellificato e incubare per un'ora. Durante l'incubazione, aggiungere 50 millimolare di siRNA in un microlitro di acqua priva di RNasi a 12,5 microlitri di mezzo privo di siero per trasfezione.Quindi pipettare 2,5 microlitri di reagente di trasfezione in 10 microlitri di mezzo privo di siero per ogni trasfezione. Mescolare entrambe le soluzioni con pipetta e incubare questa soluzione di trasfezione mista per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, aggiungere la soluzione di trasfezione nei pozzali della piastra da 24 pozzi contenente DRG e mescolare tremando delicatamente.Dopo un'incubazione di sei ore, aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di coltura con 20%FBS, 10 micromolare AraC e 100 nanogrammi per millilitro NGF in ogni pozzo di cellule. Infine, incubare il DRG in un incubatore di CO2 di 37 gradi Celsius per altre 66 ore. Il sesto giorno dopo la placcatura e 72 ore dopo la trasfezione del siRNA, cambiare il mezzo di coltura in 200 microlitri di mezzo privo di siero.Dopo un'incubazione di 30 minuti, aggiungere un microlitro della sostanza chimica di stimolazione e mescolare delicatamente con la pipettazione. L'agonista NPFFR2, il dNPA e il veicolo corrispondente vengono utilizzati qui. Dopo aver incubato per il periodo richiesto, raccogliere il mezzo di coltura dal piatto di coltura e centrifugare a 5000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali impurità sospese.Raccogliere il supernatante dalla centrifugazione e diluire con soluzione salina tamponata con fosfato in base alle esigenze. Saggio i livelli di neurotrasmettitori con kit di immunoanalisi enzimatici disponibili in commercio. Il primo giorno, il corpo cellulare di un singolo neurone indicato dalla freccia è stato attaccato sul fondo di un piatto.È presente anche una cella gliale indicata da una punta di freccia. Le cellule gliali hanno duplicato ed esteso i processi per circondare il corpo cellulare del neurone sensoriale il secondo giorno, un processo che è stato ancora più prominente il terzo giorno. In un'altra cultura, la proteina CGRP è stata macchiata per rivelare la forma dei neuroni.La colorazione delle proteine CGRP appare nel citoplasma e negli assoni dei neuroni sensoriali. Le morfologie nucleari dei neuroni e delle cellule gliali sono distinte se macchiate con DAPI. I neuroni hanno un nucleo più grande e arrotondato rispetto alle cellule gliali.In confronto, i nuclei di glial sono di forma più ovale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza se viene eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare e culturare il ganglio della radice dorsale e usarlo come strumento per indagare le funzioni fisiologiche sottostanti.Non dimenticare che lavorare con le celle primarie può essere molto più difficile che lavorare con le normali linee cellulari ed essere delicati è sempre il modo migliore quando si esegue questa procedura.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Ricerca

Neuroscienze

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...